專利名稱：T細(xì)胞受體cdr3的序列與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷及治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明涉及T細(xì)胞特異性受體CDR3序列與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷及治療方法。
背景技術(shù)：
位于成熟T淋巴細(xì)胞表面的抗原識(shí)別受體(T細(xì)胞抗原受體或TCRs)具有一種與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相類似的結(jié)構(gòu)。因此，它們含有α和β糖蛋白鏈或γ與δ糖蛋白鏈的異源二聚體結(jié)構(gòu)。
T細(xì)胞受體必須能夠反映抗原決定簇極大的多樣性。這可以通過編碼T細(xì)胞受體不同結(jié)構(gòu)區(qū)的不同非連續(xù)基因片段的基因重組而達(dá)到。因此，基因包含可變區(qū)片斷(Variable segment，V區(qū)片斷)，多樣區(qū)片斷(diversity segment，D區(qū)片斷)，連接區(qū)片斷(junctionsegment，J區(qū)片斷)和恒定區(qū)片斷(constant segment，C區(qū)片斷)。在T細(xì)胞分化期間，β與δ基因座的V，D，J區(qū)片段與α、β基因座的V、J區(qū)片段通過重組產(chǎn)生了特異的基因。這些特異性重組與雙鏈配對(duì)一起產(chǎn)生了重組多樣性。這種多樣性被另外兩個(gè)機(jī)制高度放大了，他們分別是V-D-J或V-J片段的非精確重組與位于N區(qū)的核酸疊加。編碼T細(xì)胞受體(TCR)和鏈的基因分別由V，J和C與V，J，D和C區(qū)片段的重組產(chǎn)生。
在其編碼區(qū)序列相似性的基礎(chǔ)上，有超過70種V與V片段具有自己的分子特征并且分別地被分成29和25個(gè)亞家族。這些不同層次的TCR多樣性產(chǎn)生了巨大的及不同的T細(xì)胞(T cell repertoire)，以適應(yīng)結(jié)合到MHC分子上短肽的多樣性。在V(D)J結(jié)合區(qū)內(nèi)，高度可變的互補(bǔ)決定區(qū)-3(complementary determining region 3，CDR3)被認(rèn)為是與抗原肽直接結(jié)合的位點(diǎn)。TCR多肽特征是準(zhǔn)確分析T細(xì)胞反應(yīng)的一種方式。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的病理表現(xiàn)為外關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，T細(xì)胞被認(rèn)為在其發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。這一觀點(diǎn)被以下證據(jù)所支持在高加索(Caucasian)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織中發(fā)現(xiàn)與MHC II基因具密切關(guān)聯(lián)的Th1炎癥因子細(xì)胞的明顯浸潤及聚集，其中包括DR4(基因型B1*0404和DRB1*0401)與DQ(DQB1*0302和DQB1*0301)。更進(jìn)一步的支持證據(jù)包括在患者關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)支持T細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子的環(huán)境改變，以及浸潤性T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。但是，在類風(fēng)濕病患滑膜中的浸潤性T細(xì)胞的抗原特異性是未知的。在RA患者中，基于T細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性，幾種自身抗原包括骨II型膠原，熱休克蛋白和其它的抗原相信與RA有關(guān)。微生物的抗原，諸如分支桿菌抗原和葡萄球菌超抗原，也可能促進(jìn)RA中的T細(xì)胞激活反應(yīng)。然而，仍沒有證據(jù)證明T細(xì)胞與這些抗原的反應(yīng)是與RA臨床診斷相關(guān)的。
在缺乏引發(fā)的RA性抗原下，人們已經(jīng)試圖分析從RA患者關(guān)節(jié)滑膜液或組織提取的浸潤性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)構(gòu)與特性，期望與類風(fēng)濕病有關(guān)的T細(xì)胞的共同TCR結(jié)構(gòu)或者特征克隆型能夠?qū)櫺訲細(xì)胞如何在滑液中激活和永存的機(jī)制提供更好的解釋，從而可能提出全新的治療策略。當(dāng)T細(xì)胞受體類型受個(gè)體的遺傳背景和對(duì)自身或者環(huán)境的抗原的影響時(shí)，與MHC II類分子相似的抗原驅(qū)動(dòng)的刺激作用導(dǎo)致利用普通的V-D-J片斷的T細(xì)胞克隆擴(kuò)增。另一方面，被超抗原(super antigen)刺激作用誘導(dǎo)的T細(xì)胞激活具有不同D-J片斷的TCR BV基因家族的多克隆擴(kuò)增特征。因此，描繪BV基因分布模式與類風(fēng)濕病的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的結(jié)構(gòu)特征是重要的。
對(duì)高加索(Caucasian)RA患者的許多研究表明源自滑液(一些病例中來源于滑膜)T細(xì)胞的TCR中BV基因的使用傾向于某些特定的BV基因，包括BV14，BV17以及一些其它的基因。對(duì)超表達(dá)BV基因的CDR3的分析中發(fā)現(xiàn)某些克隆型僅存在于類風(fēng)濕患者的滑膜組織中而不是外周T細(xì)胞中，這表明T細(xì)胞在受染關(guān)節(jié)中進(jìn)行了克隆增生。但是，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)RA患者滑模液及組織中浸潤性T細(xì)胞的克隆型和TCR BV基因的使用是相對(duì)異源的，這使使用常規(guī)的或者半定量PCR進(jìn)行BV基因的分析變得復(fù)雜了。這可能歸因于在不同的研究中高表達(dá)BV基因和類風(fēng)濕滑液中T細(xì)胞CDR3結(jié)構(gòu)特征的檢測(cè)的明顯變化。此外，在RA中見到的浸潤性T細(xì)胞多樣的克隆型顯著增加了識(shí)別共同的CDR3結(jié)構(gòu)特征的困難。為了分析目標(biāo)克隆型的特征，發(fā)現(xiàn)的RA滑膜典型的TCR轉(zhuǎn)錄物按大小排列有多個(gè)峰，再乘以BV和BJ基因的數(shù)目(25個(gè)BV基因和13BJ基因)時(shí)，每個(gè)樣品需要成百上千次的測(cè)量。
美國專利No.6,159,470揭示了一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法在具有Vβ17T細(xì)胞的人類個(gè)體中使用有效劑量的由Vβ17特異激活的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖抑制劑來殺滅或抑制T細(xì)胞增殖，該方法中的藥物是一種抗體。
美國專利No.5,985,552提出了一種診斷或者預(yù)測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎個(gè)體敏感性的方法。選擇性的檢測(cè)來自T細(xì)胞個(gè)體的T細(xì)胞受體表面上Vβ14或者Vβ17的水平，通過與正常個(gè)體的水平相比較，可以指示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或?qū)ζ涿舾行浴?br> 美國專利No.6,207,645提出了一種在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中引發(fā)免疫反應(yīng)的方法。將含有連接編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ3，14或17的多肽或片段的促進(jìn)劑的質(zhì)粒直接注入該個(gè)體的肌肉組織，在該核酸序列表達(dá)到一定濃度時(shí)就可以在個(gè)體中引發(fā)針對(duì)該核酸所編碼的多肽的免疫反應(yīng)。
美國專利(No.6,221,352)提出一種防止表達(dá)Vβ14T細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)增殖的方法。該方法是給患者注射或服用有效劑量的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖抑制劑，其中含有可以選擇性的結(jié)合由T細(xì)胞表達(dá)的Vβ14的抗體。
Mima等報(bào)道他們發(fā)現(xiàn)了在Vβ14+T細(xì)胞中占支配地位的CDR3序列CASS-PRERAT-YEQ，該序列源自兩個(gè)不同的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)。與類風(fēng)濕相關(guān)的共同TCR結(jié)構(gòu)特征或T細(xì)胞特異的克隆型也許能對(duì)浸潤性T細(xì)胞如何在滑液中激活和永存的機(jī)制提供更好的解釋，從而可能提出全新的治療策略。因此，識(shí)別與類風(fēng)濕患者相關(guān)的TCR序列的特點(diǎn)和對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷和治療的有效的方法是長期的需要。本發(fā)明就是在技術(shù)上滿足這種長期的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于識(shí)別與類風(fēng)濕患者相關(guān)的TCR序列的特點(diǎn)和對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的有效方法及應(yīng)用。
本發(fā)明指一種已經(jīng)充分純化和分離的DNA片段，該DNA片段包含的核酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，它們分別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體的Vβ14家族(BV14基因)和Vβ16家族(BV16基因)的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的一部分。
本發(fā)明指一種疫苗，其中至少一種DNA片段來自SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2的片段。
本發(fā)明也指一種充分純化和分離的肽，其氨基酸序列來自于由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5組成的組中，這些氨基酸序列源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈BV14(SEQ ID NO.3與SLS)或BV16(SEQ ID NO.4，SQD，SLL與SEQ ID NO.5)基因的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。
本發(fā)明也指針對(duì)上述肽的一種抗體。
本發(fā)明也指向一種疫苗，其中包括至少一種氨基酸序列來自于T細(xì)胞受體基因的CDR3的肽，該T細(xì)胞受體基因由來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的BV14和BV16的組中選擇。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。該方法包括分別從可疑個(gè)體和正常個(gè)體獲取組織樣品；測(cè)量該樣品中T細(xì)胞受體的BV14和/或BV16的表達(dá)水平，并比較可疑個(gè)體和正常個(gè)體的表達(dá)水平。如果BV14和/或者BV16在可疑個(gè)體中的表達(dá)水平比正常個(gè)體中的表達(dá)水平足夠高，那就表明該個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種可用于中國人群檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。該方法包括分別從可疑個(gè)體和正常個(gè)體取組織樣品；測(cè)量該樣品中T細(xì)胞受體的BV16的表達(dá)水平，并比較可疑個(gè)體和正常個(gè)體的表達(dá)水平。如果BV16在可疑個(gè)體中的表達(dá)水平比正常個(gè)體中的表達(dá)水平足夠高，那就表明來自中國人群的該個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)方法。該方法包括合成與來自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所組成的組中的DNA片段互補(bǔ)的探針；從可疑個(gè)體取樣；將探針與組織樣本混合。在本法中陽性的雜交信號(hào)提示可疑個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明指向一種檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。這方法包括合成一種針對(duì)多肽的抗體，該多肽的氨基酸序列來自于SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL與SEQ ID NO.5組成的組中；從可疑個(gè)體中取組織樣品；將該抗體與組織樣品混合。在本法中陽性的信號(hào)提示可疑個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明更進(jìn)一步用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，該方法是給患者注射或服用有效劑量的免疫原性T細(xì)胞受體肽從而引發(fā)免疫反應(yīng)。這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5組成的組中。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法是給患者注射或服用有效劑量的針對(duì)多肽的抗體，這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5組成的組中。
本發(fā)明進(jìn)一步指向針對(duì)引發(fā)所編碼肽的免疫反應(yīng)，可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該方法包括給個(gè)體注射或服用含有促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該促進(jìn)劑連接了DNA片段，該片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ16的肽的核酸序列，或者是其中的一部分。在本方法中，該DNA片段表達(dá)到一定豐度水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的目的。
本發(fā)明指向一種引發(fā)針對(duì)所述編碼肽的免疫反應(yīng)，可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該方法包括給予個(gè)體含有連接了DNA片段的促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ14的肽的核酸序列，或者是其中的一部分。在本方法中，該核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。進(jìn)入到人體后，該DNA片段表達(dá)到一定豐度水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的目的。
本發(fā)明進(jìn)一步指向一種可以抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的病原性T細(xì)胞反應(yīng)的藥物成分。該成分包括源自單鏈T細(xì)胞受體Vβ14或Vβ16的有效免疫劑量的多肽或多肽的一部分以及制藥學(xué)上可接受的載體。
結(jié)合隨后附圖對(duì)本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)的詳盡描述，本發(fā)明上述的及其它的優(yōu)勢(shì)在技術(shù)上是很明顯的。
以下附圖構(gòu)成了本發(fā)明說明的一部分，并對(duì)本發(fā)明某些方面作進(jìn)一步證明?，F(xiàn)在說明的部分被包括到更進(jìn)一步顯示現(xiàn)在發(fā)明的一定方面。通過參考一張或更多這些圖片并結(jié)合此處詳盡的描述也許可以更好的理解本發(fā)明。


圖1A顯示，用一組25 BV家族和BC基因特異的寡核苷酸引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖1B為分離自四個(gè)健康外周血單核細(xì)胞并在具有或缺乏中毒性休克毒素(toxic shock syndrome toxin)的條件下培養(yǎng)的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果。
圖2展示了在滑液損傷組織(ST)樣品中BV偏向性的表達(dá)，非常明顯的對(duì)BV14(平均的表達(dá)水平27％)，BV16(平均的表達(dá)水平31％)和BV20(17％)較少的表達(dá)。
圖3顯示，當(dāng)使用一對(duì)特異的5’BV14-3’BC引物分析位于BV14-BJ-3’BC之間的序列區(qū)時(shí)的BV14所展示的滑液和滑模損傷組織中異源CDR3的長度圖。
圖4顯示當(dāng)使用一對(duì)特異的5’BV16-3’BC引物分析位于BV16-BJ-3’BC之間的序列區(qū)時(shí)的BV16所展示的滑液和滑液損傷組織中異源CDR3的長度圖。
圖5顯示分別使用BV14或BV16的引物和一組13個(gè)個(gè)體BJ基因特異的引物時(shí)的BV14和BV16的CDR3的免疫電鏡轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果。
圖6顯示典型的克隆型模式，具有與類似CDR3的同樣的BV和BJ結(jié)合性。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳描。
為有助于理解本發(fā)明，首先提出如下術(shù)語的定義。
“PCR”是聚合酶鏈反應(yīng)，例如，如美國專利No.4,683,202所述，PCR是一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，其中有選擇性的寡核苷酸或引物在聚合試劑(如聚合酶)和四種三磷酸核苷酸存在時(shí)與核酸模板雜交，擴(kuò)增產(chǎn)物就可以從引物處形成。然后這些產(chǎn)物被變性并作為循環(huán)反應(yīng)中的模板，這樣就可以擴(kuò)增足夠數(shù)量的現(xiàn)有核酸以便于隨后的檢測(cè)。有許多種PCR技術(shù)可以使用，而且根據(jù)本發(fā)明也許會(huì)用到這些方法。
“引物”是一段寡核苷酸，不論天然的還是合成的，與模板分子上特定的DNA序列互補(bǔ)，是DNA合成反應(yīng)的起始點(diǎn)。
“超抗原(superantigen)”是可以優(yōu)先結(jié)合到T細(xì)胞受體β鏈特異位點(diǎn)并刺激T細(xì)胞高效增殖的抗原或其片段。超抗原通過結(jié)合特異的Vβs激活T細(xì)胞。超抗原結(jié)合到各種TCRs上的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)從TCRs中恒定高度可變互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)中分離出來。這些CDRs代表了曾被認(rèn)為結(jié)合常規(guī)抗原的區(qū)域，常規(guī)抗原是與MHC形成復(fù)合物的。
″Vβ14″指的是特定的人T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)。Vβ14的氨基酸序列如下MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASS(SEQ ID NO.6)。
″Vβ16″指的是特定的人T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)。Vβ16的氨基酸序列如下IEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWYRRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCASS(SEQ ID NO.7)。
“片段”指TCRs中具有免疫效應(yīng)的氨基酸序列。該術(shù)語規(guī)定為包括連接起來的片段或者與附加的序列或其一半結(jié)合的片段，例如，多肽與其它氨基酸序列相連接或連到一個(gè)載體上。
“互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)”也被稱之為V(D)J區(qū)。由于V，D和J區(qū)基因的重組先于T細(xì)胞的成熟，跨越這些區(qū)的氨基酸序列對(duì)每一T細(xì)胞及其克隆實(shí)際上是唯一的。由于相應(yīng)于此區(qū)的多肽引發(fā)的T細(xì)胞的免疫性預(yù)期可能對(duì)特定抗原具有高度特異性，所以CDR3或其片段在本發(fā)明作為疫苗使用。
本發(fā)明檢測(cè)一群中國RA患者的滑液物質(zhì)的浸潤性T細(xì)胞的BV基因的使用模式，以確定BV基因分布與HLA的潛在聯(lián)系，這些中國患者的人類白細(xì)胞抗原(HLA)與高加索(Caucasian)患者的起源背景不同。在通過源自不同RA患者滑液高表達(dá)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物中，識(shí)別到共同克隆型和共同CDR3結(jié)構(gòu)特征。分析是通過進(jìn)行滑液物質(zhì)和患者血液的TCRs轉(zhuǎn)錄物的體外分析所得，因此不需要體內(nèi)培養(yǎng)。那樣可能會(huì)引起偏差?，F(xiàn)在認(rèn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的浸潤性T細(xì)胞是由上文中提到的RA相關(guān)的DR或DQ分子等自身或微生物抗原驅(qū)動(dòng)形成的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞在不同的個(gè)體中展示了共同的TCR結(jié)構(gòu)特征。主要的方法是通過定量實(shí)時(shí)PCR首先確定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的高表達(dá)的BV基因。這些分析在來自于確診的RA患者組的外周血(PB)、滑液(SF)和滑液損傷組織(ST)中進(jìn)行，同時(shí)設(shè)一個(gè)骨關(guān)節(jié)炎的對(duì)照組。系列CDR3長度分析在生成5’BV-3’BC區(qū)范圍利用免疫電鏡進(jìn)行分析。個(gè)別V-D-J區(qū)內(nèi)的多峰CDR3長度用BV和BJ特異性引物進(jìn)行進(jìn)一步分析以識(shí)別使用同一帶有類似CDR3長度的BV和BJ基因的共同克隆型。這些克隆型通過DNA克隆和DNA測(cè)序來進(jìn)行分析。
發(fā)現(xiàn)源自中國RA患者的滑液損傷組織的浸潤性T細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的對(duì)BV14、BV16和更小范圍的BV20的BV基因傾向性，并且當(dāng)高表達(dá)的BV16在滑液中出現(xiàn)時(shí)，在滑膜中見到的BV14傾向的模式在配對(duì)的滑液中沒有出現(xiàn)。這一結(jié)果表明RA滑液中BV14和BV16T細(xì)胞是選擇性激活和積累的。雖然以前BV14基因的超表達(dá)在來源于RA滑液和滑膜的T細(xì)胞中被報(bào)道過，但是BV16基因的高表達(dá)在來源于RA滑液和滑膜的T細(xì)胞中以前并沒有被報(bào)道。BV17和其它BV的傾向性在中國RA患者中并沒有像高加索患者中所描述的那樣被檢測(cè)到。這些觀測(cè)資料表明，當(dāng)BV14的偏移在中國患者和高加索患者中相同時(shí)，BV16的高表達(dá)和缺乏BV17和其它BV基因的偏移可能是中國RA患者的特性。這些在BV基因偏好上的差異也許可以歸因于遺傳背景(如HLA基因)地理意義上的環(huán)境因素。在這一方面，需要特別注意的是這群中國RA患者與DRB1*0405(43％)相關(guān)，這與高加索患者密切相關(guān)的另外兩個(gè)基因型DR4(DRB1*0404和DRB1*0401)是不同的。本研究更進(jìn)一步揭示了RA患者的滑液T細(xì)胞中BV16而不是BV14的高表達(dá)與DRB1*0405相互關(guān)系的趨勢(shì)。在對(duì)照中，沒有發(fā)現(xiàn)BV16和BV14的高表達(dá)與其它使用DR和DQ基因型的相互關(guān)系。這些結(jié)果支持HLA基因型和個(gè)體的種族背景也許會(huì)影響RA患者滑液浸潤性T細(xì)胞的BV偏好性的觀點(diǎn)，并且為本研究中這一中國RA人群的BV16的高表達(dá)特性提供了一個(gè)解釋。
強(qiáng)調(diào)滑液浸潤性T細(xì)胞BV14和BV16的超表達(dá)是否是由于自身抗原的刺激或由傳染性試劑相關(guān)的超抗原造成是重要的。BV基因偏好的克隆性分析也許可以提供解釋。典型的T細(xì)胞抗原性刺激會(huì)導(dǎo)致寡克隆，向反超抗原誘導(dǎo)的BV基因偏好與多克隆增殖相關(guān)。這可以通過V-D-J連接區(qū)的免疫電鏡進(jìn)行區(qū)分。本研究中，高表達(dá)的BV14和BV16的克隆型似乎相對(duì)不同，一些受損組織表現(xiàn)出高度限制性寡克隆模式，而在其它組織則展示出多克隆的形式。這一結(jié)果支持在一些病例中BV的高表達(dá)是由自身抗原驅(qū)動(dòng)的這一假設(shè)。然而，在其它一些病例中，很難區(qū)別是由自身抗原還是由超抗原驅(qū)動(dòng)的，因?yàn)樵谶@兩種情況下都會(huì)導(dǎo)致V-D-J區(qū)的克隆型向多克隆方向轉(zhuǎn)移。在該疾病的后期或慢性期，可能存在浸潤性T細(xì)胞的克隆型模糊并且趨向多樣性，原因是浸潤性T細(xì)胞的異質(zhì)性通過非特異的機(jī)制恢復(fù)了，這種機(jī)制包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所產(chǎn)生的化學(xué)因子或細(xì)胞因子。
BV14或BV16的超表達(dá)可以通過定量(real-time)PCR的方法來確定，如待審查的專利60/439,096中所述的應(yīng)用，在此作為引例。定量PCR的方法使用如表1所示，特異的促進(jìn)(forward)和反向(reverse)套式寡核苷酸引物BV1-BV25(SEQ ID NOs8-57)和BC(SEQ ID NOs58和59)，上面的幾套引物以同樣的效率擴(kuò)增不同的TCRBV基因和TCRBC基因，這樣在PCR擴(kuò)增后原始樣本可以被精確定量。表1應(yīng)用于定量PCR分析的25對(duì)TCRBV基因和TCRBC基因特異的引物基因 序列5’→3’ Amplicon(bp)BV1AAGCACCTGATCACAGCAACT(forward)(SEQ ID NO.8)209TAGTTCAGAGTGCAAGTCAGG(reverse)(SEQ ID NO.9)BV2GGTTATCTGTAAGAGTGGAACCT(SEQ ID NO.10) 229AGGATGGGCACTGGTCACTGT(SEQ ID NO.11)BV3TCGAGATATCTAGTCAAAAGGACG(SEQ ID NO.12) 228GGTGCTGGCGGACTCCAGAAT(SEQ ID NO.13)BV4AAGCAGGGATATCTGTCAACGT(SEQID NO.14)235TTCAGGGCTCATGTTGCTCAC(SEQ ID NO.15)BV5GATCAAAACGAGAGGACAGCA(SEQ ID NO.16)217
AGCACCAAGGCGCTCACATTCA(SEQ ID NO.17)BV6CTCAGGTGTGATCCAATTTCA(SEQ ID NO.18)195CCCCCGCTCTGTGCGCTGGAT(SEQ ID NO.19)BV7CATGGGAATGACAAATAAGAAGTCT(SEQ ID NO.20)214TGGCTGCAGGGCGTGTAGGTG(SEQ ID NO.21)BV8CCCCGCCATGAGGTGACAGAG(SEQ ID NO.22)239GAGTCCCTGGGTTCTGAGGGC(SEQ ID NO.23)BV9CCAAAATACCTGGTCACACAG(SEQ ID NO.24)207CCAGGGAATTGATGTGAAGATT(SEQ ID NO.25)BV10 ACCTAGACTTCTGGTCAAAGCA(SEQ ID NO.26) 223GGACTGGATCTCCAAGGTACA(SEQ ID NO.27)BV11 TTATAGGGACAGGAAAGAAGATC(SEQ ID NO.28) 224ATGTGAGGGCCTGGCAGACTC(SEQ ID NO.29)BV12 CAAGACACAAGATCACAGAGACA(SEQ ID NO.30) 224GGCAGCAGACTCCAGAGTGAG(SEQ ID NO.31)BV13 TGAAGACAGGACAGAGCATGACA(SEQ ID NO.32) 227CACAGATGTCTGGGAGGGAGC(SEQ ID NO.33)BV14 ACCCAAGATACCTCATCACAGTG(SEQ ID NO.34) 242AGAGGTCTGGTTGGGGCTGGG(SEQ ID NO.35)BV15 TCACAAAGACAGGAAAGAGGATT(SEQ ID NO.36) 215GGGGATGGCAGACTCTAGGGA(SEQ ID NO.37)BV16 GTTCCCCAGCCACAGCGTAATA(SEQ ID NO.38) 235CAGTTCTGCAGGCTGCACCTT(SEQ ID NO.39)BV17 GTCCCCAAAGTACCTGTTCAGA(SEQ ID NO.40) 244AGCTGTCGGGTTCTTTTGGGC(SEQ ID NO.41)BV18 AGACACCTGGTCAGGAGGAGG(SEQ ID NO.42)240TGCCGAATCTCCTCGCACTAC(SEQ ID NO.43)BV19 CCAGGACATTTGGTCAAAGGAAAA(SEQ ID NO.44) 246CAGTGCCGTGTCTCCCGGTTC(SEQ ID NO.45)BV20 GACCCTGGTGCAGCCTGTG(SEQ ID NO.46) 223GAGGAGGAGCTTCTTAGAACT(SEQ ID NO.47)BV21 CCCAGATATAAGATTACAGAGAAA(SEQ ID NO.48) 219CTGGATCTTGAGAGTGGAGTC(SEQ ID NO.49)BV22 CACAGATGGGACAGGAAGTGATC(SEQ ID NO.50) 221GTCCTCCAGCTTTGTGGACCG(SEQ ID NO.51)BV23 AAGAGGGAAACAGCCACTCTG(SEQ ID NO.52)207CAGCTCCAAGGAGCTCATGTT(SEQ ID NO.53)BV24 CCAAGATACCAGGTTACCCAGTTT(SEQ ID NO.54) 228CAGGCCTGGTGAGCGGATGTC(SEQ ID NO.55)BV25 AAAACATCTTGTCAGAGGGGAA(SEQ ID NO.56) 238TGAATCCTCAAGCTTCGTAGC(SEQ ID NO.57)TCRBC CAGCGCCCTTGTGTTGATG(SEQ ID NO.58) 121AAGCGCTGGCAAAAGAAGAA(SEQ ID NO.59)本發(fā)明也可識(shí)別類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中代表超表達(dá)的BV14和BV16群的浸潤性T細(xì)胞的特異CDR3序列和共同CDR3序列。如果BV14和BV16的滑液T細(xì)胞被一些于上文中提到的具有相似HLA背景的RA相關(guān)共同的自身抗原所驅(qū)動(dòng)，那不同的RA患者在疾病期間將形成具獨(dú)特的或共同的CDR3結(jié)構(gòu)特征的T細(xì)胞群。但由于高表達(dá)的BV14和BV16的V-D-J區(qū)是相對(duì)多樣的，因此這種努力是非常困難的。本發(fā)明首先識(shí)別根據(jù)高表達(dá)BV14和BV16的普通和支配V-D-J區(qū)分組的相似克隆型。包含這些普通克隆型的轉(zhuǎn)錄物隨后被克隆和分析CDR3序列。該研究表明在來源于不同RA患者的滑液損傷中，這些普通的克隆型具有同樣的V-D-J序列。值得注意的是，在兩個(gè)不同的RA損傷患者中檢測(cè)到兩個(gè)一樣的CDR3序列。這一結(jié)果讓人想起在T細(xì)胞識(shí)別髓磷酯堿性蛋白(MBP)的類似結(jié)果，髓磷酯堿性蛋白是多發(fā)性硬化病的候選自身抗原。其次，高表達(dá)BV14+和BV16+的序列分析表明在不同RA患者的滑液T細(xì)胞中，多數(shù)CDR3序列是共有的。再次，這些結(jié)果支持高表達(dá)BV14和BV16的CDR3不是隨機(jī)產(chǎn)生的，而是由于T細(xì)胞對(duì)共同但還未確定的某種RA相關(guān)的自身抗原的反應(yīng)而產(chǎn)生的。因?yàn)槊庖唠婄R的克隆型分析僅僅能選擇性的檢測(cè)樣品大于20％的表達(dá)水平，而DNA克隆或測(cè)序僅僅能選擇性的檢測(cè)有代表性的克隆型，使用相應(yīng)于識(shí)別CDR3序列的特異引物的進(jìn)一步研究也許有助于評(píng)價(jià)中國大量RA人群滑液物質(zhì)中CDR3結(jié)構(gòu)特征的頻度。
本發(fā)明指向充分純化和分離的包含如SEQ ID NO.1或SEQ TD NO.2所示的核酸序列的DNA片段，它們分別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體的Vβ14家族(BV14基因)和V16家族(BV16基因)的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的一部分。
本發(fā)明指向一種疫苗，該疫苗包含至少一種來自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，更可取的是，該DNA片段的濃度大約在10μg/ml到10mg/ml之間。
本發(fā)明指向一種完全純化和分離的多肽，該多肽的氨基酸序列來自包括SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和 SEQ ID NO.5在內(nèi)的組中，這些序列分別源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈CDR3的BV14(SEQ ID NO.3和SLS)或BV16(SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5)基因。也包括對(duì)這些肽的一種抗體。
本發(fā)明指向一種疫苗，該疫苗至少包含一種肽，該肽的氨基酸序列源自RA患者的個(gè)體T細(xì)胞受體的CDR3基因，選自BV14和BV16組成的組中。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。該方法包括分別從可疑個(gè)體和正常個(gè)體獲取組織樣品；測(cè)量該樣品中T細(xì)胞受體的BV14和/或BV16的表達(dá)水平，并比較可疑個(gè)體和正常個(gè)體的表達(dá)水平。如果BV14和/或者BV16在可疑個(gè)體中的表達(dá)水平比正常個(gè)體中的表達(dá)水平足夠高，那就表明該個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。更適宜的是，該組織樣品可以取自滑液、滑液損傷組織或外周血。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種可用于中國人群檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。該方法包括分別從可疑個(gè)體和正常個(gè)體取組織樣品；測(cè)量該樣品中T細(xì)胞受體的BV16的表達(dá)水平，并比較可疑個(gè)體和正常個(gè)體的表達(dá)水平。如果BV16在可疑個(gè)體中的表達(dá)水平比正常個(gè)體中的表達(dá)水平足夠高，那就表明來自中國人群的該個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。更適宜的是，該組織樣品可以取自滑液、滑液損傷組織或外周血。由于發(fā)現(xiàn)中國的類風(fēng)濕病患者與基因型HLA DRB1*0405相關(guān)，因此，本方法更適于檢測(cè)HLA DRB1*0405個(gè)體的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)方法。該方法包括合成與來自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所組成的組中的DNA片段互補(bǔ)的探針；從可疑個(gè)體取樣；將探針與組織樣本混合。在本法中陽性的雜交信號(hào)提示可疑個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該組織樣品可以取自滑液、滑液損傷組織或外周血。
本發(fā)明指向一種檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。這方法包括合成一種針對(duì)多肽的抗體，該多肽的氨基酸序列來自于SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL與SEQ ID NO.5組成的組中；從可疑個(gè)體中取組織樣品；將該抗體與組織樣品混合。在本法中陽性的信號(hào)提示可疑個(gè)體可能患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該組織樣品可以取自滑液、滑液損傷組織或外周血。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法是給患者注射或服用有效劑量的免疫原性T細(xì)胞受體肽從而引發(fā)免疫反應(yīng)。這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5.組成的組中。
為了加強(qiáng)該多肽的免疫原性，可以將該多肽配對(duì)或免疫時(shí)使用佐劑。
本發(fā)明更進(jìn)一步指向一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法是給患者注射或服用有效劑量的針對(duì)多肽的抗體，這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5組成的組中。
本發(fā)明進(jìn)一步指向治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。該方法包括給予個(gè)體含有連接了DNA片段促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ16的肽的核酸序列或者是其中的一部分。在本方法中，該DNA片段表達(dá)到一定水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)，進(jìn)而防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生或者治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
更可取的是，核酸序列編碼Vβ16的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)并包含SEQ ID NO.2所示的序列，更適合的是，Vβ16的CDR3包含一種選自SEQ ID NO.4、SQD、SLL和SEQ ID NO.5組中的氨基酸序列。
促進(jìn)劑最好是可誘導(dǎo)的或組成型的。具有代表性的例子包括β肌動(dòng)蛋白促進(jìn)劑、SV40早期和晚期促進(jìn)劑、免疫球蛋白促進(jìn)劑、人類巨細(xì)胞病毒促進(jìn)劑和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs等。
更可取的是，DNA表達(dá)載體的給藥方式可以是皮下、皮內(nèi)、靜脈注射或口服，或更可取的是通過肌肉或脊髓液注射。
本發(fā)明指向一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種方法。該方法包括給個(gè)體注射或服用含有連接了DNA片段的促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ14的肽的核酸序列或者是其中的一部分。在本方法中，該核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。進(jìn)入到人體后，該DNA片段表達(dá)到一定豐度水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)，進(jìn)而防止類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生或者治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
更合適的是，核酸序列編碼的Vβ14的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)包含一種選自從包括SEQ ID NO.3、SLS組中的氨基酸序列。
隨著克隆技術(shù)的最新進(jìn)展，可以有選擇地關(guān)閉基因。治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的一種可能的方法是合成可以特異結(jié)合目標(biāo)基因的反義RNA或DNA分子，這樣就可以中斷表達(dá)基因成為蛋白的精確的分子機(jī)制。通過應(yīng)用上述識(shí)別的如SEQ ID NO.1和/或2所示的寡核苷酸，這種反義技術(shù)也許可以用于治療RA。
本發(fā)明進(jìn)一步指向可以抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的病原性T細(xì)胞反應(yīng)的藥物成分。該成分包括來源于單鏈T細(xì)胞受體Vβ14或Vβ16的有效免疫劑量的多肽或多肽的一部分以及可接受的藥物載體。更可取的是，該多肽的氨基酸序列選自來源于Vβ14或Vβ16的CDR3的SEQ ID NO.3、SLS、SEQ ID NO.4、SQD、SLL和SEQ ID NO.5等。
給出如下例子是為了說明本發(fā)明的各種具體目的，并不意味著對(duì)本發(fā)明任何形式的限制。
實(shí)施例1患者和樣品本研究包括根據(jù)美國風(fēng)濕癥協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)確診患有RA的37名中國患者?；脊顷P(guān)節(jié)炎(OA)的七名患者作為對(duì)照組。包含標(biāo)準(zhǔn)之一是選擇患者的標(biāo)準(zhǔn)是試驗(yàn)前兩個(gè)月內(nèi)未接受含甾類化合物或者其它免疫抑制劑治療。進(jìn)行癥狀治療的患者不被排除在外。外周血單核細(xì)胞從肝素化的樣品中通過Ficoll-Hypaque梯度分離制備。通過離心并洗滌收集來自兩組患者的滑液細(xì)胞。從肝素化的血液樣品以Ficoll-Hypaque梯度制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)。通過離心收集并洗滌取自兩組患者的滑液細(xì)胞，在與本研究不相關(guān)的外科手術(shù)過程中取得來自RA和OA的滑液損傷細(xì)胞。組織樣品切成小片并立即進(jìn)行RNA提取處理。研究方案經(jīng)單位倫理檢查委員會(huì)批準(zhǔn)。
實(shí)施例2RNA提取方案使用TRIZOL RNA分離試劑盒(GIBCOBRL，Carlsbad，CA)從外圍血(PB)滑液(SF)或者滑膜組織(ST)以及試驗(yàn)材料(PB，SF和ST樣品)中提取總RNA。在DEPC處理過的研缽中勻質(zhì)處理50-100mgST，然后于1ml TRIZOL試劑研碎。來自PB和SF的細(xì)胞直接溶解在1ml TRIZOL試劑中，每1ml TRIZOL中加入0.2ml三氯甲烷并混合均勻。根據(jù)生產(chǎn)規(guī)程，離心，加入異丙醇混勻沉淀RNA。
實(shí)施例3HLA基因型分析所有患者的PBMC樣品要進(jìn)行HLA DR和DQ基因型分析。簡要來說就是從經(jīng)過EDTA處理的患者血中提取基因組DNA，并通過特異序列引物的PCR使用高分辨率的SP UniTray(PEL-FREEZE Clinical SSstem，Brown Deer，WI)來確定HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因。擴(kuò)增等位基因的引物組由世界衛(wèi)生組織(WHO)國際命名委員會(huì)命名(http//www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html)，HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因操作板的分析檢測(cè)根據(jù)生產(chǎn)商提供的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。
實(shí)施例4通過定量PCR分析測(cè)定滑液和血液中T細(xì)胞BV基因的方案根據(jù)生產(chǎn)商提供的實(shí)驗(yàn)方案，用TA Cloning_試劑盒(Invitrogen，SanDiego，CA)和One Shot_TOP10 E.coli TOP10結(jié)腸活性細(xì)胞(Invitrogen，San Diego，CA)克隆25個(gè)TCRBV和TCRBC基因片斷。特異BV引物的寡核苷酸如表1所示，在20μl反應(yīng)體系中使用隨機(jī)引物和Superscript II(Invitrogen，Carlsbad，CA)通過RNA合成cDNA。用實(shí)時(shí)定量PCR分析TCR BV的基因表達(dá)。每次反應(yīng)都設(shè)BV-BC擴(kuò)增的內(nèi)部參考對(duì)照和不含cDNA的無模板對(duì)照。在ABI 7000 SequenceDetection System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)的96孔PCR板上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。簡而言之，以一部分cDNA樣品(0.7ul)與25對(duì)特異BV引物和1對(duì)BC引物(終極濃度為0.1mM)分別混合，再與SSBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)一同混合，最終反應(yīng)體積為50μl。反應(yīng)先在50℃的溫度下進(jìn)行2分鐘，然后在95°的溫度下進(jìn)行10分鐘，作為熱啟動(dòng)激活反應(yīng)，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，即在95℃的溫度下進(jìn)行15秒，在60℃的溫度下進(jìn)行1分鐘?；赑CR反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度，可根據(jù)以下公式計(jì)算出個(gè)體BV基因的表達(dá)TCR BVn(％)＝[2-(BVnCT-BC Ct)×100/∑(2-(BV1-25-Ct-BC Ct)×100)]×100.(Ct指的是閾值周期(threshold cycle))。
實(shí)施例5免疫電鏡的分析方法用1ul源自ST樣品的cDNA在如下擴(kuò)增劑中進(jìn)行PCR反應(yīng)5μl 10×PCR緩沖劑(100mM Tris-HCl，pH8.3 and 500mM氯化鉀)，3μl 25mM氯化鎂，1μl 10mM的dNTP混合物，0.5μl的Taq聚合酶(5U/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，20pmol的引物(BV14或BV16促進(jìn)引物和BC引物)。PCR擴(kuò)增在94℃的溫度下經(jīng)過30秒變性反應(yīng)，隨之在57℃的溫度下進(jìn)行30秒復(fù)性反應(yīng)，然后在72℃的溫度下經(jīng)過30秒擴(kuò)展反應(yīng)，反復(fù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。依照修正條約進(jìn)行免疫電鏡分析。用2μlBV14-BC或BV16-BC PCR產(chǎn)物作為模板，以單一內(nèi)部熒光標(biāo)記為每一個(gè)標(biāo)以6FAM(擴(kuò)充)的BC或BJ引物進(jìn)行徑流反應(yīng)(表2)。反應(yīng)的參數(shù)是在94℃的溫度下進(jìn)行30秒變性反應(yīng)，并重復(fù)下列反應(yīng)15個(gè)循環(huán)，94℃溫度下45秒，55℃溫度下45秒，72℃溫度下1分鐘，然后在72℃溫度下進(jìn)行5分鐘的擴(kuò)展步驟。PCR終產(chǎn)物在甲酰胺中經(jīng)過變性反應(yīng)，在Applied Biosystems 3100 Prism中用GeneScan 3.7軟件(Perkin-Elmer，Boston，MA).進(jìn)行分析，標(biāo)記產(chǎn)物用單色電子熒光圖進(jìn)行單獨(dú)分析。對(duì)應(yīng)CDR3長度的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度(RIS)表達(dá)為實(shí)驗(yàn)波峰下的分布區(qū)，這一分布區(qū)被高斯分布值內(nèi)的對(duì)照波峰下的分布區(qū)所分割?；谶@些信號(hào)強(qiáng)度的分布，可選擇特異BJ引物作為CDR3的序列分析。
表2 標(biāo)記反應(yīng)的引物引物 序列5’→3’ 離密碼子(codon)的距離106，(bp)*BC CGA CCT CGG GTG GGA ACA(SEQ ID NO.60)(Cb4)X-BC X-CAC AGC GAC CTC GGG TGG G(SEQ ID NO.61) 73X-BJ1.1X-ACT GTG AGT CTG GTG CCT TGT(SEQ ID NO. 2962)X-BJ1.2X-ACA ACG GTT AAC TTG GTC CCC GAA(SEQ ID 32
NO.63)X-BJ1.3 X-GGT CCT CTA CAA CAG TGA GCC AAC(SEQ ID 40NO.64)X-BJ1.4 X-AAG AGA GAG AGC TGG GTT CCA CTG(SEQ ID 32NO.65)X-BJ1.5 X-GGA GAG TCG AGT TCC ATC A(SEQ ID NO.66) 27X-BJ1.6 X-TGT CAC AGT GAG CCT GGT CCC ATT(SEQ ID 33NO.67)X-BJ2.1 X-CCT GGC CCG AAG AAC TGC TCA(SEQ ID NO. 1468)X-BJ2.2 X-GTC CTC CAG TAC GCT CAG CCT AGA(SEQ ID 39NO.69)X-BJ2.3 X-TGC CTG GGC CAA AAT ACT GCG(SEQ ID NO. 1670)X-BJ2.4 X-TCC CCG CGC CGA AGT ACT GAA(SEQ ID NO. 1671)X-BJ2.5 X-TCG AGC ACC AGG AGC CGC(SEQ ID NO.72) 35X-BJ2.6 X-CTG CTG CCG GCC CCG AAA GTC(SEQ ID NO. 2073)X-BJ2.7 X-TGA CCG TGA GCC TGG TGC CCG(SEQ ID NO. 3174)X代表6FAM。*CDR3區(qū)為95-106殘基以內(nèi)。
實(shí)施例6BV14和BV16轉(zhuǎn)錄物的DNA克隆與序列分析方案以源自ST樣本的BV14和BV16促進(jìn)引物或BC下游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為第二輪特異的未知BJ引物的PCR模板(表2)。第二次PCR產(chǎn)物被克隆至TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用BV14或BV16促進(jìn)引物與一個(gè)相應(yīng)的BJ引物，從每個(gè)樣品克隆挑選15個(gè)克隆體作為克隆PCR。選擇那些經(jīng)過PCR后顯示顯著擴(kuò)增的陽性質(zhì)粒。用QIAPrep mini plasmid kit(Qiagen，Valencia，CA)制備這些樣品的質(zhì)粒DNA，用BV14或BV16促進(jìn)引物對(duì)V-D-J區(qū)加以測(cè)序，以確定CDR3區(qū)的序列。
實(shí)施例7限制性TCR V基因在源自RA患者滑液或損傷組織的T細(xì)胞的使用如例1中所述，該研究包括一組確診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者，并以一組骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者作為對(duì)照組。臨床特征以及HLA DR和DQ的基因型如表3所示。在這組RA中國患者中，DRB1*0405基因型代表大多數(shù)顯性DR4(16/37，43％)，對(duì)比另外兩種DR4基因型，與RA高加索患者具有典型聯(lián)系的DRB1*0401(8％)and DRB1*0404(3％)。另外，DRB1*09012(35％)和三個(gè)DQB1基因型(0301，0303 and 0401)在這組RA患者中也以較高頻率表達(dá)(30％-41％)。
表3.患者的臨床特征和HLA基因型RA OATotal# of patients37 7Age 56±15 64±17Sex(M/F) 11/26 2/5Disease duration(yrs) 9±79±4HLA DRB1*#of total％ #of total％040516/3743 3/74304013/37 80/7-04041/37 30/7-09012 13/3735 5/77108032 6/37 16 1/71412027/37 19 1/71407015/37 14 0/7-15015/37 14 1/71413023/37 80/7-10013/37 80/7-
1405 2/37 5 0/7 -HLA DQB1*0303 15/37 41 4/7 570301 11/37 30 2/7 290401 12/37 32 3/7 430601 5/37 14 2/7 290201 4/37 11 0/7 -0501 4/37 11 0/7 -0602 4/37 11 0/7 -首先檢測(cè)源自RA滑液和滑液損傷的T細(xì)胞是否顯示限制性TCR BV基因，并確定這種限制性BV基因是否與HLA基因型有關(guān)。之后，先用25個(gè)特異引物通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)PB和滑液(SF和ST)樣品進(jìn)行TCRBV基因使用分析。用于本研究的實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)檢測(cè)基于BV表達(dá)模式的T細(xì)胞的選擇性增殖是敏感和特異的。圖1A和1B表明用于實(shí)時(shí)PCR分析的特異BV引物優(yōu)化以及用超抗原刺激后外周T細(xì)胞的BV基因分析。圖1A中，通過ABI 7000 Sequence Detection System測(cè)試了對(duì)于25個(gè)BV家族和BC基因特異的一套寡核苷酸引物的擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示在周期數(shù)功能方面具有類似的熒光強(qiáng)度(ΔRn)斜率，這表明在例4所描述的PCR試驗(yàn)條件下TCRBV和TCRBC引物具有類似的擴(kuò)增效率。在圖1B中，外圍血單核細(xì)胞取自四個(gè)健康的個(gè)體并在存在/缺乏中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)(預(yù)先確定的濃度為1μg/ml)單獨(dú)培養(yǎng)7天，離心收集細(xì)胞后洗滌，然后提取RNA，用25個(gè)BV基因特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。PCR條件如上面例4所述。結(jié)果用相對(duì)于BC表達(dá)水平的BV基因的四種制備細(xì)胞的BV表達(dá)率來表示。如圖1B所示，用中毒性休克綜合征毒素(一種可以激活BV2+T細(xì)胞的超抗原)刺激后，利用實(shí)時(shí)PCR分析，在四種外周血單核細(xì)胞制劑中迅速檢測(cè)到BV2的選擇性增殖。
實(shí)施例8RA患者的血液和滑液樣品中BV基因分配與實(shí)時(shí)PCR分析的對(duì)照當(dāng)一些SF和PB樣品不可供分析使用時(shí)，從37個(gè)ST樣品和20個(gè)取自相同RA病人的PB和SF樣品中提取RNA。應(yīng)用25個(gè)BV基因的特異引物通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)每一個(gè)轉(zhuǎn)錄物中的BV基因表達(dá)進(jìn)行分析。7個(gè)OA患者的所有平行樣品作為對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。BV基因分布以每個(gè)BV基因相對(duì)于BC基因表達(dá)水平的百分比作為Y軸表示，星號(hào)代表過表達(dá)的BV基因剩余的BV基因的表達(dá)具有顯著性差異。圖2揭示在源自RA的ST樣品中，BV對(duì)BV14(27％的平均的表達(dá)水平)，BV16(31％的平均的表達(dá)水平)和對(duì)于一種較少的表達(dá)，BV20(17％)，偏移非常顯著。同樣地，可以觀察到來自同樣的RA患者SF樣品(28％)中BV16的過表達(dá)，但平行的SF樣品中BV14的偏移就不顯著。相比之下，在源自RA的PB樣品中和來源于OA患者的ST及SF樣品一樣，BV基因分配呈現(xiàn)出高度不同。BV14和BV16在這些來源于OA的滑液1樣品中沒有顯示超表達(dá)。進(jìn)一步分析表明在這群RA患者中這種相互關(guān)聯(lián)的趨勢(shì)不是在BV14而是在BV16的超表達(dá)與DRB1*0405的表達(dá)之間。在37名RA患者中分析了DR和DQ基因型和BV基因用法，BV16和BV14的表達(dá)在DRB1*0405陽性的個(gè)體(n＝16)中分別是29％和11％，在DRB1*0405陰性的個(gè)體(n＝21)分別是21％和20％。然而，這種差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比之下，BV14和BV16的表達(dá)水平在其它經(jīng)常地發(fā)現(xiàn)的遺傳型的RA患者中稍低，包括DRB1*09012和DQB1*0301，0303和0401。
實(shí)施例9在源自RA損傷的T細(xì)胞的超表達(dá)BV16和BV14轉(zhuǎn)錄物中BJ基因的優(yōu)化使用和CDR3長度分析應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)，通過CDR3長度分析檢測(cè)源自選擇性滑液材料(這些樣品中的相對(duì)表達(dá)水平＞20％)的T細(xì)胞超表達(dá)BV14和BV16的克隆性。由于BV14和BV16在OA患者的ST樣品中沒有超表達(dá)，可以檢測(cè)兩種樣品(OA2和OA3)作為對(duì)照。
通過免疫電鏡應(yīng)用5’BV14-3’BC特異引物，對(duì)源自滑液原料(ST和SF)的超表達(dá)BV14轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行5’BV-BD-BJ-3’BC區(qū)克隆性分析。CDR3長度被表示為波峰分布區(qū)(X軸)，Y軸代表任意熒光強(qiáng)度單位。對(duì)BV14轉(zhuǎn)錄物分析的選擇是基于所選樣品的BV表達(dá)水平(＞20％)。
通過免疫電鏡應(yīng)用5’BV16-3’BC特異引物，對(duì)源自滑液材料(ST和SF)的過表達(dá)的BV16的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行5’BV-BD-BJ-3’BC區(qū)克隆性分析。對(duì)BV16轉(zhuǎn)錄物分析的選擇是基于所選樣品的BV表達(dá)水平(＞20％)。BV16在患者RA2，RA17和RA32的ST樣品中沒有表達(dá)。
如圖3和4所示，當(dāng)兩對(duì)5’BV14-3’BC和5’BV16-3’BC特異引物被用于分析位于BV14/BV16-BJ-3’BC之間的序列區(qū)時(shí)，BV14和BV16基因在源自同一RA患者的SF和ST的樣品中都表現(xiàn)出不同的CDR3長度圖譜。當(dāng)其它樣品表現(xiàn)出多克隆模式時(shí)，一些ST樣品顯示高度限制性的特性克隆型的克隆性(如BV14的RA2、RA17、RA23及RA28與BV16的RA21及RA18)。應(yīng)用BV14或者BV16引物和一套13個(gè)個(gè)體BJ基因的特異引物，通過免疫電鏡，進(jìn)一步分別分析BV14和BV16轉(zhuǎn)錄物的CDR3長度圖譜，以鑒定同各種BV和BJ結(jié)合時(shí)的顯著克隆模式。以源自兩個(gè)OA患者的ST樣品的轉(zhuǎn)錄物作為對(duì)照。圖5表明在OA患者ST樣品的兩種對(duì)照中，各種模式的克隆性均可檢測(cè)到。
實(shí)施例10以相似CDR3長度擁有相同BV和BJ化合物的典型克隆型模式使用13個(gè)BJ基因的BV14或BV16促進(jìn)引物和反義引物，通過免疫電鏡，進(jìn)一步分析和凈化已檢測(cè)的BV14和BV16的CDR3長度圖譜。
源自所選的ST樣品的超表達(dá)BV14和/或BV16的轉(zhuǎn)錄物共產(chǎn)生了689個(gè)CDR3長度圖譜。分析揭示了若干種重要的研究結(jié)果。首先，三到四個(gè)BJ基因優(yōu)先用于超表達(dá)BV14和BV16中。BJ1S4、BJ2S1和BJ2S7優(yōu)先用于BV16，而BJ1S1、BJ2S1、BJ2S4與BJ2S7則與BV14關(guān)聯(lián)。具有代表性的例子如圖5所示。
此外，一些超表達(dá)BV14和BV16轉(zhuǎn)錄物中包含有普通和顯著的克隆型，這些克隆型與CDR3長度具有BV和BJ相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這在不同RA患者的各種ST樣品出現(xiàn)過。至少有三個(gè)分別帶有15，21和24個(gè)堿基對(duì)的相同的CDR3克隆型在BV16的BJ2S1、BJ2S7和BJ1S1的轉(zhuǎn)錄物中被發(fā)現(xiàn)。類似的普通克隆型也出現(xiàn)在源自獨(dú)立個(gè)體的ST樣品的BJ2S1，BJ2S7，BJ1S4 and BJ1S1的BV14中。具有代表性的克隆型模式如圖6中所示，它表明典型的克隆型是具有相似CDR3長度(高峰區(qū)域，對(duì)BV16和BV1415而言，21、24個(gè)堿基對(duì))的同樣的BV和BJ結(jié)合體。使用TAcloning試劑盒克隆普通克隆型的TCR轉(zhuǎn)錄物，隨后使用相應(yīng)的BV和BJ引物對(duì)所產(chǎn)生的DNA克隆進(jìn)行CDR3序列分析。結(jié)果支持了這樣一種可能性，那就是這些普通克隆型可能具有相同的CDR3序列或相同的CDR3序列基序。選擇一些顯性克隆型作進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例11包含普通克隆型的TCR轉(zhuǎn)錄物的CDR3序列分析為了確證擁有同樣的V-D-J結(jié)構(gòu)的特性在已經(jīng)確定的克隆型不同患者中是否有同樣CDR3序列或者普通CDR3序列圖，將對(duì)出現(xiàn)在單獨(dú)ST樣品的TCR轉(zhuǎn)錄物的普通克隆型的特征進(jìn)行描述。
選擇一些顯性的克隆型分析。所選擇的普通克隆型的TCR轉(zhuǎn)錄物被克隆進(jìn)TA載體，這樣，DNA克隆就可以通過應(yīng)用相應(yīng)的BV和BJ引物進(jìn)行CDR3序列分析，每一簇BV和BJ的化合物大約有15種被隨機(jī)選作序列分析的單獨(dú)的DNA克隆。總共490個(gè)DNA克隆被成功排序。結(jié)果表明同簇DNA克隆的大多數(shù)個(gè)體具有相同的選擇性克隆型CDR3序列，這表明T細(xì)胞的體內(nèi)克隆的增殖載有克隆型。大多數(shù)克隆型顯示獨(dú)立于各個(gè)個(gè)體的單獨(dú)CDR3序列。在不同個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的一些類似的克隆型具有相同CDR3序列。
使用TA克隆方法克隆包含三個(gè)類似克隆型(BV16-2S1/2S7/1S1-CDR3長度分別為24bp/21bp/15bp)的超表達(dá)BV16的轉(zhuǎn)錄物。針對(duì)每一DNA克隆，使用BV和BJ的特異引物對(duì)所產(chǎn)生的10到15個(gè)DNA克隆進(jìn)行V-DJ序列測(cè)序。
使用TA克隆方法克隆包含四個(gè)類似的克隆型(BV14-2S1/2S7/1S4/1S1-CDR3長度24bp/21bp/15bp)過表達(dá)BV14的轉(zhuǎn)錄物。針對(duì)每一DNA克隆，使用BV和BJ的特異引物對(duì)所產(chǎn)生的10-15DNA克隆進(jìn)行V-DJ序列測(cè)序。
在RA12和RA16的BV16-BJ2S7的轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CDR3序列(SEQ ID NO.4)(表4)。另一個(gè)CDR3序列(SEQ ID NO.3)出現(xiàn)在RA22和RA23的BV14-2S7的轉(zhuǎn)錄物中(表5)。如表4和表5所示，這些類似的克隆型表現(xiàn)出相同/普通的序列基序。BV16的SQD、SLL和SWGG基序在6/12個(gè)BV16個(gè)體中被發(fā)現(xiàn)，而SLS基序在5/14個(gè)BV14的個(gè)體中被找到?？偟膩碚f，SLS，SP-和SS的序列模式在86％的BV14克隆型找到，BV16克隆型的77％有SQ-，SLL and SWGG序列模式。
表4 源自RA的ST樣品中BV16克隆型的CDR3序列CDR3長樣品號(hào) BV-BJ V-D-J序列度(bp)RA-616-2S1 24Y F C A SS Q DS G G G G E Q F F G P G(SEQ ID NO.75)tatttctgtgccagcagccaagatagcggggggggaggtgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.76)RA-16 16-2S1 24Y F C A S S R L G Q G Y N E Q F F G P G(SEQ ID NO.77)Tatttctgtgccagcagccgactgggacagggctacaatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.78)RA-21 16-2S1 24Y F C A SS Q DL D S Y N E Q F F G P G(SEQ ID NO.79)Tatttctgtgccagcagccaagatctggacagctacaatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.80)RA-19 16-2S1 24Y F C A S S Q G T S G I T E Q F F G P G(SEQ ID NO.81)Tatttctgtgccagcagccaggggactagcgggatcactgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.82)RA-816-2S1 24Y F C A S S Q L A G P Y N E Q F F G P G(SEQ ID NO.83)tatttctgtgccagcagccagctagcgggaccctacaatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.84)RA-116-2S1 24Y F C A SS L LG T V S Y E Q F F G P G(SEQ ID NO.85)tatttctgtgccagcagccttctcggcacagtatcctatgagcagttcttcgggccaggc(SEQ ID NO.86)RA-10 16-2S7 21Y F C A S P L G T A L S Y E Q F F G P G(SEQ ID NO.87)tatttctgtgccagcccccttgggacagcgctatcctacgagcagtacttcgggccgggc
(SEQ ID NO.88)RA-12 16-2S7 21Y F C A S S Q A D G T H Y E Q F F G P G(SEQ ID NO.89)tatttctgtgccagcagccaagctgacgggacccattacgagcagtacttcgggccgggcRA-12 16-2S7 21 (SEQ ID NO.90)Y F C A SS Q DK G H F Y E Q F F G P G (SEQ ID NO.91)tatttctgtgccagcagccaagataagggacacttctacgagcagtacttcgggccgggc(SEQ ID NO.92)RA-16 16-2S7 21Y F C A S S Q A D G T H Y E Q F F G P G(SEQ ID NO.93)Tatttctgtgccagcagccaagctgacgggacccattacgagcagtacttcgggccgggc(SEQ ID NO.94)RA-14 16-2S7 21 Y F C A SS W G GT D I Y E Q F F G P G (SEQ ID NO.95)Tatttctgtgccagcagctggggcgggacagacatctacgagcagtacttcgggccgggc(SEQ ID NO.96)RA-1 16-2S7 21 Y F C A SS L LG T V S Y E Q F F G P G (SEQ ID NO.97)Tatttctgtgccagcagccttctcggcacagtatcctacgagcagtacttcgggccgggc(SEQ ID NO.98)RA-17 16-1S1 15 Y F C A S S Q G L N T E A F F G Q G(SEQ ID NO.
99)Tatttctgtgccagcagccaaggccttaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.100)RA-5 16-1S1 15 Y F C A S R A S R Y T E A F F G Q G(SEQ ID NO.
101)Tatttctgtgccagcagggcaagcaggtacactgaagctttctttggacaaggc(SEQID NO.102)RA-5 16-1S1 15 Y F C A S R A S R Y T E A F F G Q G(SEQ ID NO.
103)Tatttctgtgccagcagggcaagcaggtacactgaagctttctttggacaaggc(SEQID NO.104)RA-12 16-1S1 15 Y F C A S S T G V N T E A F F G Q G(SEQ ID NO105)TatttctgtgccagcAgtacaggggtgaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQID NO.106)RA-16 16-1S1 15 Y F C A S S L T T N T E A F F G Q G(SEQ ID NO.
107)Tatttctgtgccagcagcctcacaacgaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.108)RA-24 16-1S1 15 Y F C A SS Q DS Y T E A F F G Q G(SEQ ID NO.
109)Tatttctgtgccagcagccaagattcgtacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.110)
RA-1 16-1S1 15 Y F C A SS W G GN T E A F F G Q G (SEQ ID NO.
111)Tatttctgtgccagcagctgggggggcaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQID NO.112)表5 源自RA的ST樣品中BV14克隆型的CDR3序列CDR3長度樣品號(hào) BV-BJCDR3序列(bp)RA-32 14-2S1 24 Y F C A S S P T R D R G N E Q F F GP G(SEQ ID NO.113)tacttctgtgccagcagtcccacgcgggacaggggaaataatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.114)RA-13 14-2S1 24 Y F C A S S S P I A G S S Y N E Q F FG P G(SEQ ID NO.115)Tacttctgtgccagcagttccccaatagcggggagctccaatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.116)RA-16 14-2S1 24 Y F C A S S F W A P T D N E Q F F G PG(SEQ ID NO.117)Tacttctgtgccagcagtttctgggcccctacggacaataatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.118)RA-23 14-2S1 24 Y F C A S S S S S P T S Y N E Q F FG P G(SEQ ID NO.119)Tacttctgtgccagcagttctagcagccccacctcctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.120)RA-27 14-2S1 24 Y F C A S S P R E G L L N E Q F F GP G(SEQ ID NO.121)Tacttctgtgccagcagccctagggagggcctcctcaataatgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.122)RA-1 14-2S1 24 Y F C A S S P W T S G S G N E Q F FG P G(SEQ ID NO.123)tacttctgtgccagcagtccctggactagcgggagtggtgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.124)RA-32 14-2S7 21 Y F C A S S L R T R F Y E Q Y F G PG(SEQ ID NO.125)Tacttctgtgccagcagtttaaggacacgcttctacgagcagttcttcgggccagga(SEQID NO.126)RA-8 14-2S7 21 Y F C A S S L T S G R Q Y E Q Y F G
P G(SEQ ID NO.127)RA-8 14-2S7 21 Tacttctgtgccagcagtttgaccagcgggcgtcagtacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.128)Y F C A S S S G G S L F Y E Q Y F GP G(SEQ ID NO.129)Tacttctgtgccagcagttccgggggcagtctgttctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.130)RA-7 14-2S7 21 Y F C A SS L SV G A T Y E Q Y F GP G(SEQ ID NO.131)RA-7 14-2S7 21 Tacttctgtgccagcagtttatcggtcggggctacctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.132)Y F C A S S S G G S L F Y E Q Y F GP G(SEQ ID NO.133)Tacttctgtgccagcagttccgggggcagtctgttctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.134)RA-12 14-2S7 21 Y F C A S S P S I S S H Y E Q Y F G PG(SEQ ID NO.135)Tacttctgtgccagcagcccaagtattagttcccactacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.136)RA-3 14-2S7 21 Y F C A S S R D G V S Y E Q Y F G PG(SEQ ID NO.137)Tacttctgtgccagcagtcgtgatggggtctcctacgagcagttcttcgggccagga(SEQID NO.138)RA-2 14-2S7 21 Y F C A SS L SS T G R E Q Y F G PG(SEQ ID NO.139)Tacttctgtgccagcagtttatcttcgacagggagggagcagtacttcgggccgggc(SEQID NO.140)RA-17 14-2S7 21 Y F C A SS L SF R L D Y E Q Y F G PG(SEQ ID NO.141)Tacttctgtgccagcagtttatcgtttagactagactacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.142)RA-23 14-2S7 21 Y F C A S S P S G Q G S Y E Q Y F GP G(SEQ ID NO.143)Tacttctgtgccagcagtccgtcgggacaggggtcctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.144)RA-1 14-2S7 21 Y F C A S S F G T V L S Y E Q Y F G PG(SEQ ID NO.145)Tacttctgtgccagcagttttgggacagtcctctcctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.146)RA-34 14-2S7 21 Y F C A S S P R L A G D K E Q Y F G
P G (SEQ ID NO.147)RA-34 14-2S7 21 Tacttctgtgccagcagtccccgactagcgggagataaaggagcagtacttcgggccgggc(SEQ ID NO.148)Y F C A SS L SA R T T Y E Q Y F GP G(SEQ ID NO.149)Tacttctgtgccagcagtttaagtgccaggacaacctacgagcagttcttcgggccagga(SEQ ID NO.150)RA-13 14-1S4 15 Y F C A S S L I G G N E K L F L G SG(SEQ ID NO.151)Tacttctgtgccagcagtttgatagggggcaatgaaaaactgttttttggcagtgga(SEQID NO.152)RA-1 14-1S4 15 Y F C A SS L SQ E T E A F F G Q G(SEQ ID NO.153)Tacttctgtgccagagtttatcccaggaaactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.154)RA-34 14-1S4 15 Y F C A S R A G T G F E K L F F G SG(SEQ ID NO.155)Tacttctgtgccagcagggccgggacagggtttaaactgttttttggcagtgga(SEQ IDNO.156)RA-2 14-1S1 15 Y F C A SS L SQ N T E A F F G Q G(SEQ ID NO.157)Tacttctgtgccagcagtctgtcacagaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.158)RA-23 14-1S1 15 Y F C A S S P R V N T E A F F G Q G(SEQ ID NO.159)Tacttctgtgccagagtccccgggtcaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.160)RA-1 14-1S1 15 Y F C A SS L SQ E T E A F F G Q G(SEQ ID NO.161)Tacttctgtgccagagtttatcccaggaaactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.162)RA-34 14-1S1 15 Y F C A S S L G R N T E A F F G Q G(SEQ ID NO.163)RA-34 14-1S1 15 Tacttctgtgccagcagcctagggaggaacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.164)RA-34 14-1S1 15 Y F C A S S S R G Y T E A F F G Q G(SEQ ID NO.165)Tacttctgtgccagcagttccaggggatacactgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.166)Y F C A S S S L A T A E A F F G Q G
(SEQ ID NO.167)Tacttctgtgccagcagttccctcgctactgctgaagctttctttggacaaggc(SEQ IDNO.168)表中用粗體標(biāo)出V-D-J結(jié)合區(qū)序列。相同的V-D-J序列(SSGGSLF)和序列主題(motif)(SLS)加了下劃線。
在本說明書中被提及的任何專利或者出版物是用于表述本發(fā)明所達(dá)到的技術(shù)水平的，盡管本發(fā)明描述時(shí)涉及了特定的細(xì)節(jié)，但這并沒有對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制，而是使本發(fā)明更易于接受各種不背離其基本原理的改變和修正。
序列表<110>臧敬五(Zhang，Jingwu Z.)何國強(qiáng)(Ho，Walter Kowk Keung)張東青(Zhang，Dongqing)孫偉(Sun，Wei)<120>T 細(xì)胞受體CDR-3序列及治療與檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法<130>057186.000003<140>
<151>2002-07-02<160>168<210>1<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(下稱RA)患者T細(xì)胞受體(下稱TCR)的V(14家族(BV14基因)中互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR-3)的一部分<400>1agccaagctg acgggaccca t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>RA患者TCR的V(16家族(BV16基因)中互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR-3)的一部分<400>2agt tccgggg gcagtctgtt c21<210>3<211>7<212>PRT<213>人類<220>
<221>多肽<223>保存了源自RA患者TCR的(鏈BV14基因CDR-3的氨基酸序列<400>3Ser Gln Ala Asp Gly Thr His5<210>4
<211>7<212>PRT<213>人類<220>
<221>多肽<223>保存了源自RA患者TCR的(鏈BV16基因CDR-3的氨基酸序列<400>4Ser Ser Gly Gly Ser Leu Phe5<210>5<211>4<212>PRT<213>人類<220>
<221>基序<223>源自RA患者TCR的(鏈BV16基因CDR-3的氨基酸序列基序<400>5Ser Trp Gly Gly<210>6<211>113<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>T細(xì)胞受體中人類(鏈可變區(qū)V(14的氨基酸序列<400>6Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly5 10 15Ala Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu20 25 30Ile Thr Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn35 40 45Met Asn His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu50 55 60Gly Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp65 70 75Lys Gly Asp Val Pro Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys80 85 90Arg Asn Phe Pro Leu Ile Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr95 100 105Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser110
<210>7<211>96<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>T細(xì)胞受體中人類(鏈可變區(qū)V(16的氨基酸序列<400>7Ile Glu Ala Gly Val Thr Gln Phe Pro Ser His Ser Val Ile Glu5 10 15Lys Gly Gln Thr Val Thr Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His20 25 30Asp Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Arg Val Met Gly Lys Glu Ile Lys35 40 45Phe Leu Leu His Phe Val Lys Glu Ser Lys Gln Asp Glu Ser Gly50 55 60Met Pro Asn Asn Arg Phe Leu Ala Glu Arg Thr Gly Gly Thr Tyr65 70 75Ser Thr Leu Lys Val Gln Pro Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Val80 85 90Tyr Phe Cys Ala Ser Ser95<210>8<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV1基因的特異促進(jìn)引物<400>8aagcacctga tcacagcaac t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV1基因的特異反向引物<400>9tagt tcagag tgcaagtcag g 21
<210>10<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV2基因的特異促進(jìn)引物<400>10ggttatctgt aagagtggaa cct 23<210>11<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV2基因的特異反向引物<400>11aggatgggca ctggtcactg t 21<210>12<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV3基因的特異促進(jìn)引物<400>12tcgagatatc tagtcaaaag gacg 24<210>13<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV3基因的特異反向引物<400>13ggtgctggcg gactccagaa t 21<210>14<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV4基因的特異促進(jìn)引物<400>14aagcagggat atctgtcaac gt22<210>15<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV4基因的特異反向引物<400>15ttcagggctc atgttgctca c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV5基因的特異促進(jìn)引物<400>16gatcaaaacg agaggacagc a 21<210>17<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV5基因的特異反向引物<400>17agcaccaagg cgctcacatt ca22<210>18<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV6基因的特異促進(jìn)引物<400>18
ctcaggtgtg atccaatttc a 21<210>19<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV6基因的特異反向引物<400>19cccccgctct gtgcgctgga t 21<210>20<211>25<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV7基因的特異促進(jìn)引物<400>20catgggaatg acaaataaga agtct 25<210>21<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV7基因的特異反向引物<400>21tggctgcagg gcgtgtaggt g 21<210>22<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV8基因的特異促進(jìn)引物<400>22ccccgccatg aggtgacaga g 21<210>23<211>21<212>DNA
<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV8基因的特異反向引物<400>23gagtccctgg gttctgaggg c 21<210>24<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV9基因的特異促進(jìn)引物<400>24ccaaaatacc tggtcacaca g 21<210>25<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV9基因的特異反向引物<400>25ccagggaatt gatgtgaaga tt22<210>26<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV10基因的特異促進(jìn)引物<400>26acctagactt ctggtcaaag ca22<210>27<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV10基因的特異反向引物
<400>27ggactggatc tccaaggtac a 21<210>28<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV11基因的特異促進(jìn)引物<400>28ttatagggac aggaaagaag atc 23<210>29<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV11基因的特異反向引物<400>29atgtgagggc ctggcagact c 21<210>30<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV12基因的特異促進(jìn)引物<400>30caagacacaa ga tcacagag aca 23<210>31<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV12基因的特異反向引物<400>31ggcagcagac tccagagtga g 21<210>32
<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV13基因的特異促進(jìn)引物<400>32tgaagacagg acagagcatg aca 23<210>33<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV13基因的特異反向引物<400>33cacagatgtc tgggagggag c 21<210>34<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV14基因的特異促進(jìn)引物<400>34acccaagata cctcatcaca gtg 23<210>35<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV14基因的特異反向引物<400>35agaggtctgg ttggggctgg g 21<210>36<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV15基因的特異促進(jìn)引物<400>36tcacaaagac aggaaagagg att 23<210>37<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV15基因的特異反向引物<400>37ggggatggca gactctaggg a 21<210>38<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV16基因的特異促進(jìn)引物<400>38gttccccagc cacagcgtaa ta22<210>39<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV16基因的特異反向引物<400>39cagttctgca ggctgcacct t 21<210>40<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV17基因的特異促進(jìn)引物<400>40gtccccaaag tacctgttca ga22
<210>41<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV17基因的特異反向引物<400>41agctgtcggg ttcttttggg c 21<210>42<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV18基因的特異促進(jìn)引物<400>42agacacctgg tcaggaggag g 21<210>43<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV18基因的特異反向引物<400>43tgccgaatct cctcgcacta c 21<210>44<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV19基因的特異促進(jìn)引物<400>44ccaggacatt tggtcaaagg aaaa 24<210>45<211>21<212>DNA<213>合成的
<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV19基因的特異反向引物<400>45cagtgccgtg tctcccggtt c 21<210>46<211>19<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV20基因的特異促進(jìn)引物<400>46gaccctggtg cagcctgtg19<210>47<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV20基因的特異反向引物<400>47gaggaggagc ttcttagaac t 21<210>48<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV21基因的特異促進(jìn)引物<400>48cccagatata agattacaga gaaa 24<210>49<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV21基因的特異反向引物<400>49
ctggatcttg agagtggagt c 21<210>50<211>23<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV22基因的特異促進(jìn)引物<400>50cacagatggg acaggaagtg atc 23<210>51<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV22基因的特異反向引物<400>51gtcctccagc tttgtggacc g 21<210>52<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV23基因的特異促進(jìn)引物<400>52aagagggaaa cagccactct g 21<210>53<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV23基因的特異反向引物<400>53cagctccaag gagctcatgt t 21<210>54<211>24<212>DNA
<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV24基因的特異促進(jìn)引物<400>54ccaagatacc aggttaccca gttt 24<210>55<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV24基因的特異反向引物<400>55caggcctggt gagcggatgt c 21<210>56<211>22<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV25基因的特異促進(jìn)引物<400>56aaaacatctt gtcagagggg aa22<210>57<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BV25基因的特異反向引物<400>57tgaatcctca agcttcgtag c 21<210>58<211>19<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BC基因的特異促進(jìn)引物<400>58
cagcgccctt gtgttgatg19<210>59<211>20<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于定量PCR分析的TCR BC基因的特異反向引物<400>59aagcgctggc aaaagaagaa 20<210>60<211>18<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的BC引物<400>60cgacctcggg tgggaaca 18<210>61<211>19<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BC引物<400>61cacagcgacc tcgggtggg19<210>62<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>62actgtgagtc tggtgccttg t 21<210>63
<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>63acaacggtta acttggtccc cgaa 24<210>64<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>64ggtcctctac aacagtgagc caac 24<210>65<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>65aagagagaga gctgggttcc actg 24<210>66<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>66ggagagtcga gttccatca19<210>67<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物
<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>67tgtcacagtg agcctggtcc catt 24<210>68<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>68cctggcccga agaactgctc a 21<210>69<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>69gtcctccagt acgctcagcc taga 24<210>70<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>70tgcctgggcc aaaatactgc g 21<210>71<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>71tccccgcgcc gaagtactga a 21
<210>72<211>18<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>72tcgagcacca ggagccgc 18<210>73<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>73ctgctgccgg ccccgaaagt c 21<210>74<211>21<212>DNA<213>合成的<220>
<221>結(jié)合引物<223>應(yīng)用于決定性反應(yīng)的已標(biāo)記FAM(擴(kuò)充)BJ引物<400>74tgaccgtgag cctggtgccc g 21<210>75<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織(下稱ST)樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>75Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Asp Ser Gly Gly Gly Gly Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20
<210>76<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>76tatttctgtg ccagcagcca agatagcggg gggggaggtg agcagttctt cgggccagga 60<210>77<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>77Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Arg Leu Gly Gln Gly Tyr Asn Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>78<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>78tatttctgtg ccagcagccg actgggacag ggctacaatg agcagttctt cgggccagga 60<210>79<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>79Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Asp Leu Asp Ser Tyr Asn Glu Gln
5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>80<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>80tatttctgtg ccagcagcca agatctggac agctacaatg agcagttctt cgggccagga 60<210>81<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>81Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Gly Thr Ser Gly Ile Thr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>82<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>82tatttctgtg ccagcagcca ggggactagc gggatcactg agcagttctt cgggccagga 60<210>83<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>83Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Leu Ala Gly Pro Tyr Asn Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>84<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>84tatttctgtg ccagcagcca gctagcggga ccctacaatg agcagttctt cgggccagga 60<210>85<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>85Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Leu Gly Thr Val Ser Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>86<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>86tatttctgtg ccagcagcct tctcggcaca gtatcctatg agcagttctt cgggccaggc 60<210>87<211>20<212>PRT
<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>87Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Leu Gly Thr Ala Leu Ser Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>88<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>88tatttctgtg ccagccccct tgggacagcg ctatcctacg agcagtactt cgggccgggc 60<210>89<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>89Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Ala Asp Gly Thr His Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>90<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>90tatttctgtg ccagcagcca agctgacggg acccattacg agcagtactt cgggccgggc 60<210>91<211>20
<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>91Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Asp Lys Gly His Phe Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>92<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>92tatttctgtg ccagcagcca agataaggga cacttctacg agcagtactt cgggccgggc 60<210>93<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>93Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Ala Asp Gly Thr His Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>94<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>94tatttctgtg ccagcagcca agctgacggg acccattacg agcagtactt cgggccgggc 60<210>95
<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>95Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Trp Gly Gly Thr Asp Ile Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>96<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>96tatttctgtg ccagcagctg gggcgggaca gacatctacg agcagtactt cgggccgggc 60<210>97<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>97Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Leu Gly Thr Val Ser Tyr Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>98<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>98tatttctgtg ccagcagcct tctcggcaca gtatcctacg agcagtactt cgggccgggc 60
<210>99<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>99Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>100<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>100tatttctgtg ccagcagcca aggccttaac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>101<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>101Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Ala Ser Arg Tyr Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>102<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>102tatttctgtg ccagcagggc aagcaggtac actgaagctt tctttggaca aggc 54
<210>103<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>103Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Ala Ser Arg Tyr Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>104<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>104tatttctgtg ccagcagggc aagcaggtac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>105<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>105Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Thr Gly Val Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>106<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>C源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>106
tatttctgtg ccagcagtac aggggtgaac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>107<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>107Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Thr Thr Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>108<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>108tatttctgtg ccagcagcct cacaacgaac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>109<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>109Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Asp Ser Tyr Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>110<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>110tatttctgtg ccagcagcca agattcgtac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>111<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3氨基酸序列<400>111Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Trp Gly Gly Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>112<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV16克隆型的CDR3核酸序列<400>112tatttctgtg ccagcagctg ggggggcaac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>113<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>113Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Thr Arg Asp Arg Gly Asn Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>114<211>63<212>DNA
<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>114tacttctgtg ccagcagtcc cacgcgggac aggggaaata atgagcagtt cttcgggcca 60gga<210>115<211>22<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>115Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Pro Ile Ala Gl y Ser Ser Tyr Asn5 10 15Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly20<210>116<211>63<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>116tacttctgtg ccagcagttc cccaatagcg gggagctcea atgagcagtt cttcgggcca 60gga<210>117<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>117Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Phe Trp Ala Pro Thr Asp Asn Glu Gln5 10 15Phe Phe Gly Pro Gly20
<210>118<211>63<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>118tacttctgtg ccagcagttt ctgggcccct acggacaata atgagcagtt cttcgggcca 60gga<210>119<211>21<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>119Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Glu5 10 15Gln Phe Phe Gly Pro Gly20<210>120<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>120tacttctgtg ccagcagttc tagcagcccc acctcctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>121<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>121Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Arg Glu Gly Leu Leu Asn Glu Gln
510 15Phe Phe Gly Pro Gly20<210>122<211>63<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>122tacttctgtg ccagcagccc tagggagggc ctcctcaata atgagcagtt cttcgggcca 60gga<210>123<211>21<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>123Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Trp Thr Ser Gly Ser Gly Asn Glu5 10 15Gln Phe Phe Gly Pro Gly20<210>124<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>124tacttctgtg ceagcagtcc ctggactagc gggagtggtg agcagttctt cgggccagga 60<210>125<211>19<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>125Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Arg Thr Arg Phe Tyr Glu Gln Tyr5 10 15Phe Gly Pro Gly<210>126<211>57<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>126tacttctgtg ccagcagttt aaggacacgc ttctacgagc agttcttcgg gccagga 57<210>127<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>127Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Thr Ser Gly Arg Gln Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>128<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>128tacttctgtg ccagcagttt gaccagcggg cgtcagtacg agcagttctt cgggccagga 60<210>129<211>20<212>PRT<213>人類
<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>129Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ser Leu Phe Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>130<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>130tacttctgtg ccagcagttc cgggggcagt ctgttctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>131<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>131Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Val Gly Ala Thr Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>132<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>132tacttctgtg ccagcagttt atcggtcggg gctacctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>133<211>20<212>PRT
<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>133Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ser Leu Phe Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>134<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>134tacttctgtg ccagcagttc cgggggcagt ctgttctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>135<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>135Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>136<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>136tacttctgtg ccagcagccc aagtattagt tcccactacg agcagttctt cgggccagga 60<210>137<211>19
<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>137Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Arg Asp Gly Val Ser Tyr Glu Gln Tyr5 10 15Phe Gly Pro Gly<210>138<211>57<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>138tacttctgtg ccagcagtcg tgatggggtc tcctacgagc agttcttcgg gccagga 57<210>139<211>19<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>139Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Ser Thr Gly Arg Glu Gln Tyr5 10 15Phe Gly Pro Gly<210>140<211>57<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>140tacttctgtg ccagcagttt atcttcgaca gggagggagc agtacttcgg gccgggc 57
<210>141<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>141Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Phe Arg Leu Asp Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>142<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>142tacttctgtg ccagcagttt atcgtttaga ctagactacg agcagttctt cgggccagga 60<210>143<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>143Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Ser Gly Gln Gly Ser Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>144<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>144
tacttctgtg ccagcagtcc gtcgggacag gggtcctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>145<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>145Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Phe Gly Thr Val Leu Ser Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>146<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>146tacttctgtg ccagcagttt tgggacagtc ctctcctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>147<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>147Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ala Gly Asp Lys Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>148<211>61<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>148tacttctgtg ccagcagtcc ccgactagcg ggagataaag gagcagtact tcgggccggg 60c<210>149<211>20<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>149Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Ala Arg Thr Thr Tyr Glu Gln5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly20<210>150<211>60<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>150tacttctgtg ccagcagttt aagtgccagg acaacctacg agcagttctt cgggccagga 60<210>151<211>19<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>151Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ile Gly Gly Asn Glu Lys Leu Phe5 10 15Leu Gly Ser Gly<210>152<211>57
<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>152tacttctgtg ccagcagttt gatagggggc aatgaaaaac tgttttttgg cagtgga 57<210>153<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>153Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gln Glu Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>154<211>53<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>154tacttctgtg ccagagttta tcccaggaaa ctgaagcttt ctttggacaa ggc 53<210>155<211>19<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>155Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Ala Gly Thr Gly Phe Glu Lys Leu Phe5 10 15Phe Gly Ser Gly
<210>156<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>156tacttctgtg ccagcagggc cgggacaggg tttaaactgt tttttggcag tgga 54<210>157<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>157Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gln Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>158<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>158tacttctgtg ccagcagtct gtcacagaac actgaagctt tctttggaca aggc54<210>159<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>159Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Arg Val Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15
Gly Gln Gly<210>160<211>53<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>160tacttctgtg ccagagtccc cgggtcaaca ctgaagcttt ctttggacaa ggc 53<210>161<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>161Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Ser Gln Glu Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>162<211>53<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>162tacttctgtg ccagagttta tcccaggaaa ctgaagcttt ctttggacaa ggc 53<210>163<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>163
Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Asn Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>164<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>164tacttctgtg ccagcagcct agggaggaac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>165<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>165Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Arg Gly Tyr Thr Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>166<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3核酸序列<400>166tacttctgtg ccagcagttc caggggatac actgaagctt tctttggaca aggc 54<210>167<211>18<212>PRT<213>人類<220>
<221>功能區(qū)<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>167Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser Leu Ala Thr Ala Glu Ala Phe Phe5 10 15Gly Gln Gly<210>168<211>54<212>DNA<213>合成的<220>
<221>
<223>源自RA患者ST樣本的BV14克隆型的CDR3氨基酸序列<400>168tacttctgtg ccagcagttc cctcgctact gctgaagctt tctttggaca aggc 54權(quán)利要求
1.一種充分純化和分離的DNA片段，其中包括如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于該DNA片段至少包括源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈BV14基因的互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR3)的部分基因。
3.一種充分純化和分離的DNA片段，其中包括如SEQ ID NO.2所示的核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA片段，其特征在于該DNA片段至少包括源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈BV16基因的互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR3)的部分基因。
5.一種疫苗，該疫苗至少從包括選自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2.的片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于所述DNA片段的濃度范圍大約是10μg/ml到10mg/ml。
7.一種充分純化和分離的多肽，該多肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO.3和SLS。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，其特征在于所述多肽具有一個(gè)氨基酸序列，此氨基酸序列源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈BV14基因的互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR3)。
9.一種針對(duì)權(quán)利要求8所述多肽的抗體。
10.一種充分純化和分離的多肽，該多肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于所述多肽具有一個(gè)氨基酸序列，此氨基酸序列源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體β鏈BV16基因的互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR3)。
12.一種針對(duì)權(quán)利要求11所述多肽的抗體。
13.一種疫苗，該疫苗至少包含一種多肽，此多肽具有一個(gè)源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞受體基因BV14或BV16的互補(bǔ)決定區(qū)-3(CDR3)的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包括至少包含一種多肽，該多肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5。
15.一種用以檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其步驟包括(a)從可疑的個(gè)體獲得一種組織樣品；(b)測(cè)量該組織樣品中T細(xì)胞BV14和/或者BV16的表達(dá)水平；并，(c)在一個(gè)正常的個(gè)體上重復(fù)步驟(a，b)；(d)針對(duì)(b)、(c)比較。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述用以檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其特征在于所述組織樣品取自可疑個(gè)體和正常個(gè)體的滑膜液、滑膜損傷組織或外周血。
17.一種在中國人群的可疑個(gè)體中檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，其步驟包括(a)從可疑個(gè)體獲得一種組織抽樣；(b)測(cè)量組織抽樣中的T細(xì)胞受體的BV16的表達(dá)水平；同時(shí)，(c)在中國人口的一個(gè)正常的個(gè)體上重復(fù)步驟(a)、(b)；(d)針對(duì)(b)、(c)比較，可疑個(gè)體的BV16表達(dá)水平如果比正常個(gè)體的表達(dá)水平高。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的在中國人群的可疑個(gè)體中檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，其特征在于所述組織樣品可以取自中國人群的可疑個(gè)體和正常個(gè)體的滑膜液、滑膜損傷組織或外周血。
19.一種檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，其步驟包括(a)產(chǎn)生一個(gè)與DNA片段互補(bǔ)的探針，該DNA片段具有選自SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；的核酸序列；(b)從可疑個(gè)體獲得一種組織樣品；同時(shí)，(c)把探針與組織抽樣相混合，陽性的雜交信號(hào)表明可能會(huì)發(fā)現(xiàn)可疑個(gè)體患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其特征在于所述組織樣品可以取自可疑個(gè)體和正常個(gè)體的滑膜液、滑膜損傷組織或外周血
21.一種檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其步驟包括(a)產(chǎn)生一種直接針對(duì)一種多肽的抗體，這種多肽具有選自SEQ IDNO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5的氨基酸序列；(b)從可疑個(gè)體獲得一種組織樣品；同時(shí)，(c)把抗體與組織抽樣相混合，陽性的信號(hào)表明可能會(huì)發(fā)現(xiàn)可疑個(gè)體患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述檢測(cè)可疑個(gè)體是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其特征在于所述組織樣品可以取自可疑個(gè)體和正常個(gè)體的滑膜液、滑膜損傷組織或外周血。
23.一種引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎個(gè)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)的方法，包括給予有效劑量的免疫原性T細(xì)胞受體肽，其中該肽或片斷能引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)以調(diào)節(jié)介導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的T細(xì)胞，這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5.組成的組中。
24.一種與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異相關(guān)的T細(xì)胞接觸的方法，其步驟包括提供有效劑量的針對(duì)多肽的抗體，這些多肽的氨基酸序列選自由SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL and SEQ ID NO.5.組成的組中。
25.一種在個(gè)體中防止或者減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫方法，其步驟包括(a)為個(gè)體注射含有連接了DNA片段的促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該DNA片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ16的肽的核酸序列，或者是其中的一部分，同時(shí)，(b)在個(gè)體中表達(dá)DNA片段，該DNA片段表達(dá)到一定程度水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫方法，其特征在于所述核酸序列編碼Vβ16的CDR3。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述免疫方法，其特征在于所述核酸序列包含如SEQ ID NO.2所示序列。
28.如權(quán)利要求26所述免疫方法，其特征在于Vβ16的CDR3包含一個(gè)選自SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求25所述免疫方法，其特征在于所述促進(jìn)劑為可誘導(dǎo)或基本的促進(jìn)劑。
30.如權(quán)利要求29免疫方法，其特征在于所述促進(jìn)劑包括β肌動(dòng)蛋白促進(jìn)劑，SV40早期和晚期促進(jìn)劑，免疫球蛋白促進(jìn)劑，人類巨細(xì)胞病毒促進(jìn)劑和和反轉(zhuǎn)錄LTR。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫方法，其特征在于DNA表達(dá)載體的給藥劑型可以是皮下、皮內(nèi)、靜脈注射或者口服劑中的一種。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述免疫方法，DNA表達(dá)載體的給藥制劑可以是肌肉組織注射劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述免疫方法，DNA表達(dá)載體的給藥劑型可以是脊髓液注射劑。
34.一種針對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎個(gè)體所編碼肽的免疫反應(yīng)方法，其步驟包括(a)給予個(gè)體含有連接了DNA片段的促進(jìn)劑的表達(dá)載體，該片段具有編碼單鏈T細(xì)胞受體Vβ14的肽的核酸序列，或者是其中的一部分，該核酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列，同時(shí)，(b)個(gè)體中表達(dá)DNA片段，該DNA片段表達(dá)到一定程度水平就可以引發(fā)針對(duì)所編碼肽的免疫反應(yīng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述方法，其特征在于所述核酸序列編碼Vβ14的CDR3。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述方法，其特征在于所述核酸序列包含如SEQID NO.3和SLS所示序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述方法，其特征在于所述促進(jìn)劑為可誘導(dǎo)或基本的促進(jìn)劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，其特征在于所述促進(jìn)劑包括β肌動(dòng)蛋白促進(jìn)劑，SV40早期和晚期促進(jìn)劑，免疫球蛋白促進(jìn)劑，人類巨細(xì)胞病毒促進(jìn)劑和和反轉(zhuǎn)錄LTR。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述方法，其特征在于所述DNA表達(dá)載體的給藥制劑可以是皮下、皮內(nèi)、靜脈注射或口服劑中的任何一種。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述方法，DNA表達(dá)載體的給藥制劑可以是肌肉組織注射劑。
41.如權(quán)利要求39所述方法，DNA表達(dá)載體的給藥制劑可以是脊髓液注射劑。
42.一個(gè)可抑制源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的病原性T細(xì)胞反應(yīng)的藥物成分，該成分包括源自單鏈T細(xì)胞受體Vβ14或Vβ16的有效免疫劑量的多肽或多肽的一部分以及可接受的藥物載體。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的藥物，其特征在于藥物成分中多肽的氨基酸序列來源于Vβ14或Vβ16的CDR3。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的藥物，其特征在于藥物成分中多肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL和SEQ IDNO.5。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種充分純化和分離的具有如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示的序列的DNA片段與一種充分純化的具有如SEQ ID NO.3，SLS，SEQ ID NO.4，SQD，SLL and SEQ ID NO.5所示的序列多肽，還提出了至少一種DNA和/或多肽衍生的疫苗、抗體和藥物成分。同時(shí)還進(jìn)一步提出了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷方法，本發(fā)明可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1594348SQ20031012057
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月2日
發(fā)明者臧敬五, 何國強(qiáng), 張冬青, 孫瑋 申請(qǐng)人:曼盛基因技術(shù)有限公司