專利名稱：抗人大腸癌單克隆抗體CAb—2輕、重鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株抗人大腸癌單克隆抗體CAb-2的輕、重鏈可變區(qū)基因及其所編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療大腸癌的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大腸癌是危害人群的常見惡性腫瘤。其發(fā)病率在歐美高居第二位，在我國排名第三，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷的調(diào)整，其發(fā)病率仍有上升趨勢。因此研究大腸癌的診斷和治療具有重要的意義。雖然目前核磁共振，內(nèi)窺鏡技術(shù)不斷發(fā)展，早期大腸癌腫瘤的檢出率有所提高，但臨床實際檢測仍存在假陽、假陰性現(xiàn)象，即敏感性和特異性不能讓人滿意。臨床上大腸癌的確診都為晚期，即使切除了原發(fā)病灶，2年的復(fù)發(fā)率仍在50％左右，可見早期的發(fā)現(xiàn)、診斷和治療是關(guān)鍵。自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以來，各種單克隆抗體(McAb)相繼出現(xiàn)，這些單克隆抗體不僅在疾病的基礎(chǔ)研究方面發(fā)揮了積極的作用，同時也為多種難治性腫瘤的診治帶來了新的希望。目前，F(xiàn)dA批準(zhǔn)用于腫瘤的治療性抗體已有15種上市，其中針對大腸癌的單抗是靶向17-1A抗原的鼠源性單抗。該類產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗均是應(yīng)用放射性同位素直接標(biāo)記鼠源性全抗或抗體的F(ab’)2片段。迄今為止，國內(nèi)外用于大腸癌診治研究的靶抗原有17-1A，TAG-72，CEA，A33等。在大腸癌單抗的制備方面，多采用傳統(tǒng)免疫的方法來制備抗體，即以可溶性物質(zhì)或培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞為免疫原。由于腫瘤抗原的變異或部分丟失，因而該方法難以獲得高親和性、高特異性的大腸癌單抗。我們經(jīng)過長期的大量的克隆篩選，獲得了一株對對大腸癌呈現(xiàn)極好反應(yīng)性和特異性的雜交瘤細(xì)胞株CAb-2，其具有較高的應(yīng)用價值和開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供抗大腸癌的單克隆抗體CAb-2的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽，其重組后可表達(dá)出特異性識別和結(jié)合大腸癌相關(guān)抗原的抗體活性片段。
本發(fā)明的另一目的在于所述抗體CAb-2的基因或多肽在制備用于診斷和治療大腸癌藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種抗大腸癌的單克隆抗體CAb-2的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。本發(fā)明所述的抗大腸癌單抗CAb-2重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性CAb-2單抗的雜交瘤細(xì)胞株CAb-2中克隆獲的。本發(fā)明人利用設(shè)計的一套引物擴(kuò)增出大腸癌單抗CAb-2的全長輕鏈及重鏈Fd基因，經(jīng)過序列測定和在NCBI中BLAST比較分析后，確認(rèn)所CAb-2重鏈可變區(qū)基因全長為420bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>2所示。所述的CAb-2輕鏈可變區(qū)基因全長為375bp，其核苷酸序列如序列表中<400>3所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，上述兩個基因經(jīng)重組后可表達(dá)出特異性識別和結(jié)合兩株大腸癌細(xì)胞SW480，8693的抗體Fab活性片段。
對于本發(fā)明人成功克隆的大腸癌特異性單抗CAb-2抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，分別應(yīng)用因特網(wǎng)上專業(yè)性的已知抗體基因序列數(shù)據(jù)庫(IMGT)和(NCBI)對所得序列進(jìn)行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所獲得的基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現(xiàn)有報道的各種抗體基因序列均不完全一致。所得VH與VL基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體CAb-2的基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療大腸癌腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明人應(yīng)用一套設(shè)計的擴(kuò)增引物成功地從培養(yǎng)的一株抗大腸癌特異性單抗CAb-2的雜交瘤細(xì)胞中克隆了其對應(yīng)抗體輕、重鏈可變區(qū)基因?；谏鲜龅膯慰寺】贵wCAb-2的輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達(dá)成多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷和治療大腸癌腫瘤的藥物?；谏鲜鯟Ab-2的輕、重鏈可變區(qū)基因所編碼的多肽產(chǎn)物，可以交聯(lián)上多種效應(yīng)分子，制備用于診斷和治療大腸癌腫瘤的藥物。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增的抗人大腸癌單抗CAb-2輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。(圖中M為DL-2000 Marker，1為含有CAb-2重鏈可變區(qū)的FD基因，2為CAb-2的全長輕鏈基因)。
圖2為抗人大腸癌單抗CAb-2輕鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。
圖3為抗人大腸癌單抗CAb-2重鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。
圖4利用獲得的CAb-2基因構(gòu)建Fab抗體表達(dá)載體示意圖。
圖5由CAb-2基因構(gòu)建Fab抗體的細(xì)胞(SW480)ELISA。
圖6由CAb-2基因構(gòu)建Fab抗體的細(xì)胞(SW480)免疫熒光。
具體實施例方式
(一)抗人大腸癌單抗CAb-2輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆所用細(xì)胞株為本發(fā)明人以新鮮的大腸癌組織勻漿免疫小鼠，采用傳統(tǒng)的融合方法而獲得的一株高親和力、高特異性的鼠源性抗人大腸細(xì)胞癌單抗CAb-2雜交瘤細(xì)胞株。其分泌的抗體不與CEA，17-1A，TAG-72，CEA，A33等腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合，是針對一種分子量約為200KD左右的新腫瘤相關(guān)糖蛋白抗原。其分泌的抗體分子亞型為IgG1κ。
取處于對數(shù)生長期的CAb-2雜交瘤細(xì)胞(5×106)，采用異硫氰酸胍一步法提取總RNA，取少量進(jìn)行紫外分光光度計定量及1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后以O(shè)ligo(dT)15(Promega公司)為隨機引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。然后，利用設(shè)計的一套引物分別進(jìn)行擴(kuò)增出該株大腸癌單抗CAb-2的全長輕鏈及重鏈Fd基因。將含有可變區(qū)基因(VH，VL)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％低溶點瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分離靶片段。通過凝膠純化試劑盒(promegaInc)回收純化后，凝膠電泳鑒定，參見附圖1。需要說明的是，圖1中所示的單抗CAb-2的重鏈FD基因是從信號肽序列位置獲得的。CAb-2單抗的輕鏈可變區(qū)基因也是從信號肽位置處擴(kuò)增的。之后，將目的片段克隆至T載體，測序分析，見附圖2，3。
Oligo(dT)15(Promega公司)為隨機引物的反轉(zhuǎn)錄方案如下20μL反應(yīng)體系中依次加入1μg總RNA(2μL)，0.5ug隨機引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL 5×dNTPs，2μL 10×緩沖液，0.5μL RNase抑制劑，加入反轉(zhuǎn)錄酶AMV 15U(0.75μL)，用水補至20μL，混勻，42℃水浴1h，煮沸3min，反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?br> PCR擴(kuò)增反應(yīng)按常規(guī)方法進(jìn)行以上述產(chǎn)物為模板，分別用5對重鏈引物和6對輕鏈引物擴(kuò)增大腸癌單抗CAb-2的全長輕鏈、重鏈Fd基因。反應(yīng)體系為模板cDNA 2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(約30pmol)，加水至50ul，混勻，瞬時離心后，加入1-2滴液體石蠟，置PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)條件94℃1min，54℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
設(shè)計的CAb-2單抗可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增引物序列如下小鼠重鏈V區(qū)5’端引物VH15’-GGG GAT ATC CAC CAT GG(AG)ATG(CG)AG CTG(TG)GT(CA)AT(CG)CT CTT-3’VH25’-GGG GAT ATC CAC CAT G(AG)A CTT CGG G(TC)T GAG CT(TG)GGT TTT-3’VH35’-GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT-3’VH45’-GGG GAT ATC CAC CAT GAT(AG)GT GTT(AG)AG TCT T(CT)T GT(AG)
CCT G3’H-FR15′-AGG T(GC)(AC)A(GA)C T(GT)C TCG AGT C(AT)GG-3′；小鼠重鏈V區(qū)3’端引物Fd3′5′-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3′；小鼠輕鏈V區(qū)5’端引物VL15’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT-3’VL25’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA AGT GCA GAT TTT CAG-3’VL35’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA G(AT)C ACA(GT)(AT)C TCG GGTCTT T(GA)T A-3’VL45’-GGG GAT ATC CAC CAT G(GT)C CCC(AT)(AG)C TCA G(CT)T C(CT)C T(TG)G T-3’VL55’-GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G-3’L-FR15′-GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC C-3′；小鼠輕鏈輕鏈3′端引物L(fēng)c3′5′-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3′；假基因剔除引物假基因5′端引物5′-TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC-3′；假基因3′端引物5′-TGT AAG CTC CCT AAT GTG CTG-3′。
目的片段T載體克隆測序方案如下將PCR產(chǎn)物凝膠電泳分離后回收，連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體1ul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水1ul，連接緩沖液5ul，混勻后4℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選重組克隆三個，然后采用通用測序引物進(jìn)行雙向測序反應(yīng)。測序結(jié)果見圖2和圖3。
進(jìn)一步對所克隆的抗人大腸癌單抗CAb-2輕、重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行序列分析如下
分別應(yīng)用下列二個數(shù)據(jù)庫http//imgt.cines.fr8104/cgi-bin/IMGTdnap.jvhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，對所得序列與現(xiàn)有已報道的其它各種抗體基因進(jìn)行進(jìn)行同源性比較，并分析其胚系基因來源，結(jié)果如下(1)CAb-2重鏈<400>1的胚系基因來源V-GENEAF304558 IGHV1S137*01；D-GENEIGHD-SP2.8*01；J-GENEIGHJ4*01；通過FR-IMGT and CDR-IMGT分析顯示CDR1GGC TAC ACA TTC ACT GAT TAT ACTCDR2ATT AAT ACT TAC TCT GGT AAT ACACDR3GTA AGG GGT AAC TCC GTG AGG AAT TAC TAT GTT ATG GAC TATNCBI中同源性比較結(jié)果顯示Request ID1067675793-16447-938607.BLASTQ3Sequences producing significant alignments(bits)Valuegi|8925314|gb|AF239196.1|AF239196 Synthetic constructBCL1...563 e-158gi|20860062|ref|XM_138370.1|Mus musculus similar toAHT107...515 e-143gi|243052|gb|S78361.1|S78361 AHT107 VH region＝chimericmous...488 e-135(2)CAb-2輕鏈<400>3胚系基因來源V-GENE AJ235950 IGKV12-89*01。
J-GENE V00777，IGKJ2*01。
通過FR-IMGT and CDR-IMGT分析顯示CDR1 GAG AAT ATT TAC GGT GCTCDR2 GGT GCA ACCCDR3 CAA AAT GTG TTA AGT GCT CCG TAC ACGNCBI中同源性比較結(jié)果顯示DatabaseAll GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)gi|20823634|ref|XM_144812.1|Mus musculus similar toimmuno...642 0.0gi|53721|emb|X58219.1|MMPKDE 32 M.musculusextrachromosomal...632 e-178gi|5327132|emb|AJ235950.1|MMU235950 Mus musculus IgVkf112...595 e-167上述分析結(jié)果表明所獲得的大腸癌單抗CAb-2基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現(xiàn)有報道的各種其它已知抗體基因均不完全一致，是屬于一種新的有功能的針對大腸癌的抗體基因。
(二)抗人大腸癌單抗CAb-2的FAb形式抗體的構(gòu)建和表達(dá)將噬粒表達(dá)載體pCOMB3中的GIII蛋白切除，與本發(fā)明所克隆的大腸癌單抗CAb-2的輕、重鏈可變區(qū)基因重組成可溶性FAb表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)(見圖4)。以人正常的大腸細(xì)胞為陰性對照，用ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物-可溶性FAb的活性(見圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所表達(dá)的可溶性FAb小分子抗體，只特異性與大腸癌細(xì)胞結(jié)合而不與正常的大腸細(xì)胞結(jié)合。另外，以此表達(dá)的可溶性FAb小分子抗體結(jié)合上述兩種細(xì)胞的免疫熒光實驗(見圖6)，表明所表達(dá)的可溶性FAb小分子抗體可特異性結(jié)合在大腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
(三)抗人大腸癌單抗CAb-2輕、重鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽產(chǎn)物在制備用于診斷或治療大腸(結(jié)腸、直腸)癌藥物中的應(yīng)用。
(1)以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因出發(fā)，可以重構(gòu)并表達(dá)成多種形式的蛋白藥物，可直接用于大腸(結(jié)腸、直腸)癌的診斷及治療。例如(1-1)嵌合抗體。是用鼠MAb的V區(qū)與人Ig的C區(qū)連接而成為人-鼠嵌合抗體。由于其完整地保留了鼠MAb的特異性和親和力，同時降低了HAMA等不良反應(yīng)，故在大腸癌的治療中顯示出良好的效果。(1-2)人源化抗體。針對可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸殘基鑲飾、骨架區(qū)交換、定位保留和表位導(dǎo)向選擇等，從而不但降低了可變區(qū)的鼠源性同時又保持了鼠MAb的特異性和親和力。(1-3)小分子抗體。主要有由VH-CH1和VL-C1組成Fab抗體(見圖4-6)、用一多肽(GLy4Ser)3接頭連接VH基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH和VL以非共價鍵結(jié)合而成Fv片段抗體、由VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體、由單個CDR構(gòu)成的最小識別單位等。(1-4)多價微型抗體。主要有雙鏈抗體、(ScFv)2、Flex微型抗體、LD微型抗體、F(ab’)2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多價抗原結(jié)合位點，親和力高，分子大小適中，既能穿透大腸癌組織，亦在腎臟中的清除率較慢的特點而具有較高的臨床應(yīng)用價值。(1-5)雙特異性抗體。是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體。(1-6)重組抗體融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，與非抗體的毒素或酶等其它蛋白基因連接形成的具有把特定的生物活性導(dǎo)向靶部位的一種重組蛋白。(1-7)重組免疫毒素。將編碼抗體和毒素的基因重組而產(chǎn)生，特點是高效，非特異毒性低，體內(nèi)穩(wěn)定性好，易穿透大腸癌腫瘤及體內(nèi)使用較安全。(1-8)噬菌體抗體。把Ig的V區(qū)基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達(dá)Fab或ScFv的融合蛋白產(chǎn)物。通過對此產(chǎn)物多輪相關(guān)抗原的親和吸附，從中淘篩出所需的更高親和力及更特異性的新抗體。
(2)以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽及其衍生物出發(fā)，可以交聯(lián)上細(xì)胞毒性藥物、毒素、放射性核素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等作為導(dǎo)向藥物，也可用于大腸(結(jié)腸、直腸)癌的診斷及治療。(2-1)抗體-核素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可將核素有效地導(dǎo)向大腸癌組織局部，從而減少了因放療外照射等引起的正常組織損傷及有關(guān)的不良反應(yīng)，并可對大腸腫瘤進(jìn)行定位診斷和導(dǎo)向治療。這種方法即為放射免疫顯像和放射免疫治療。與單抗偶聯(lián)的常用核素有125I，131I，111In，90Y，99Tcm，188Re和186Re等。(2-2)抗體-化療藥物偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物能特異地導(dǎo)向大腸癌腫瘤，可減低對正常組織的損傷，減少化療藥物的毒副作用。常偶聯(lián)的化療藥物如烷化劑中的磷酸酰胺；抗代謝中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素類阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素；植物類長春新堿、絲裂霉素等。(2-3)抗體-毒素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物又稱免疫毒素。其殺傷細(xì)胞作用強且不依賴于生物輔助機制。其殺傷大腸(結(jié)腸、直腸)癌腫瘤機制與放療，化療不同，所以一般放療、化療效果差的腫瘤可用，應(yīng)用前景廣闊。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、紅豆毒素、肥皂草毒素、假單孢菌外毒素、鏈球菌溶血素、穿孔素等。(2-4)抗體-生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)偶聯(lián)物。BRM單獨調(diào)節(jié)機體的免疫能力和殺傷腫瘤細(xì)胞已取得較好的療效。但由于其輸入體內(nèi)后僅有部分到達(dá)大腸(結(jié)腸、直腸)癌腫瘤靶部位，其殺傷作用得不到充分發(fā)揮且有毒副作用。將BRM與單抗偶聯(lián)，通過單抗攜帶其到達(dá)靶部位而發(fā)揮殺傷大腸癌的作用，使這些因子的作用更強，且更加專一。常用的BRM有INF和IL-2等。(2-5)抗體導(dǎo)向酶解前藥。將抗體與藥物專一性活化酶的偶聯(lián)物注入體內(nèi)，間隔一定時間后注入前藥，使其在大腸癌腫瘤部位轉(zhuǎn)化成高濃度抗癌活性藥以殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，可作為前藥的有苯甲酸氫芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸絲裂霉素、葡糖苷酸柔紅霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和頭孢菌素氮芥等?；罨赣恤入拿窯2、堿性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。(2-6)免疫脂質(zhì)體。將MAb偶聯(lián)到脂質(zhì)體的表面能充分將MAb與抗原特異性結(jié)合的導(dǎo)向性及脂質(zhì)體能包裹大量藥物的特性融為一體，再包埋上有關(guān)藥物，則可提高藥物靶向性和療效。
(3)另外，以本發(fā)明所述的大腸癌CAb-2單抗，還可以應(yīng)用于大腸癌相關(guān)抗原的基礎(chǔ)研究，或用于發(fā)現(xiàn)新的大腸癌腫瘤相關(guān)抗原或已知大腸癌腫瘤抗原的新表位。這些抗原均可進(jìn)一步用于臨床血清學(xué)檢查，具有一定的臨床診斷意義。
權(quán)利要求
1.抗人大腸(結(jié)腸、直腸)癌單克隆抗體CAb-2的重鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>1的序列，輕鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>3的序列。
2.由權(quán)利要求1所述的基因編碼的多肽，其具有序列表<400>2和4的序列。
3.權(quán)利要求1所述的基因在制備用于診斷或治療大腸(結(jié)腸、直腸)癌藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的多肽在制備用于診斷或治療大腸(結(jié)腸、直腸)癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人大腸癌單克隆抗體CAb－2的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷或治療大腸癌(結(jié)腸、直腸)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人應(yīng)用一套設(shè)計的擴(kuò)增引物成功地從培養(yǎng)的一株抗大腸癌特異性單抗CAb－2的雜交瘤細(xì)胞中克隆了其對應(yīng)抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。基于上述基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達(dá)成多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷或治療大腸(結(jié)腸、直腸)癌的藥物?；谏鲜龌蛩幋a的多肽，可以交聯(lián)上多種效應(yīng)分子，制備用于診斷或治療大腸(結(jié)腸、直腸)癌的藥物。
文檔編號C07K16/18GK1546527SQ200310118928
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者陳志南, 邢金良, 楊向民, 張思河 申請人:陳志南