專利名稱：結(jié)合域－免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及具有免疫學(xué)活性的重組結(jié)合蛋白，具體涉及分子工程化的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，包括單鏈Fv-免疫球蛋白融合蛋白。本發(fā)明也涉及用于治療惡性狀況和B細(xì)胞疾病，包括特征在于自身抗體產(chǎn)生的疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白分子由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成，它們通過鏈間二硫鍵連接成大分子復(fù)合物。鏈內(nèi)二硫鍵連接相同多肽鏈的不同區(qū)域，這導(dǎo)致形成環(huán)，該環(huán)與鄰近的氨基酸構(gòu)成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈和每條重鏈具有單個(gè)可變區(qū)，該區(qū)表現(xiàn)出抗體之間氨基酸組成的很大變異。輕鏈可變區(qū)VL與重鏈可變區(qū)VH締合，形成免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)Fv。輕鏈具有單個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，重鏈有幾個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。IgG，IgA和IgD具有三個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，稱為CH1，CH2和CH3，IgM和IgE具有四個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白重鏈可以分為三個(gè)功能區(qū)Fd、鉸鏈區(qū)和Fc。Fd區(qū)包含VH和CH1結(jié)構(gòu)域，與輕鏈一起形成Fab。Fc片段一般認(rèn)為負(fù)責(zé)免疫球蛋白的效應(yīng)物功能，例如，補(bǔ)體固定和結(jié)合與Fc受體。在IgG，IgA和IgD中發(fā)現(xiàn)的鉸鏈區(qū)作為柔性的間隔基，允許Fab部分在空間中自由移動(dòng)。與恒定區(qū)相反，鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)多樣，各類和亞類的免疫球蛋白之間序列和長度都有變化。例如，人類IgG的三種亞類，IgG1，IgG2和IgG4具有12-15個(gè)氨基酸的鉸鏈區(qū)，而IgG3含有約62個(gè)氨基酸，包括21個(gè)脯氨酸殘基和11個(gè)半胱氨酸殘基。根據(jù)結(jié)晶學(xué)研究，鉸鏈區(qū)可進(jìn)一步根據(jù)功能細(xì)分為三個(gè)區(qū)上鉸鏈區(qū)、核心和下鉸鏈區(qū)(Shin et al.，Immunological Reviews 13087(1992))。上鉸鏈區(qū)包含CH1的羧基端的氨基酸至限制運(yùn)動(dòng)的鉸鏈區(qū)的第一個(gè)殘基，一般是第一個(gè)半胱氨酸殘基，它在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。上鉸鏈區(qū)的長度與抗體的片段柔性相關(guān)。核心鉸鏈區(qū)含有重鏈間二硫鍵，下鉸鏈區(qū)連接CH2結(jié)構(gòu)域的氨基末端并且包含CH2中的殘基。(Id.)人IgG的核心鉸鏈區(qū)含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，當(dāng)形成而二硫鍵時(shí)，該序列形成一個(gè)環(huán)狀八肽，人們認(rèn)為該八肽作為一個(gè)軸，由此賦予柔性。鉸鏈區(qū)也可以含有碳水化合物附著位點(diǎn)。例如，IgA1在鉸鏈區(qū)的一個(gè)17氨基酸的片段中含有5個(gè)碳水化合物位點(diǎn)，它們賦予了鉸鏈區(qū)對腸蛋白酶的例外抗性，這被認(rèn)為是分泌性免疫球蛋白的有利特征。
鉸鏈區(qū)的結(jié)構(gòu)和柔性所允許的構(gòu)象改變可以影響抗體的Fc部分的效應(yīng)物功能。與Fc區(qū)相關(guān)的效應(yīng)物功能的三個(gè)大類包括(1)激活經(jīng)典的補(bǔ)體級聯(lián)，(2)與效應(yīng)分子相互作用和(3)免疫球蛋白的區(qū)室化。不同的人IgG亞類在其激活和擴(kuò)增補(bǔ)體劑量的步驟的相對效力方面有所不同。一般說來，IgG1和IgG3最有效固定補(bǔ)體，IgG2效力較低，而IgG4不激活補(bǔ)體。補(bǔ)體激活是由C1q與抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合起始的，C1q是級聯(lián)中的第一個(gè)成分C1的一個(gè)亞基。盡管C1q的結(jié)合位點(diǎn)位于抗體的CH2結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)影響抗體激活級聯(lián)的能力。例如，缺乏鉸鏈區(qū)的重組免疫球蛋白不能激活補(bǔ)體。(Id.)如果沒有鉸鏈區(qū)所賦予的柔性，與抗原結(jié)合的抗體的Fab部分可能不能采用允許C1q與CH2結(jié)合所需的構(gòu)象。(見id.)研究表明，鉸鏈區(qū)長度和片段柔性與補(bǔ)體激活相關(guān)；然而，該相關(guān)不是絕對的。具有與IgG4相同的剛性的改變的鉸鏈區(qū)的人IgG3分子仍然有效激活該級聯(lián)。
鉸鏈區(qū)的缺乏也影響人IgG免疫球蛋白結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的能力。免疫球蛋白與Fc受體的結(jié)合促進(jìn)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，它被推定為消除腫瘤細(xì)胞的重要方式。人IgG Fc受體家族被分為三組，即，能夠結(jié)合具有高親和性的IgG的FcγRI(CD64)、都是低親和性受體的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。三種受體的每一種和免疫球蛋白之間的分子相互作用還沒有精確確定，但實(shí)驗(yàn)表明，CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近端區(qū)中的殘基對抗體和Fc受體之間的相互作用的特異性是重要的。此外，IgG1骨髓瘤蛋白和缺乏鉸鏈區(qū)的重組IgG3嵌合抗體不能結(jié)合FcγRI，很可能是因?yàn)閷H2的可接近性減少(Shin et al.，Intern.Rev.Immunol.10177，178-79(1993))。
單克隆抗體技術(shù)和基因工程方法導(dǎo)致了用于診斷和治療人疾病的免疫球蛋白分子的迅速開發(fā)。已經(jīng)應(yīng)用了蛋白工程改進(jìn)抗體與其關(guān)聯(lián)抗原的親和性，以減少與免疫原性相關(guān)的問題，并且改變抗體的效應(yīng)物功能。免疫球蛋白的域結(jié)構(gòu)容易順應(yīng)工程化，這是由于抗原結(jié)合域和賦予效應(yīng)物功能的結(jié)構(gòu)域可以在免疫球蛋白種類和亞類之間交換。
此外，構(gòu)建了較小的免疫球蛋白分子，以克服與完整的免疫球蛋白的治療相關(guān)的問題。單鏈Fv(scFv)包含通過短的接頭肽與輕鏈可變區(qū)連接的重鏈可變區(qū)(Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-83，1988)。由于scFv分子較小，它們表現(xiàn)出很快從血漿和組織清除，并且比完整免疫球蛋白更有效穿透到組織中?？鼓[瘤scFv表現(xiàn)出與相應(yīng)嵌合抗體更迅速的腫瘤穿透和在腫瘤團(tuán)塊中更平均的分布(Yokota et al.，Cancer Res.52，3402-08(1992))。ScFv與另一種分子，如毒素的融合利用了特異性的抗原結(jié)合活性和scFv的小尺寸而將毒素遞送到靶組織(Chaudary et al.，Nature 339394(1989)；Batra et al.，Mol.Cell.Biol.112200(1991))。
盡管scFv分子的優(yōu)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了血清療法，該治療方法仍存在一些缺陷。盡管scFv的迅速清除可以減少在正常細(xì)胞中的毒性作用，這種迅速清除可能阻礙向靶組織遞送最小的有效劑量。由于不利影響產(chǎn)量的表達(dá)和分離的困難，制備足量的用于給予患者的scFv是具有挑戰(zhàn)性的。在表達(dá)過程中，scFv分子缺乏穩(wěn)定性并且由于不同分子的可變區(qū)的配對而經(jīng)常聚集。此外，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的scFv分子的產(chǎn)量水平低，因此限制了有效制備用于治療的scFv分子的可能性(Daviset al，J Biol.Chem.26510410-18(1990)；Traunecker et al.，EMBO J103655-59(1991))。已經(jīng)探索了改進(jìn)產(chǎn)量水平的策略，包括向可變區(qū)添加糖基化位點(diǎn)(Jost，C.R.US Patent & num；5,888,773，Jost et al，J.Biol.Chem.26926267-73(1994))。
毒素與scFV的偶聯(lián)或融合提供了非常強(qiáng)效的分子，但由于毒素分子的毒性，給藥是有限的。毒性作用包括升高肝酶和血管滲漏綜合征。此外，免疫毒素是高度免疫原性的，并且抗毒素的宿主抗體限制了其用于重復(fù)治療的可能性。
使用scFv進(jìn)行治療的其它缺點(diǎn)是缺乏效應(yīng)物功能。與免疫球蛋白恒定區(qū)締合的，沒有細(xì)胞毒性功能、ADCC和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的scFv可能對于治療疾病是無效的。盡管scFv的開發(fā)技術(shù)已經(jīng)開始了12年多，目前還沒有scFv被批準(zhǔn)用于治療。
對疾病治療的抗體恒定區(qū)相關(guān)效應(yīng)物功能促進(jìn)了融合蛋白的開發(fā)，其中用非免疫球蛋白序列取代了抗體可變區(qū)。例如，由HIV識別的T細(xì)胞表面蛋白CD4被重組融合于免疫球蛋白Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域(見Sensel et al.，Chem.Immunol.65129158(1997))。這種分子的生物學(xué)活性將部分依賴于所選擇的恒定區(qū)的類或亞類。IL-2-IgG1融合蛋白實(shí)現(xiàn)了補(bǔ)體介導(dǎo)的具有IL-2受體的細(xì)胞的裂解(見id.)。用免疫球蛋白恒定區(qū)構(gòu)建這些和其它融合蛋白也可以賦予改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。
認(rèn)為容易順應(yīng)于一些類型的免疫球蛋白治療的疾病和紊亂包括癌癥和免疫系統(tǒng)紊亂。癌癥包括寬范圍的疾病，影響全世界大約四分之一的個(gè)體。惡性細(xì)胞的迅速和得到上調(diào)的增殖是許多癌癥，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的特點(diǎn)。在過去的20年中，具有血液系統(tǒng)惡性狀況的患者從癌癥治療的進(jìn)展得到了最多的益處(Multani et al.，J.Clin.Oncology 163691-3710，1998)。盡管緩解率增加，大多數(shù)患者仍然復(fù)發(fā)并且難以治愈其疾病。用細(xì)胞毒性藥物治療的障礙包括腫瘤細(xì)胞抗性和化療的高毒性，這阻礙了許多患者的最佳給藥?；趯?dǎo)向于特異性結(jié)合惡性細(xì)胞的分子，包括單克隆抗體(mAbs)的新治療可以改進(jìn)有效性而不增加毒性。
由于首先在1975年記載了單克隆抗體(Kohler et al.，Nature 25649597(1975))，已經(jīng)用腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的單克隆抗體治療了許多患者。這些研究產(chǎn)生了關(guān)于選擇適于治療的靶抗原的重要經(jīng)驗(yàn)。首先，也是最重要的，關(guān)鍵的正常組織不應(yīng)該表達(dá)靶抗原。幸運(yùn)的是，血液系統(tǒng)惡性細(xì)胞表達(dá)許多在干細(xì)胞或其它關(guān)鍵細(xì)胞上不表達(dá)的抗原。減少了正常和血液系統(tǒng)來源的惡性細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性狀況的治療已經(jīng)被接受，因?yàn)樵谥委熃Y(jié)束后發(fā)生了從祖細(xì)胞再生正常細(xì)胞。其次，靶抗原應(yīng)該在所有克隆發(fā)生的腫瘤細(xì)胞群上都表達(dá)，并且盡管存在來自于免疫球蛋白治療的選擇壓力，該表達(dá)應(yīng)該持續(xù)。因此，盡管抗原表現(xiàn)出高度的腫瘤選擇性，具有改變的獨(dú)特型表達(dá)的腫瘤細(xì)胞變體的生長限制了用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤的表面獨(dú)特型的選擇(Meeker et al.，N.Engl.J Med.3121658-65(1985))。第三，所選擇的抗原在與免疫球蛋白結(jié)合后必須適當(dāng)運(yùn)輸。免疫球蛋白結(jié)合抗原后靶抗原的脫落或內(nèi)化可以允許腫瘤細(xì)胞逃脫破壞，從而限制血清療法的有效性。第四，免疫球蛋白與傳送激活信號的靶抗原的結(jié)合可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中的功能性應(yīng)答，從而導(dǎo)致生長停滯和凋亡。盡管所有的這些特征都是重要的，免疫球蛋白結(jié)合抗原后凋亡的引發(fā)可能是達(dá)到成功的血清療法的關(guān)鍵因素。
已經(jīng)驗(yàn)證作為B和T細(xì)胞惡性腫瘤的血清療法的靶點(diǎn)的抗原包括Ig獨(dú)特型(Brown et al.，Blood 73651-61(1989))，CD19(Hekman et al.，Cancer Immunol.Immunother.32364-72(1991)；Vlasveld et al.，Cancer Immunol.Immunother.4037-47(1995))，CD20(Press et al.，Blood 69584-91(1987)；Maloney et al.，J；Clin.Oncol.153266-74，(1997))，CD21(Scheinberg et.al.，J Clin.Oncol.8792-803，(1990))，CD5(Dillman et.al.，J Biol.Respn.Mod.5394-410(1986))，和CD52(CAMPATH)(Pawson et al.，J Clin.Oncol.152667-72，(1997))。其中，用CD20作為B細(xì)胞淋巴瘤的治療靶獲得了最大的成功。其它靶的每一種受到了抗原的生物學(xué)特征的限制。例如，通過體細(xì)胞突變可以改變表面獨(dú)特型，允許腫瘤細(xì)胞逃脫。在單克隆抗體結(jié)合后，CD5，CD21和CD19被迅速內(nèi)化，允許腫瘤細(xì)胞逃脫破壞，除非單克隆抗體與毒素分子偶聯(lián)。CD22僅在B細(xì)胞淋巴瘤的一個(gè)亞型上表達(dá)，而CD52在T細(xì)胞和B細(xì)胞上都表達(dá)，并且由T細(xì)胞減少產(chǎn)生免疫抑制。
CD20實(shí)現(xiàn)了上述為治療B細(xì)胞惡性狀況而選擇適當(dāng)?shù)陌锌乖幕緲?biāo)準(zhǔn)。用嵌合CD20單克隆抗體在許多患者中誘導(dǎo)了部分或完全的反應(yīng)(McLaughlin et al，Blood 8890a(abstract，suppl.1)(1996)；Maloney et al，Blood 902188-95(1997))。然而，在6個(gè)月到1年內(nèi)通常發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)血清療法以誘導(dǎo)低分級B細(xì)胞淋巴瘤的更持續(xù)反應(yīng)，并且允許有效治療高分級淋巴瘤和其它B細(xì)胞疾病。
改進(jìn)CD20血清療法的一種方法是用CD20的特異性單克隆抗體將放射性同位素導(dǎo)向于B細(xì)胞淋巴瘤。盡管治療的有效性增加，與放射性抗體的長體內(nèi)半衰期相關(guān)的毒性也增加，有時(shí)要求患者進(jìn)行干細(xì)胞拯救(Press et al.，N.Eng.J Med.3291219-1224，1993；Kaminski etal.，N.Eng.J Med.329459-65(1993))。用蛋白酶切割了CD20的單克隆抗體以便在連接于放射性同位素之前產(chǎn)生F(ab′)2或Fab片段。這改進(jìn)了放射性同位素偶聯(lián)物穿透進(jìn)入腫瘤，并且縮短了體內(nèi)半衰期，從而減少了對正常組織的毒性。然而，CD20單克隆抗體的Fc區(qū)提供的效應(yīng)物功能，包括補(bǔ)體固定和ADCC的優(yōu)點(diǎn)卻喪失。因此，為改進(jìn)放射性同位素的遞送，需要一種策略來制備保留了Fc依賴性效應(yīng)物功能，但尺寸更小的CD20單克隆抗體衍生物，從而增加腫瘤穿透并縮短單克隆抗體半衰期。
CD20是第一個(gè)由單克隆抗體鑒定的人B細(xì)胞系特異性表面分子，但CD20在B細(xì)胞生物學(xué)中的功能仍然沒有完全了解。CD20是非糖基化的，疏水的35Kda的磷酸蛋白，具有在細(xì)胞質(zhì)中的氨基和羧基端(Einfeld et al，EMBO J.7711-17(1988))。還沒有鑒定CD20的天然配體。CD20由所有正常的成熟B細(xì)胞，但前體B細(xì)胞不表達(dá)。
CD20單克隆抗體向正常B細(xì)胞遞送影響存活力和生長的信號(Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494-98(1986))。最近的數(shù)據(jù)表明，CD20的廣泛交聯(lián)可以誘導(dǎo)B淋巴瘤細(xì)胞系的凋亡(Shan etal.，Blood 911644-52(1998))。細(xì)胞表面的CD20的交聯(lián)增加信號傳導(dǎo)的強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)，這是通過測量酪氨酸殘基上的細(xì)胞底物的磷酸化而檢測的(Deans et al.，J.Immunol.146846-53(1993))。重要的是，通過加入Fc受體陽性細(xì)胞而交聯(lián)CD20單克隆抗體也誘導(dǎo)Ramos淋巴瘤細(xì)胞的凋亡(Shan et al.，Blood 911644-52(1998))。因此，除了通過補(bǔ)體和ADCC機(jī)制減少細(xì)胞，F(xiàn)c受體與CD20單克隆抗體的體內(nèi)結(jié)合可以通過CD20交聯(lián)而促進(jìn)惡性B細(xì)胞的凋亡。這一理論與表明SCID小鼠模型中人淋巴瘤的CD20治療有效性依賴于CD20單克隆抗體對Fc受體的結(jié)合的實(shí)驗(yàn)相一致(Funakoshi et al.，J.Immunotherapy 1993-101(1996))。
CD20多肽含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Einfeld et al.，EMBO J 7711-17，(1988)；Stamenkovic et al.，J.Exp.Med.1671975-80(1988)；Tedder et.al.，J Immunol.1414388-4394(1988))。多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域防止了抗體結(jié)合后的CD20內(nèi)化。CD20的該特性被識別為當(dāng)給B細(xì)胞淋巴瘤患者注射鼠CD20單克隆抗體1F5時(shí)B細(xì)胞惡性腫瘤的有效治療的重要特征，這導(dǎo)致惡性細(xì)胞的顯著減少和部分臨床反應(yīng)(Press et al.，Blood69584-91(1987))。
由于正常成熟B細(xì)胞也表達(dá)CD20，CD20抗體治療時(shí)正常B細(xì)胞減少(Reff，M.E.et al，Blood 83435-445，1994)。然而，治療完成后，從CD20陰性B細(xì)胞前體再生正常B細(xì)胞；因此，用抗CD20療法治療的患者不經(jīng)歷嚴(yán)重的免疫抑制。在涉及自身抗體的不適當(dāng)產(chǎn)生的疾病或B細(xì)胞可能起作用的其它疾病中，正常B細(xì)胞的減少可能是有益的。由與人IgG1重鏈和人κ輕鏈恒定區(qū)融合的小鼠來源的重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的CD20的特異性嵌合單克隆抗體保留了與CD20的結(jié)合和介導(dǎo)ADCC以及固定補(bǔ)體的能力(Liu et al.，J.Immunol.1393521-26(1987)；Robinson et al.，U.S.Patent No.5,500,362)。該研究導(dǎo)致了嵌合CD20單克隆抗體RituximabTM的開發(fā)，目前已經(jīng)被美國食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于B細(xì)胞淋巴瘤的治療。盡管RituximabTM治療后經(jīng)常觀察到臨床反應(yīng)，患者通常在約6-12個(gè)月后復(fù)發(fā)。
靜脈注射需要高劑量的RituximabTM，因?yàn)樵摲肿邮谴蠹s150kDa的大分子，并且擴(kuò)散限制于進(jìn)入許多腫瘤細(xì)胞存留的淋巴組織。人們認(rèn)為RituximabTM的抗腫瘤活性機(jī)制是幾種活性的結(jié)合，包括ADCC、補(bǔ)體固定和在惡性B細(xì)胞中激發(fā)促進(jìn)凋亡的惡性B細(xì)胞。RituximabTM的大尺寸防止了該分子進(jìn)入含有惡性B細(xì)胞的淋巴組織的最優(yōu)擴(kuò)散，從而限制了這些抗腫瘤活性。如前面所討論，用蛋白酶切割為Fab或F(ab′)2片段使它們更小，并且更容易穿透到淋巴組織中，但失去了對于抗腫瘤活性來說很重要的效應(yīng)物功能。盡管CD20mAb片段可能比完整抗體在遞送放射性同位素方面更有效，但仍然需要構(gòu)建保留Fc部分的效應(yīng)物功能，但更小的CD20mAb衍生物，以促進(jìn)更好的腫瘤穿透并導(dǎo)致更短的半衰期。
CD20由B細(xì)胞來源的惡性細(xì)胞，包括B細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)表達(dá)。CD20不被惡性的前B細(xì)胞，例如急性成淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)。因此CD20是治療B細(xì)胞淋巴瘤、CLL和B細(xì)胞參與疾病活性的其它疾病的良好靶點(diǎn)。其它B細(xì)胞疾病包括在B細(xì)胞分化為血漿細(xì)胞期間產(chǎn)生自身抗體的自身免疫病。B細(xì)胞疾病的例子包括自身免疫性甲狀腺疾病，包括格雷夫斯病和橋本氏甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)、多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無力(MG)、牛皮癬、硬皮病和炎性腸病，包括克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
從上文中看出，確實(shí)需要用于治療惡性狀況和B細(xì)胞疾病的改進(jìn)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法通過提供結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白而克服了先有技術(shù)的限制，該融合蛋白包含與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽，該鉸鏈區(qū)多肽與免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)多肽融合，CH2恒定區(qū)多肽與免疫球蛋白腫瘤CH3恒定區(qū)多肽融合，其中結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白能夠介導(dǎo)ADCC或補(bǔ)體固定。此外，該組合物和方法提供了其它相關(guān)的益處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面提供了結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽，其中所述鉸鏈區(qū)多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基并且來源于具有一個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(ii)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于具有兩個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區(qū)多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽和(v)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽；(b)與鉸鏈區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)；和(c)與CH2恒定區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽，其中(1)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和補(bǔ)體固定的免疫活性，并且(2)結(jié)合域多肽能夠特異性結(jié)合于抗原。在一種實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽是一種突變的鉸鏈區(qū)多肽，并且相對于野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區(qū)多肽，表現(xiàn)出二聚化的能力降低。在另一種實(shí)施方案中，結(jié)合域多肽包括至少一種是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)多肽或免疫球蛋白重鏈可變區(qū)多肽的免疫球蛋白可變區(qū)多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫球蛋白可變區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白。
在另一種實(shí)施方案中，結(jié)合域Fv-免疫球蛋白融合蛋白的結(jié)合域多肽包含(a)至少一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)多肽；(b)至少一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)多肽；和(c)至少一種與(a)的多肽和與(b)的多肽融合的接頭肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白。
在另一種實(shí)施方案中，至少一種免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白重鏈。在另一種實(shí)施方案中，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH2和CH3多肽屬于選自人IgG和人IgA的同種型。在另一種實(shí)施方案中，抗原選自CD19，CD20，CD37，CD40和L6。在上述融合蛋白的某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，接頭肽包括至少一種具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的多肽，在某些其它實(shí)施方案中，接頭肽包括具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的多肽的至少三次重復(fù)。在某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽包括人IgA鉸鏈區(qū)多肽。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合域多肽包括CD154胞外域。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合域多肽包括CD154胞外域和至少一種免疫球蛋白可變區(qū)多肽。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種編碼上述任意一種結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的分離的多核苷酸，并且在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含這種多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體，并且在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用這種重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)在允許結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；和(b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白。
本發(fā)明也在某些實(shí)施方案中提供了含有與生理可接受載體組合的上述結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的藥物組合物。在另一種實(shí)施方案中，提供了一種治療具有或懷疑具有惡性狀況或B細(xì)胞疾病的受試者的方法，包括給予患者治療有效量的上述結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，惡性狀況或B細(xì)胞疾病是B細(xì)胞淋巴瘤或以自身抗體產(chǎn)生為特征的疾病，并且在某些其它的實(shí)施方案中，惡性狀況或B細(xì)胞疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、格雷夫斯病、I型糖尿病、多發(fā)性硬化或自身免疫病。
參考以下發(fā)明詳述和附圖將更明確本發(fā)明的這些和其它方面。在此引入此處公開的所有參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容作為參考，如同單獨(dú)引入每一篇。


圖1表示一種能夠特異性結(jié)合CD20的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7scFv-Ig的DNA和推測的氨基酸序列[SEQ ID NO15]。
圖2表示通過轉(zhuǎn)染的、穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的2H7 scFv-Ig的水平和通過純化的2H7 scFv-Ig與表達(dá)CD20的CHO細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3表示分離的2H7scFv-Ig蛋白的多個(gè)制備物的SDS-PAGE分析。
圖4表示由2H7scFv-Ig進(jìn)行的補(bǔ)體固定(圖4A)和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC，圖4B)。
圖5表示CD20和CD40的同時(shí)連接對正常B細(xì)胞生長的作用。
圖6表示CD20和CD40的同時(shí)連接對B類淋巴母細(xì)胞系中CD95表達(dá)和凋亡誘導(dǎo)的作用。
圖7表示能夠特異性結(jié)合CD20和CD40的2H7scFv-CD154L2(圖7A，SEQ ID NO33)和2H7scFv-CD154S4(圖7B，SEQ ID NO34)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA和推測氨基酸序列。
圖8表示通過流式細(xì)胞術(shù)測定的2H7scFv-CD154結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白與CD20+CHO細(xì)胞的結(jié)合。
圖9表示2H7scFv-CD154結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白與細(xì)胞結(jié)合后膜聯(lián)蛋白V與B細(xì)胞系Ramos，BJAB和T51的結(jié)合。
圖10表示2H7scFv-CD154結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白結(jié)合后對B細(xì)胞系T51的作用。
圖11分別圖示了稱作CytoxB或CytoxB衍生物的2H7ScFv-Ig融合蛋白[SEQ ID NOS17、16和18]CytoxB-MHWTG1C(2H7 ScFv，突變的鉸鏈區(qū)，野生型人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域)，CytoxB-MHMG1C(2H7ScFv，突變的鉸鏈區(qū)，突變的人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域)和CytoxB-IgAHWTHG1C(2H7 ScFv，人IgA來源的鉸鏈區(qū)，野生型人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域)的結(jié)構(gòu)。箭頭表示認(rèn)為對FcR結(jié)合和ADCC活性(粗箭頭)、以及補(bǔ)體固定(細(xì)箭頭)起作用的氨基酸殘基的位置編號。注意沒有鏈間二硫鍵。
圖12表示分離的CytoxB和2H7scFv-CD154結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的SDS-PAGE分析。
圖13表示CytoxB衍生物的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
圖14表示CytoxB衍生物的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
圖15表示獼猴血樣中CytoxB-MHWTG1C的血清半衰期確定。
圖16表示CytoxB-MHWTG1C對獼猴血樣中循環(huán)的CD40+B細(xì)胞水平的作用。
圖17表示轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的HD37(CD19特異性的)ScFv-Ig產(chǎn)量水平，以及通過純化的HD37 ScFv-Ig與表達(dá)CD19的細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖18表示轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系的L6(癌抗原)ScFv-Ig產(chǎn)量水平，以及通過純化的L6 ScFv-Ig與表達(dá)L6抗原的細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖19表示結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7 ScFv-Ig，HD37ScFv-Ig和G28-1(CD37特異性)ScFv-Ig的ADCC活性。
圖20表示L6 ScFv-Ig融合蛋白的ADCC活性。
圖21表示L6 ScFv-Ig和2H7 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
圖22表示G28-1 ScFv-Ig和HD37 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及用于免疫治療和免疫診斷應(yīng)用，并且提供比現(xiàn)有技術(shù)的抗原特異性多肽更有某些優(yōu)勢的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選是在相關(guān)部分包含以下融合結(jié)構(gòu)域的單多肽鏈結(jié)合域多肽、免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽、免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白是或來源于人基因序列的產(chǎn)物，但本發(fā)明不需要限制于此，并且實(shí)際上可以涉及此處提供的來源于任何天然或人工來源的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，包括基因工程化和/或突變的多肽。
本發(fā)明部分涉及出人意料的觀察結(jié)果，即，此處描述的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白具有免疫學(xué)活性。更具體地，盡管具有預(yù)計(jì)不能促進(jìn)效應(yīng)物活性的結(jié)構(gòu)，這些蛋白保留了參與公知的免疫學(xué)效應(yīng)物活性的能力，所述活性包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC，例如細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后，在適當(dāng)條件下募集和誘導(dǎo)具有適當(dāng)Fc受體的細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，如具有FcRγIII的天然殺傷(NK)細(xì)胞)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性中的補(bǔ)體固定(CDC，例如細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后，募集和激活作為血液補(bǔ)體級聯(lián)成分的細(xì)胞裂解蛋白)。如下文的更詳細(xì)描述，ADCC和CDC是包含免疫球蛋白重鏈區(qū)的單體蛋白的預(yù)料不到的功能，選用于該融合蛋白的結(jié)構(gòu)，特別是對不利于它們形成鏈間同二聚體二硫鍵的能力的鉸鏈區(qū)多肽的選擇有利于該功能。
本發(fā)明提供的另一優(yōu)點(diǎn)是能以大量產(chǎn)生的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽，其產(chǎn)量一般大于用現(xiàn)有技術(shù)的單鏈抗體構(gòu)建體常規(guī)獲得的量。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)，這提供了以下優(yōu)點(diǎn)，即提供了體內(nèi)(例如在生理?xiàng)l件下)穩(wěn)定的多肽。根據(jù)非限制性的理論，這種穩(wěn)定性可能部分來源于融合蛋白的翻譯后修飾和特異性糖基化。已經(jīng)在靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)物中通過重組哺乳動(dòng)物表達(dá)而以每升培養(yǎng)物上清液大于50mg蛋白的水平產(chǎn)生了本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，在這種培養(yǎng)物中一般觀察到的產(chǎn)量是10-50mg/l，因此在靜態(tài)培養(yǎng)條件下優(yōu)選可以產(chǎn)生至少10-50mg/l；也考慮了用本領(lǐng)域接受的大規(guī)模方法如“補(bǔ)料分批”(即非靜態(tài))生產(chǎn)方法增加融合蛋白的產(chǎn)量，獲得了至少5-500mg/l的產(chǎn)量，在一些情況下為至少0.5-1g/l，取決于特定的蛋白產(chǎn)物。
本發(fā)明的結(jié)合域多肽可以是具有特異性識別和結(jié)合相關(guān)生物分子或一種以上分子的復(fù)合物或這種分子的穩(wěn)定或瞬時(shí)組裝物或聚集物的能力的任何多肽，所述分子包括蛋白、多肽、氨基酸或其衍生物；脂質(zhì)、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖等或其衍生物等；或其任意組合，例如，糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂等；或可能存在于生物學(xué)樣品中的任意其它生物分子?？梢酝ㄟ^從受試者或生物來源獲得血樣、活檢標(biāo)本、組織外植體、器官培養(yǎng)物、生物流體或任意其它組織或細(xì)胞制備物而提供生物學(xué)樣品。受試者或生物來源可以是人或非人動(dòng)物、原代細(xì)胞培養(yǎng)物或適合培養(yǎng)的細(xì)胞系，包括但不限于可能含有染色體整合或附加型重組核酸序列的基因工程化的細(xì)胞系、永生化的可永生化的細(xì)胞系、體細(xì)胞雜交細(xì)胞系、分化的或可分化的細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系等。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者或生物來源可以被懷疑或患有此處所述的惡性狀況或B細(xì)胞疾病，或者具有患此處所述的惡性狀況或B細(xì)胞疾病的風(fēng)險(xiǎn)，在某些進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中可以是自身免疫病，在本發(fā)明的某些其它優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者或生物來源可以已知沒有患所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)，或沒有該疾病。
因此，結(jié)合域多肽可以是任何天然存在或重組產(chǎn)生的此處提供的相關(guān)生物分子的結(jié)合配偶體，該相關(guān)生物分子是感興趣的靶結(jié)構(gòu)，此處稱作“抗原”，但根據(jù)本發(fā)明的公開，意欲包括任何需要使本發(fā)明的融合蛋白特異性與其結(jié)合的靶生物分子。如果結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白以大于或等于約104M-1，優(yōu)選大于或等于約105M-1，更優(yōu)選大于或等于約106M-1，更優(yōu)選大于或等于約107M-1的Ka結(jié)合需要的靶分子，則該結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白定義為“免疫特異性”或能夠特異性結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的親和力可以使用常規(guī)技術(shù)，例如描述于Scatchard et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.51660(1949)中的技術(shù)容易測定。也可以使用任何已知用于鑒定和獲得特異性與其它蛋白或多肽相互作用的蛋白的方法，例如美國專利5,283,173和美國專利5,468,614，或其同族專利等描述的酵母雙雜交篩選系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白與感興趣的靶抗原結(jié)合的這種測定。
本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案包括含有至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)多肽的結(jié)合域，所述可變區(qū)多肽例如重鏈或輕鏈可變區(qū)的所有或部分或片段，前提是它能夠特異性結(jié)合于抗原或此處描述的感興趣的其它需要的靶結(jié)構(gòu)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合域包含一個(gè)單鏈免疫球蛋白來源的Fv產(chǎn)物，它可以包含至少一種免疫球蛋白輕鏈V區(qū)的所有或一部分和至少一種免疫球蛋白重鏈V區(qū)的所有或一部分；并且進(jìn)一步包含與V區(qū)融合的接頭；此處更詳細(xì)描述了所述構(gòu)建體的制備和檢驗(yàn)，并且這也是本領(lǐng)域公知的。其它結(jié)合域多肽可以包括保留了特異性結(jié)合于此處提供的抗原的能力的任何蛋白或其部分，包括非免疫球蛋白。因此本發(fā)明考慮了包含來源于以下成分的結(jié)合域多肽的融合蛋白多肽配體如激素、細(xì)胞因子、趨化因子等；這種多肽配體的細(xì)胞表面或可溶受體；凝集素；細(xì)胞間粘附受體如特異性白細(xì)胞整聯(lián)蛋白、選擇蛋白、免疫球蛋白基因超家族成員、細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1，-2，-3)等；組織相容性抗原等。
可以提供結(jié)合域多肽并且也可以選擇為本發(fā)明的結(jié)合域-Ig融合蛋白需要結(jié)合的靶分子或抗原的細(xì)胞表面受體的例子包括以下成分等HER1(如GenBank編號U48722，SEG_HEGFREXS，K03193)，HER2(Yoshino et al.，1994 J.Immunol.1522393；Disis et al.，1994 Canc.Res.5416；也見，例如GenBank編號X03363，M17730，SEGHUMHER20)，HER3(例如GenBank編號U29339，M34309)，HER4(Plowman et al.，1993 Nature 366473；也見，例如GenBank編號L07868，T64105)，表皮生長因子(EGFR)(例如GenBank編號U48722，SEG_HEGFREXS，KO3193)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(例如GenBank編號M32977)，血管內(nèi)皮生長因子受體(例如GenBank編號AF022375，1680143，U48801，X62568)，胰島素樣生長因子-I(例如GenBank編號X00173，X56774，X56773，X06043，也見歐洲專利GB 2241703)，胰島素樣生長因子-II(例如GenBank編號X03562，X00910，SEG_HUMGFIA，SEG_HUMGFI2，M17863，M17862)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Trowbridge andOmary，1981 Proc.Nat.Acad.USA 783039；也參見，例如GenBank編號X01060，M11507)，雌激素受體(如GenBank編號M38651，X03635，X99101，U47678，M12674)，孕激素受體(如GenBank編號X51730，X69068，M15716)，濾泡刺激素受體(FSH-R)(如GenBank編號Z34260，M65085)，視黃酸受體(如GenBank編號L12060，M60909，X77664，X57280，X07282，X06538)，MUC-1(Barnes et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 867159；也見，例如GenBank編號SEG_MUSMUCIO，M65132，M64928)，NY-ESO-1(如GenBank編號AJ003149，U87459)，NA 17-A(如歐洲專利WO 96/40039)，Melan-A/MART-1(Kawakami etal.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913515；也見，例如GenBank編號U06654，U06452)，酪氨酸酶(Topalian et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 919461；也見，例如GenBank編號M26729，SEG_HUMTYRO，也見，例如Weber et al.，J；Clin.Invest(1998)1021258)，Gp-100(Kawakami et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913515；也見，例如GenBank編號S73003，也見歐洲專利EP 668350；Adema et al.，1994J.Biol.Chem.26920126)，MAGE(van den Bruggen et al.，1991Science 2541643；例如GenBank編號U93163，AF064589，U66083，D32077，D32076，D32075，U10694，U10693，U10691，U10690，U10689，U10688，U10687，U10686，U10685，L18877，U10340，U10339，L18920，U03735，M77481)，BAGE(例如GenBank編號U19180，也見美國專利5,683,886和5,571,711)，GAGE(例如GenBank編號AF055475，AF055474，AF055473，U19147，U19146，U19145，U19144，U19143，U19142)，任意CTA類的受體，具體包括由SSX2基因編碼的HOM-MEL-40抗原(例如GenBank編號X86175，U90842，U90841，X86174)，癌胚抗原(CEA，Gold and Freedman，1985 J Exp.Med 121439；也見，例如GenBank編號SEG_HUMCEA，M59710，M59255，M29540)，以及PyLT(例如GenBank編號J02289，J02038)。
其它可以作為結(jié)合域多肽的來源或可以作為相關(guān)抗原的細(xì)胞表面受體包括以下受體等CD2(例如GenBank編號Y00023，SEGHUMCD2，M16336，M16445，SEG_MUSCD2，M14362)，4-1BB(CDw137，Kwon et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 861963)，4-1BB配體(Goodwin et al.，1993 Eur.J.Immunol.232361；Melero et al.，1998 Eur.J.Immunol.3116)，CD5(例如GenBank編號X78985，X89405)，CD10(例如GenBank編號M81591，X76732)，CD27(例如GenBank編號M63928，L24495，L08096)，CD28(June et al.，1990 Immunol.Today 11211；也見，例如GenBank編號SEGHUMCD28，M34563)，CTLA-4(例如GenBank編號L15006，X05719，SEG_HUMIGCTL)，CD40(例如GenBank編號M83312，SEGMUSC040A0，Y10507，X67878，X96710，U15637，L07414)，γ干擾素(IFN-γ，見例如Farrar et al.1993 Ann.Rev.Immunol.11571及其中引用的參考文獻(xiàn)，Gray et al.1982 Nature 295503，Rinderknecht et al.1984 J Biol.Chem.2596790，DeGrado et al.1982 Nature 300379)，白介素-4(IL-4，見例如53rd Forum in Immunology，1993 Research inImmunol.144553-643；Banchereau et al.，1994 in The CytokineHandbook，2nd ed.，A.Thomson，ed.，Academic Press，NY，p.99；Keegan et al.，1994 J Leukocyt.Biol..55272，及其中引用的參考文獻(xiàn))，白介素-17(IL-17)(例如，GenBank編號U32659，U43088)和白介素-17受體(IL-17R)(例如，GenBank編號U31993，U58917)。盡管包括前述內(nèi)容，本發(fā)明特意不包括U.S.5,807,734，U.S.5,795,572或U.S.5,807,734所公開的任何免疫球蛋白融合蛋白。
其它可以作為結(jié)合域多肽的來源或可以作為相關(guān)抗原的細(xì)胞表面受體包括以下受體等CD59(例如，GenBank編號SEG_HUMCD590，M95708，M34671)，CD48(例如，GenBank編號M59904)，CD58/LFA-3(例如，GenBank編號A25933，Y00636，E12817，也見JP1997075090-A)，CD72(例如，GenBank編號AA311036，S40777，L35772)，CD70(例如，GenBank編號Y13636，S69339)，CD80/B7.1(Freeman et al.，1989J.Immunol.432714；Freeman et al.，1991 J.Exp.Med.174625，也見，例如GenBank編號U33208，I683379)，CD86/B7.2(Freeman et al.，1993 J.Exp.Med.1782185，Boriello et al.，1995 J Immunol.1555490；也見，例如GenBank編號AF099105，SEGMMB72G，U39466，U04343，SEGHSB725，L25606，L25259)，CD40配體(例如，GenBank編號SEG_HUMCD40L，X67878，X65453，L07414)，IL-17(例如，GenBank編號U32659，U43088)，CD43(例如，GenBank編號X52075，J04536)和VLA-4(α4β7)(例如，GenBank編號L12002，X16983，L20788，U97031，L24913，M68892，M95632)。以下細(xì)胞表面受體一般與B細(xì)胞相關(guān)CD19(例如，GenBank編號SEG_HUMCD19W0，M84371，SEG MUSCD19W，M62542)，CD20(例如，GenBank編號SEGHUMCD20，M62541)，CD22(例如，GenBank編號I680629，Y10210，X59350，U62631，X52782，L16928)，CD30配體(例如，GenBank編號L09753，M83554)，CD37(例如，GenBank編號SEG_MMCD37X，X14046，X53517)，CD106(VCAM-1)(例如，GenBank編號X53051，X67783，SEG_MMVCAM1C，也見美國專利5,596,090)，CD54(ICAM-1)(例如，GenBank編號X84737，S82847，X06990，J03132，SEGMUSICAMO)，白介素12(見，例如Reiter et al，1993 Crit.Rev.Immunol.131，及其中引入的參考文獻(xiàn))。輔助的細(xì)胞試劑也可以包括以下一般與樹突細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面受體CD83(例如，GenBank編號AF001036，AL021918)，DEC-205(例如，GenBank編號AF011333，U19271)。
上述免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽包括任何天然存在的、作為人工肽或作為基因工程結(jié)果和位于負(fù)責(zé)在CH1和CH2區(qū)中形成鏈內(nèi)免疫球蛋白-結(jié)構(gòu)域二硫鍵的氨基酸殘基之間的免疫球蛋白重鏈多肽內(nèi)的鉸鏈區(qū)肽或多肽；用于本發(fā)明的鉸鏈區(qū)多肽也可以包括突變的鉸鏈區(qū)多肽。因此，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽可以來源于上述經(jīng)典地認(rèn)為具有鉸鏈區(qū)功能的免疫球蛋白鏈區(qū)域，或是其部分或片段(即以肽鍵連接的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，一般5-65個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)，更優(yōu)選15-35個(gè)，更優(yōu)選18-32個(gè)，更優(yōu)選20-30個(gè)，更優(yōu)選21，22，23，24，25，26，27，28或29個(gè)氨基酸)。但用于本發(fā)明的鉸鏈區(qū)多肽并不限于此，并且可以包括位于鄰接的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，如CH1結(jié)構(gòu)域或CH2結(jié)構(gòu)域中的氨基酸(根據(jù)用于分配特定殘基至特定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)可能不同，如本領(lǐng)域公知)，或者在某些人工工程化的免疫球蛋白構(gòu)建體的情況下，可以包括免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。
野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽包括任何位于免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1和CH2之間的天然存在的鉸鏈區(qū)。野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽優(yōu)選是人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽，優(yōu)選包含來自人IgG免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)，更優(yōu)選包含來自人IgG1同種型的鉸鏈區(qū)多肽。如本領(lǐng)域所公知，盡管免疫球蛋白氨基酸序列具有極大的總體多樣性，免疫球蛋白一級結(jié)構(gòu)在免疫球蛋白多肽鏈的特定部分表現(xiàn)出高度序列保守性，特別是存在半胱氨酸殘基，它們通過其巰基提供了與其它存在的巰基形成二硫鍵的潛能。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽可以被認(rèn)為特征在于一個(gè)或多個(gè)高度保守的(如以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式普遍存在于人群中)半胱氨酸殘基，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，突變的鉸鏈區(qū)多肽可以選自含有0或1個(gè)半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)并且來源于這樣的野生型鉸鏈區(qū)。
突變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽可以包含來源于不同于CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的物種、免疫球蛋白同種型或類、或免疫球蛋白亞類的鉸鏈區(qū)。例如，在某些實(shí)施方案中，結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白可以包含融合于含有野生型人IgA鉸鏈區(qū)多肽或此處描述的含有0或僅僅1個(gè)半胱氨酸殘基的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的結(jié)合域多肽。這種鉸鏈區(qū)多肽可以融合于來自于不同的Ig同種型或類，如IgG亞類的免疫球蛋白重鏈CH2區(qū)多肽，該IgG亞類在某些實(shí)施方案中優(yōu)選為IgG1亞類。
例如，如下面更詳細(xì)的描述，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽選自來源于天然包括三個(gè)半胱氨酸的的野生型人IgA鉸鏈區(qū)，其中所選擇的鉸鏈區(qū)多肽相對于完整的鉸鏈區(qū)被截短，使得只剩下一個(gè)半胱氨酸殘基(如SEQ ID NO36)。同樣，在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方案中，結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白包含融合于含有突變的鉸鏈區(qū)多肽的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽，突變的鉸鏈區(qū)多肽中的半胱氨酸殘基數(shù)通過氨基酸取代或缺失而減少。因此突變的鉸鏈區(qū)多肽可以來源于含有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。在某些實(shí)施方案中，突變的鉸鏈區(qū)多肽可以含有0個(gè)或僅僅1個(gè)半胱氨酸殘基，其中突變的鉸鏈區(qū)多肽來源于分別含有一個(gè)或多個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。在突變的鉸鏈區(qū)多肽中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基優(yōu)選被不能形成二硫鍵的氨基酸取代。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，突變的鉸鏈區(qū)多肽來源于人IgG野生型鉸鏈區(qū)多肽，該野生型鉸鏈區(qū)多肽可以包括四種人IgG同種型亞類IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的任意一種。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變的鉸鏈區(qū)多肽來源于人IgG1野生型鉸鏈區(qū)多肽。作為舉例，來源于人IgG野生型鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽可以含有在野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的三個(gè)半胱氨酸中的兩個(gè)或三個(gè)上發(fā)生的突變。
存在于野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)并且根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案而進(jìn)行的誘變所缺失的半胱氨酸殘基包括形成、或能夠形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。不希望受到理論的限制，本發(fā)明考慮了這些鉸鏈區(qū)半胱氨酸殘基的突變，這些半胱氨酸殘基被認(rèn)為參與鏈間二硫橋形成，減少本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白通過二硫鍵形成而二聚化(或形成更高級的寡聚物)的能力，同時(shí)出乎意料地不減少融合蛋白促進(jìn)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或固定補(bǔ)體的能力。具體地，介導(dǎo)ADCC的Fc受體(FcR)(如FcRIII，CD16)具有對免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的低親和性，表示Fc與FcR的功能性結(jié)合需要Fc-FcR復(fù)合物的親和穩(wěn)定，這是由于常規(guī)抗體中重鏈的二聚結(jié)構(gòu)，和/或通過常規(guī)抗體Fc結(jié)構(gòu)的FcR聚集和交聯(lián)而導(dǎo)致的。(Sonderman et al.，2000 Nature 406267；Radaev et al.，2001 J BioLChem.27616469；Radaev et al.，2001 JBiol.Chem.27616478；Koolwijk et al.，1989 J；Immunol.1431656；Kato et al.，2000Immunol.Today 21310.)。因此，本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白提供了與單鏈免疫球蛋白融合蛋白相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也出乎意料地保留了免疫學(xué)活性。同樣，固定補(bǔ)體的能力一般與包含F(xiàn)c的重鏈恒定區(qū)為二聚化的免疫球蛋白相關(guān)，而本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白表現(xiàn)出出乎意料的固定補(bǔ)體的能力。
如上文所指出的，根據(jù)非限定性的理論，確信結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白損害了它們二聚化的能力，并且進(jìn)一步根據(jù)理論，該性質(zhì)是減少存在于所選的包含于融合蛋白的構(gòu)建中的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽中的半胱氨酸殘基數(shù)的結(jié)果。確定多肽二聚化的相對能力的方法是本領(lǐng)域公知的，其中可以用許多確立的方法檢測蛋白的二聚化(見，例如Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，1987Springer-Verlag，New York)。例如，用于根據(jù)分子大小分辨蛋白的生化分離技術(shù)(例如凝膠電泳、凝膠過濾層析、分析性超速離心法等)和/或在引入巰基活性(例如碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺)或二硫鍵還原性(如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇)試劑之前和之后比較蛋白的生理化學(xué)特征的方法，或其它相當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢杂糜跈z測多肽二聚化或寡聚化的程度，并且確定二硫鍵對這種潛在四級結(jié)構(gòu)的可能作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此處提供的相對于野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區(qū)多肽表現(xiàn)出二聚化能力降低(即相對于適當(dāng)?shù)腎gG來源的對照以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式降低)的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白。因此，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠容易確定特定融合蛋白是否表現(xiàn)出這種二聚化能力降低。
用于制備免疫球蛋白融合蛋白的組合物和方法是本領(lǐng)域公知的，例如美國專利5,892,019的描述，該專利公開了作為單個(gè)編碼性多核苷酸的產(chǎn)物但不是本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的重組抗體。
對于用于人的本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白，恒定區(qū)一般來源于人序列，以減少潛在的抗人免疫應(yīng)答并且提供適當(dāng)?shù)男?yīng)物功能。操作編碼抗體恒定區(qū)的序列描述于Morrison和Oi的PCT公開WO89/07142。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，CH1結(jié)構(gòu)域缺失，并且結(jié)合域的羧基端，或當(dāng)結(jié)合域包含兩個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)多肽時(shí)，第二個(gè)(即更接近于C末端)可變區(qū)通過鉸鏈區(qū)連接于CH2的氨基末端。描述兩個(gè)示例性結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的結(jié)構(gòu)的概要圖見圖11，應(yīng)該注意，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，不存在鏈間二硫鍵，在其它實(shí)施方案中，相對于野生型鉸鏈區(qū)多肽中的該鍵的數(shù)目，可以存在有限的鏈間二硫鍵數(shù)目，在其它實(shí)施方案中，融合蛋白包含相對于野生型人IgG鉸鏈區(qū)多肽表現(xiàn)出二聚化能力降低的突變鉸鏈區(qū)多肽。因此，分離的多核苷酸分子編碼單鏈免疫球蛋白融合蛋白，該融合蛋白具有提供對所選擇抗原的特異性結(jié)合親和性的結(jié)合域。
如上文所指出的，在某些實(shí)施方案中，結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白包含至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)多肽，該多肽可以是輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽，并且在某些實(shí)施方案中，融合蛋白包含至少一個(gè)該輕鏈V區(qū)和一個(gè)該重鏈V區(qū)以及至少一個(gè)融合于每一個(gè)V區(qū)的接頭肽。構(gòu)建這種結(jié)合域，例如單鏈Fv結(jié)構(gòu)域的方法是公知的，并且在下文的實(shí)施例中由詳細(xì)描述，并且在例如美國專利5,892,019及其引用的參考文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述；單鏈可變區(qū)和融合于每一個(gè)重鏈來源和輕鏈來源的V區(qū)的接頭多肽的選擇和組裝(例如產(chǎn)生包含單鏈Fv多肽的結(jié)合域)也是本領(lǐng)域公知的，并且在本文和例如美國專利5,869,620，4,704,692和4,946,778中有描述。在某些實(shí)施方案中，來源于非人來源的免疫球蛋白序列的全部或一部分可以根據(jù)公知程序進(jìn)行“人源化”，以制備人源化抗體，即，引入了人Ig序列以減少人免疫系統(tǒng)將該蛋白識別為外源蛋白的程度的免疫球蛋白序列(見，例如美國專利5,693,762；5,585,089；4,816,567；5,225,539；5,530,101及其中引用的參考文獻(xiàn))。
一旦設(shè)計(jì)了此處提供的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，可以通過描述于例如Sinha et al.，Nucleic Acids Res.，12，4539-4557(1984)中的寡核苷酸合成方法合成編碼該多肽的DNA，通過描述于例如Innis，Ed.，PCR Protocols，Academic Press(1990)和Better et al.J.Biol.Chem.267，16712-16118(1992)的PCR方法組裝；通過描述于例如Ausubel etal.，Eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1989)以及Robinson et al.，Hum.Antibod Hybridomas，2，84-93(1991)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行克隆和表達(dá)；并且通過描述于例如Harlowet al.，Eds.，AntibodiesA Laboratory Manual，Chapter 14，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1988)和Munson etal.，AnaL Biochem.，107，220-239(1980)的方法檢測特異性抗原結(jié)合活性。
Fv區(qū)的單多肽鏈結(jié)合分子即單鏈Fv分子的制備描述于美國專利4,946,778，在此引入作為參考。在本發(fā)明中，通過編碼第一個(gè)重鏈或輕鏈可變區(qū)，然后分別編碼相應(yīng)輕鏈或重鏈可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)接頭而合成單鏈Fv樣分子。兩個(gè)可變區(qū)之間的適當(dāng)接頭的選擇描述于美國專利4,946,778。此處描述的示例性的接頭是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。接頭用于將天然聚集但化學(xué)上分離的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)化為單個(gè)多肽鏈的氨基末端抗原結(jié)合部分，其中該抗原結(jié)合部分將折疊成類似于由兩條多肽鏈形成的原始結(jié)構(gòu)，從而保持結(jié)合目的抗原的能力。通過編碼接頭的序列連接的編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列連接于編碼抗體恒定區(qū)的核苷酸序列。恒定區(qū)是允許得到的多肽形成鏈間二硫鍵以形成具有所需效應(yīng)物功能，例如介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的二聚體的區(qū)域。對于意欲用于人類的本發(fā)明的免疫球蛋白樣分子來說，恒定區(qū)一般基本來自于人，從而使?jié)撛诘目谷嗣庖邞?yīng)答減少到最小并且提供適當(dāng)?shù)男?yīng)物功能。對編碼抗體恒定區(qū)的序列的操作描述于Morrison和Oi的PCT公開89/07142，在此引入作為參考。在優(yōu)選實(shí)施方案中，缺失CH1結(jié)構(gòu)域并且通過鉸鏈區(qū)將第二個(gè)可變區(qū)的羧基末端連接于CH2的氨基末端。與輕鏈的相應(yīng)Cys形成二硫鍵以保持天然抗體的重鏈和輕鏈的鉸鏈區(qū)Cys殘基可以缺失或被例如Pro殘基等取代。
如上文所述，本發(fā)明提供了能夠指導(dǎo)此處提供的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白的表達(dá)的重組表達(dá)構(gòu)建體。存在于此處提到的各種氨基酸序列中的氨基酸是根據(jù)它們的公知三字母或單字母簡稱而鑒別的。存在于此處的各種DNA序列或其片段中的核苷酸是根據(jù)本領(lǐng)域中常用的標(biāo)準(zhǔn)單字母命名法進(jìn)行命名的。特定的氨基酸序列也可以包括具有微小改變的相似氨基酸序列，例如說明性而非限定性的共價(jià)化學(xué)修飾、插入、缺失和取代，可以進(jìn)一步包括保守取代。彼此相似的氨基酸序列可以具有很大的序列同源區(qū)。以相似的方式，核苷酸序列可以包括僅具有微小改變的基本相似的核苷酸序列，例如說明性而非限定性的共價(jià)化學(xué)修飾、插入、缺失和取代，可以進(jìn)一步包括由于遺傳密碼子的簡并性而導(dǎo)致的沉默突變。彼此相似的核苷酸序列可以具有很大的序列同源區(qū)。
受試者中存在惡性狀況是指存在受試者中存在發(fā)育異常的、癌性和/或被轉(zhuǎn)化細(xì)胞，包括，例如贅生性、腫瘤、非接觸抑制的或致癌性被轉(zhuǎn)化細(xì)胞等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了例如這些癌細(xì)胞是惡性造血細(xì)胞，例如淋巴系的被轉(zhuǎn)化細(xì)胞，具體如B細(xì)胞淋巴瘤等；在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，癌細(xì)胞也可以是上皮細(xì)胞如上皮癌細(xì)胞。本發(fā)明也考慮了B細(xì)胞疾病，可以包括影響B(tài)細(xì)胞的某些惡性狀況(如B細(xì)胞淋巴瘤)，但不限于此，也可以包括自身免疫病，具體說是以自身抗體產(chǎn)生為特征的疾病、紊亂和狀況。
自身抗體是與自身抗原反應(yīng)的抗體。在一些自身免疫病(即宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)目埂白陨怼泵庖叻磻?yīng)的疾病、紊亂或狀況)中檢測到了自身抗體，它們參與疾病活動(dòng)。目前這些自身免疫病的治療是需要連續(xù)給藥、缺乏特異性并導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的免疫抑制藥物。能夠消除自身抗體的產(chǎn)生并具有最小的毒性的新方法將解決影響許多人的各種疾病的未滿足的醫(yī)學(xué)需要。本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白是設(shè)計(jì)用于改進(jìn)穿透到淋巴組織中。B淋巴細(xì)胞的消除中斷了自身抗體產(chǎn)生循環(huán)，并且允許免疫系統(tǒng)重新設(shè)置，同時(shí)從骨髓中的前體產(chǎn)生新的B淋巴細(xì)胞。
根據(jù)非限制性理論已經(jīng)鑒定，對于許多疾病B細(xì)胞消除理論導(dǎo)致了有益的效果，這些疾病的一些例子的簡要描述如下。
自身免疫性甲狀腺疾病包括格雷夫斯病和橋本氏甲狀腺炎。在美國，有約2千萬人患有某種形式的自身免疫性甲狀腺疾病。自身免疫性甲狀腺疾病是由刺激甲狀腺而導(dǎo)致甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)(格雷夫斯病)或破壞甲狀腺而導(dǎo)致甲狀腺機(jī)能減退(橋本氏甲狀腺炎)的自身抗體的產(chǎn)生而導(dǎo)致的。甲狀腺的刺激是由結(jié)合并激活甲狀腺刺激激素(TSH)受體的自身抗體所導(dǎo)致的。甲狀腺的破壞是由與其它甲狀腺抗原反應(yīng)的自身抗體所導(dǎo)致的。
當(dāng)前格雷夫斯病的治療包括手術(shù)、放射性碘或抗甲狀腺藥物治療。放射性碘被廣泛使用，因?yàn)榭辜谞钕偎幬锞哂酗@著副作用，并且疾病復(fù)發(fā)率高。手術(shù)用于具有大的甲狀腺腫的患者，或需要使甲狀腺功能非常迅速地正?；幕颊摺Ｄ壳斑€沒有靶向于刺激TSH受體的自身抗體的產(chǎn)生的療法。目前用于橋本氏甲狀腺炎的治療是左旋甲狀腺素鈉，并且該治療是終身的，因?yàn)樵摷膊∠藥缀跏遣豢赡艿摹Ｒ呀?jīng)發(fā)現(xiàn)抑制性治療在橋本氏甲狀腺炎腫使甲狀腺腫萎縮，但還沒有已知一種療法能夠減少抗體產(chǎn)生從而靶向于疾病機(jī)制。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以導(dǎo)致腫脹、疼痛和功能喪失的關(guān)節(jié)的炎癥為特征的慢性疾病。RA在美國影響了大約250萬人。RNA是由包括起始的感染或損傷的事件、異常免疫應(yīng)答和遺傳因素的結(jié)合所導(dǎo)致的。盡管RA中存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞，RA的診斷中使用了在關(guān)節(jié)中采集的高水平抗體，即稱作類風(fēng)濕因子的抗體的檢測。目前用于RA的治療包括許多用于控制疼痛和延緩疾病進(jìn)展的藥物。還沒有發(fā)現(xiàn)能夠治愈該疾病的治療。藥物包括非甾體類抗炎藥(NSAIDS)和疾病修飾性抗類風(fēng)濕藥物(DMARDS)。NSAIDS在良性疾病中有效，但在嚴(yán)重RA中不能阻止進(jìn)展為關(guān)節(jié)破壞和殘疾。NSAIDS和DMARDS都與嚴(yán)重的副作用相關(guān)。只在十多年中，只批準(zhǔn)了一種新的DMARD，即來氟米特。來氟米特阻斷自身抗體的產(chǎn)生，減少炎癥，并且延緩RA的進(jìn)展。然而，該藥物也導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，包括惡心、腹瀉、脫發(fā)、皮疹和肝損傷。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種由于多個(gè)器官，包括腎、皮膚和關(guān)節(jié)中的血管的反復(fù)損傷導(dǎo)致的自身免疫病。SLE在美國影響了超過500,000人。在SLE患者中，T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的異常相互作用導(dǎo)致了攻擊細(xì)胞核的自身抗體的產(chǎn)生。這些抗體包括抗雙鏈DNA和抗Sm抗體。在約半數(shù)的SLE患者中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)合于磷脂的自身抗體，并且負(fù)責(zé)血管損傷和低血細(xì)胞計(jì)數(shù)。免疫復(fù)合物在SLE患者的腎、血管和關(guān)節(jié)中聚集，它們在此導(dǎo)致炎癥和組織破壞。還沒有發(fā)現(xiàn)治愈該疾病的療法。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，將NSAIDS和DMARDS用于治療。用于去除自身抗體的帶有血漿交換的血漿除去法可以導(dǎo)致SLE患者的暫時(shí)改進(jìn)。普遍同意自身抗體與SLE有關(guān)，所以消除B細(xì)胞系，允許免疫系統(tǒng)重新設(shè)置，同時(shí)從前體產(chǎn)生新的B細(xì)胞的新療法為SLE患者的長期持續(xù)益處帶來了希望。
干燥綜合征是以身體中產(chǎn)生濕潤環(huán)境的腺體的破壞為特征的一種自身免疫病。干燥綜合征是最普遍的自身免疫病之一，影響了多至400萬美國人。約半數(shù)干燥綜合征患者也患有結(jié)締組織病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而另一半患有原發(fā)性干燥綜合征，沒有其它并發(fā)的自身免疫病。干燥綜合征患者中通常存在自身抗體，包括抗核抗體、類風(fēng)濕因子、抗胞襯蛋白和抗毒蕈堿受體抗體。常規(guī)治療包括皮質(zhì)類固醇。
免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是由結(jié)合于血小板并導(dǎo)致其破壞的自身抗體所導(dǎo)致的。一些ITP病例是由藥物導(dǎo)致的，其它與感染、妊娠或自身免疫病如SLE相關(guān)。約半數(shù)病例分類為“特發(fā)性”，表示原因未知。ITP的治療是由癥狀的嚴(yán)重性所決定的。在一些病例中，不需要治療。在大多數(shù)病例中，用免疫抑制藥物，包括皮質(zhì)類固醇或靜脈輸注免疫球蛋白來消除T細(xì)胞。另一種通常導(dǎo)致血小板數(shù)目增加的治療方法是切除脾，該器官破壞抗體包被的血小板。更強(qiáng)效的免疫抑制藥物，包括環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺或硫唑嘌呤用于治療嚴(yán)重病例。通過使患者的血漿通過蛋白A株而去除自身抗體被用作嚴(yán)重疾病患者的二線療法。
多發(fā)性硬化(MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和髓鞘破壞為特征的自身免疫病，它刺激腦、脊髓和身體中的神經(jīng)細(xì)胞纖維。盡管MS的原因未知，普遍認(rèn)為自身免疫性T細(xì)胞是該疾病發(fā)病的主要原因。然而，高水平的抗體存在于MS患者的腦脊液中，一些理論預(yù)測，導(dǎo)致抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞應(yīng)答在介導(dǎo)該疾病中是重要的。在MS患者中還沒有研究B細(xì)胞消除理論。MS不能治愈。目前的治療是皮質(zhì)類固醇，它可以減少攻擊的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重性，但不影響MS隨時(shí)間的進(jìn)程。最近批準(zhǔn)了MS的新的生物技術(shù)干擾素(IFN)治療。
重癥肌無力(MG)是一種慢性免疫性神經(jīng)肌肉疾病，特征在于隨意肌群的衰弱。MG影響了大約40,000美國人。MG是由結(jié)合于在神經(jīng)肌肉接頭表達(dá)的乙酰膽堿受體的自身抗體導(dǎo)致的。該抗體減少或阻斷乙酰膽堿受體，阻止信號從神經(jīng)傳遞到肌肉。MG還不能治愈。常見的療法包括用皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺或硫唑嘌呤進(jìn)行免疫抑制。手術(shù)切除胸腺通常用于鈍化自身免疫應(yīng)答。用于降低自身抗體水平的血漿除去法在MG中有效，但作用時(shí)間短，因?yàn)槌掷m(xù)產(chǎn)生自身抗體。血漿除去法通常在手術(shù)前用于嚴(yán)重的肌肉衰弱。
牛皮癬影響了大約500萬人。它是皮膚的自身免疫性炎癥。30％的牛皮癬與關(guān)節(jié)炎相關(guān)(硬皮病關(guān)節(jié)炎)。有許多治療方法，包括甾體類、紫外線維生素A類、維生素D衍生物、環(huán)孢霉素、氨甲喋呤。
硬皮病是結(jié)締組織的一種慢性自身免疫病，也稱作系統(tǒng)性硬化。硬皮病的特征在于膠原的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致皮膚增厚。大約300,000美國人患有硬皮病。
包括克隆氏病和潰瘍性結(jié)腸炎的炎性腸病是消化系統(tǒng)的自身免疫病。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的構(gòu)建體，具體涉及用于給予編碼可以表達(dá)為例如所述多肽的片段、類似物和衍生物的所述蛋白的重組構(gòu)建體的方法。當(dāng)提到結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白時(shí)，“片段”、“衍生物”和“類似物”是指任何保持與所述多肽基本相同的生物功能或活性的任何結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白。因此，類似物包括可以被前蛋白部分的切割所激活而產(chǎn)生活性結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的前蛋白。
此處提到的由cDNA編碼的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的片段、衍生物或類似物，包括結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白可以是(i)其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)所取代，并且所述被取代的氨基酸殘基可以或不可以由遺傳密碼編碼，或(ii)其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基，或(iii)其中的其它氨基酸融合于結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽，包括用于檢測結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽或前蛋白序列，或?qū)ζ溥M(jìn)行特異性功能改變。根據(jù)此處的教導(dǎo)，所述片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽包括具有與本領(lǐng)域公知的序列或其片段或部分相同或相似的結(jié)合域多肽氨基酸序列的結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白。例如用于說明而不是限定性的，人CD154分子胞外域可考慮用于本發(fā)明，作為與報(bào)道的多肽和所述多肽的部分具有至少70％相似性(優(yōu)選70％同一性)，更優(yōu)選90％相似性(優(yōu)選90％同一性)，更優(yōu)選95％相似性(優(yōu)選95％同一性)的多肽，其中所述結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽的部分一般含有至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所公知，兩個(gè)多肽間的“相似性”通過比較多肽的氨基酸序列和多肽的保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽的序列而確定。編碼本發(fā)明的多肽的核酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長核酸。如此處所用到的，“百分比同一性”表示當(dāng)使用有空位的BLAST算法如Altschul et al.，1997 Nucl.Ac.Res.253389)對兩個(gè)或更多多肽進(jìn)行比對并分析其序列時(shí)，相應(yīng)氨基酸殘基位置處的相同氨基酸百分比，該算法根據(jù)國家衛(wèi)生部/NCBI數(shù)據(jù)庫提供的缺省加權(quán)，對序列空位和序列錯(cuò)配進(jìn)行加權(quán)(Bethesda，MD；見www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast)。
“分離的”表示該物質(zhì)被從其來源環(huán)境(例如，如果天然存在，則為天然環(huán)境)中取出。例如，存在于活動(dòng)物體內(nèi)的天然存在的核酸或多肽不是分離的，但與天然系統(tǒng)中一些或全部共存物質(zhì)分開的相同核酸或多肽則是分離的。所述核酸可以是載體的部分和/或所述核酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍然是分離的，因?yàn)樗鲚d體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
“基因”表示參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA的片段，它包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域“前導(dǎo)區(qū)和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)”以及各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
如此處所描述，本發(fā)明提供了由具有框內(nèi)融合于額外的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域編碼序列的結(jié)合域編碼序列的核酸編碼的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白，所述框內(nèi)融合提供了與額外的功能性多肽序列融合的結(jié)合域多肽序列的表達(dá)，從而，例如但不限于允許了融合蛋白的檢測、功能性改變、分離和/或純化。所述融合蛋白可以通過含有影響融合產(chǎn)物行為的額外的免疫球蛋白來源的多肽序列而允許結(jié)合域的功能性改變，例如(以及上文所述)減少參與二硫鍵形成的巰基和賦予加強(qiáng)ADCC和/或CDC的能力。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法實(shí)現(xiàn)多肽的修飾。此處的優(yōu)選方法依賴于編碼融合蛋白的DNA的修飾和所述修飾DNA的表達(dá)。編碼上文所討論的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白之一的DNA可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行誘變，包括下文所述方法。例如，可以從多肽中去除或取代促進(jìn)多聚體形成或促進(jìn)特定分子構(gòu)象的半胱氨酸殘基，例如負(fù)責(zé)聚集物形成的半胱氨酸殘基。如果必要，可以通過缺失和/或取代半胱氨酸殘基而從經(jīng)驗(yàn)上確定有利于聚集的半胱氨酸殘基，并且確定得到的蛋白在含有生理可接受的緩沖液和鹽中是否聚集。此外，可以構(gòu)建和使用結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的片段。如上文所指出，已經(jīng)描述了許多候選結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的反受體/配體結(jié)合域，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易選擇用于引入本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)構(gòu)建體的編碼產(chǎn)物中的適當(dāng)多肽結(jié)構(gòu)域。
氨基酸的保守取代是本領(lǐng)域公知的，可以在不改變得到的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白分子的生物活性的條件下進(jìn)行。例如，所述取代一般是通過在極性殘基、帶電殘基。疏水殘基、小殘基等之間進(jìn)行的。如果必要，所述取代可以僅僅用體外生物測定法檢測得到的修飾蛋白結(jié)合適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面受體、或結(jié)合適當(dāng)抗原或所需靶分子的能力而進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)確定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與此處提供的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的編碼多核苷酸序列雜交的核酸分子，或其互補(bǔ)序列，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易理解的，條件是在序列之間存在至少70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與此處提到的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白的編碼核酸雜交的核酸。此處用到的“嚴(yán)格條件”表示只有當(dāng)序列之間有至少95％，優(yōu)選97％同一性時(shí)才能雜交的條件。與結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的編碼核酸雜交的核酸在此處的優(yōu)選實(shí)施方案中是指，編碼保持與此處引用的參考的cDNA編碼的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。
此處用到的在特定的嚴(yán)格性條件下“雜交”是描述在兩個(gè)單鏈核酸分子之間形成的雜交體的穩(wěn)定性。雜交的嚴(yán)格性一般是以雜交體退火和洗滌的離子強(qiáng)度和溫度條件表達(dá)的?！案摺薄ⅰ爸小焙汀暗汀眹?yán)格性包括以下條件或與其相當(dāng)?shù)臈l件高嚴(yán)格性0.1xSSPE或SSC，0.1％SDS，65℃；中嚴(yán)格性0.2xSSPE或SSC，0.1％SDS，50℃；低嚴(yán)格性1.0xSSPE或SSC，0.1％SDS，50℃。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可以通過改變用于預(yù)雜交、雜交和洗滌步驟的溶液的時(shí)間、溫度和/或濃度而達(dá)到雜交條件的嚴(yán)格性的改變，適當(dāng)?shù)臈l件也部分依賴于所使用探針，以及印跡的先證者核酸樣品的特定核苷酸序列。因此，可以理解，不用過多的實(shí)驗(yàn)就可以容易選擇適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件，其中基于與一種或多種先證者序列雜交而不與某些其它先證者序列雜交的能力而鑒定探針的所需選擇性。
本發(fā)明的核酸分子，此處也稱作多核苷酸，可以是RNA或DNA形式，所述DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。用于本發(fā)明的編碼結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽的編碼序列可以與本領(lǐng)域公知的編碼任何結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的序列同一，或者可以是不同的編碼序列，其由于遺傳密碼的冗余或簡并而編碼相同的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽。
編碼用于本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可以包括，但不限于只有結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列；結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列和額外的編碼序列；結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列(任選額外的變序列)和非編碼序列，例如內(nèi)含子或結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列的5’和/或3’非編碼序列，例如可以進(jìn)一步包括，但不限于，可以是被調(diào)節(jié)的或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列、阻遏物結(jié)合序列、翻譯調(diào)節(jié)序列或其它調(diào)節(jié)核酸序列的一種或多種調(diào)節(jié)性核酸序列。因此，編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的“核酸”或“多核苷酸”包括僅含有結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列的核酸和含有額外的編碼和/或非編碼序列的核酸。
用于此處的核酸和寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法合成(見，例如WO 93/01286，美國申請系列號07/723,454；美國專利5,218,088；美國專利5,175,269；美國專利5,109,124)。用于本發(fā)明的寡核苷酸和核酸序列的鑒定包括本領(lǐng)域公知的方法。例如，有用的寡核苷酸的所需特性、長度和其它特征是公知的。在某些實(shí)施方案中，可以將合成寡核苷酸和核酸序列設(shè)計(jì)為抗內(nèi)源性宿主細(xì)胞核酸裂解酶的降解，這是通過含有硫代硫酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代硫酸酯、氨基硫酸酯、磷酸酯等鍵和其它證明可用于反義應(yīng)用的鍵而實(shí)現(xiàn)的(見，例如Agrwal et al.，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller et al.，J Am.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec etal.，Tetrehedron Lett.2621912194(1985)；Moody et al.，Nucl.AcidsRes.124769-4782(1989)；Uznanski et al.，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger et al.，Tetrahedron 40137-143(1984)；Eckstein，Annu.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Scie 1497-100(1989)；Stein InOligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of GeneExpression，Cohen，Ed，Macmillan Press，London，P97-117(1989)；Jager et al.，Biochemistry 277237-7246(1988))。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的截短成分(如結(jié)合域多肽、鉸鏈區(qū)多肽、接頭等)，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼具有所述截短成分的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸。截短的分子可以是任何包含少于分子的全長形式的分子。本發(fā)明提供的截短分子可以包括截短的生物聚合物，在優(yōu)選實(shí)施方案中，截短的分子可以是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的分子具有已知或已描述過的核酸分子的少于全長的核苷酸序列，所述已知或已描述過的核酸分子可以是天然存在的、合成的或重組的核酸分子，只有本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為它是全長分子。這樣，例如，相當(dāng)于基因序列的截短的核酸分子含有少于全長的基因，其中該基因包含編碼和非編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)序列、側(cè)翼序列等，以及認(rèn)為是基因的一部分的其它功能性和非功能性序列。在另一實(shí)施例中，相當(dāng)于mRNA序列的截短的核酸分子含有少于全長的mRNA轉(zhuǎn)錄物，該mRNA轉(zhuǎn)錄物可以包含各種翻譯和非翻譯區(qū)以及其它功能性和非功能性序列。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，截短的分子是包含少于特定蛋白或多肽成分的全長氨基酸序列的多肽。此處用到的“缺失”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的其常用的含義，并可以在任意末端或非末端區(qū)相對于相應(yīng)的全長分子缺乏序列的一個(gè)或多個(gè)部分，例如，此處提供的截短分子。作為線性生物聚合物的截短分子如核酸分子或多肽可以在分子的任意末端具有一個(gè)或多個(gè)缺失，或者在分子的非末端區(qū)具有缺失，其中所述缺失可以是1-1500個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基的缺失，優(yōu)選1-500個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基的缺失，更優(yōu)選1-300個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基的缺失。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的核酸分子可以具有270-330個(gè)連續(xù)核苷酸的缺失。在某些其它特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的多肽分子可以具有80-140個(gè)連續(xù)氨基酸的缺失。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及此處提到的編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的片段、類似物和/或衍生物的核酸的變體。編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸的變體可以是核酸的天然存在的等位變體或天然存在的變體。如本領(lǐng)域所公知，等位變體是可能具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加中的至少一種的核酸序列，其中任意一種都基本不改變被編碼的結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的功能。
可以通過編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的核苷酸序列的突變而獲得結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的變體和衍生物?？梢酝ㄟ^任意常規(guī)方法完成天然氨基酸序列的改變。可以通過合成含有突變序列的寡核苷酸將突變引入特定位點(diǎn)，其側(cè)翼為能夠與天然序列的片段連接的限制位點(diǎn)。連接后，得到的重構(gòu)序列編碼具有所需氨基酸插入、取代或缺失的類似物。
或者，可以使用定位于寡核苷酸的位點(diǎn)特異性誘變程序來提供改變的基因，其中預(yù)定的密碼子可以通過取代、缺失或插入來改變。進(jìn)行所述改變的示例性的方法公開于Walder et al.(Gene 42133，1986)；Bauer et al.(Gene 3773，1985)；Craik(BioTechniques，January1985，12-19)；Smith et al.(Genetic EngineeringPrinciples andMethods Bio Techniques，January 1985，12-19)；Smith et al.(GeneticEngineering.Principles and Methods，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad Sci.USA 82488，1985)；Kun kel et al.(Methods inEnzymol.154367，1987)；以及美國專利4,518,584和4,737,462。
例如，可以通過對編碼蛋白的DNA進(jìn)行定點(diǎn)誘變并聯(lián)合使用DNA擴(kuò)增方法而修飾DNA，在擴(kuò)增方法中使用引物在DNA模板中引入并擴(kuò)增改變，例如通過重疊延伸(SOE)進(jìn)行PCR剪接。定點(diǎn)誘變一般是采用具有單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體而實(shí)現(xiàn)的，所述載體如公知并可以購得的M13噬菌體載體?？梢允褂闷渌m當(dāng)?shù)暮袉捂準(zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的載體(見，例如Veira et al.，Meth.Enzymol.153，1987)。概言之，通過制備編碼目的蛋白(如特定結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的全部或組成部分)的單鏈載體進(jìn)行定點(diǎn)誘變。在與單鏈載體中的DNA同源的區(qū)域內(nèi)含有所需突變的寡核苷酸引物與載體退火，然后加入DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶I(克列諾片段)，該聚合酶使用雙鏈區(qū)作為引物，以產(chǎn)生異雙鏈體，其中一條鏈編碼改變的序列，另一條為最初的序列。將異雙鏈體引入適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞并選擇包含所需突變的克隆。得到的改變的DNA分子可以在適當(dāng)宿主細(xì)胞中重組表達(dá)以產(chǎn)生修飾的蛋白。
本發(fā)明也包括編碼各種氨基酸殘基或序列的添加或取代，或末端缺失或生物活性所不需要的內(nèi)部殘基或序列缺失的等同的DNA構(gòu)建體。例如，如上文所討論，編碼不需要的或?qū)ι锘钚圆皇顷P(guān)鍵的Cys殘基的序列可以進(jìn)行改變，導(dǎo)致Cys殘基缺失或被其它氨基酸取代，從而防止在復(fù)性時(shí)形成異常分子內(nèi)二硫橋。
宿主生物包括那些可以重組產(chǎn)生本發(fā)明的重組構(gòu)建體編碼的結(jié)合域-免疫球蛋白融合產(chǎn)物的生物，例如細(xì)菌(如大腸桿菌)、酵母(例如啤酒糖酵母和巴斯德畢赤氏酵母)、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物，包括體內(nèi)和體外表達(dá)。因此宿主生物可以包括用于此處提供的疫苗的構(gòu)建、繁殖、表達(dá)或其它步驟的生物；宿主也包括其中發(fā)生免疫應(yīng)答的受試者，如上文所述。此處優(yōu)選的宿主生物是大腸桿菌株，近交鼠系和鼠細(xì)胞系，以及人細(xì)胞、受試者和細(xì)胞系。
將編碼所需結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA構(gòu)建體引入用于在適當(dāng)宿主中表達(dá)的質(zhì)粒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主是細(xì)菌宿主。編碼配體或核酸結(jié)合域的序列優(yōu)選進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，用于在特定宿主中表達(dá)。因此，例如，如果人結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，將對密碼子進(jìn)行優(yōu)化用于細(xì)菌使用。對于小的編碼區(qū)，可以將基因合成為單個(gè)寡核苷酸。對于較大的蛋白，可以使用多個(gè)核苷酸的剪接、誘變或其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)。質(zhì)粒中的作為調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸序列，例如啟動(dòng)子和操縱子，進(jìn)行了彼此的操作性結(jié)合，用于轉(zhuǎn)錄。編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸序列也可以包括編碼分泌信號的DNA，由此得到的肽是前體蛋白。得到的加工后的蛋白可以從周質(zhì)間隙或發(fā)酵培養(yǎng)基中回收。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA質(zhì)粒也包含轉(zhuǎn)錄終止子序列。此處用到的“轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)”是傳遞轉(zhuǎn)錄終止信號的序列。完整的轉(zhuǎn)錄終止子可以從蛋白編碼基因獲得，該基因可以與插入的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼基因或啟動(dòng)子來源相同或不同。轉(zhuǎn)錄終止子任選是此處的表達(dá)系統(tǒng)的成分，但在優(yōu)選實(shí)施方案中使用。
此處使用的質(zhì)粒包含與編碼目的蛋白或多肽的DNA操作性連接的啟動(dòng)子，并且設(shè)計(jì)用于在上文所述宿主(例如細(xì)菌、鼠或人)中表達(dá)蛋白，這取決于質(zhì)粒的所需用途(例如，給予含有結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼序列的疫苗)。用于表達(dá)此處的蛋白和多肽的適當(dāng)啟動(dòng)子可以從多種途徑獲得，并且是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選連接于調(diào)節(jié)區(qū)的誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括，但不限于T7噬菌體啟動(dòng)子或其它T7樣噬菌體啟動(dòng)子，例如T3，T5和SP6啟動(dòng)子，trp，lpp和lac啟動(dòng)子，如大腸桿菌的lacUV5啟動(dòng)子；桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的P10或多角體蛋白基因啟動(dòng)子(見，例如美國專利5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784)以及來自于其它真核表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。對于表達(dá)蛋白，將這些啟動(dòng)子插入質(zhì)粒，與控制區(qū)如lac操縱子處于操作性連接。
優(yōu)選的啟動(dòng)子區(qū)是在大腸桿菌中可誘導(dǎo)并且具有功能的。適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子和啟動(dòng)子區(qū)的例子包括，但不限于，反應(yīng)于異丙基-D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG；見Nakamura et al.，Cell 181109-1117，1979)的大腸桿菌lac操縱子；反應(yīng)于重金屬(如鋅)誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子金屬調(diào)節(jié)元件(見例如Evans等的美國專利4,870,009)；反應(yīng)于IPTG的噬菌體T7lac啟動(dòng)子(見例如美國專利4,952,496；和Studier et al.，Meth.Enzymol.18560-89，1990)以及TAC啟動(dòng)子。
質(zhì)?？梢匀芜x包含在宿主中具有功能的一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基因包括任何賦予細(xì)菌能夠使被轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞從大量未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中鑒定出來并選擇性生長的表型的基因。用于細(xì)菌宿主的適當(dāng)可選擇標(biāo)記，例如包括氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。在此優(yōu)選卡那霉素抗性基因。
質(zhì)粒也可以包含編碼用于可操作性連接的蛋白的分泌信號的DNA。使用的分泌信號可以從多種途徑獲得并且是本領(lǐng)域公知的。此處優(yōu)選的分泌信號包括，但不限于，由以下大腸桿菌基因編碼的信號ompA，ompT，ompF，ompC，β-內(nèi)酰胺酶和堿性磷酸酶等(von Heijne，JMoL BioL 18499-105，1985)。此外，可以使用細(xì)菌pelB基因分泌信號(Lei et al.，J.Bacteriol.1694379，1987)，phoA分泌細(xì)胞和在昆蟲細(xì)胞中有功能的cek2。最優(yōu)選的分泌信號是大腸桿菌ompA分泌信號。也可以使用本領(lǐng)域公知的其它原核和真核分泌信號(見，例如vonHeijne，J MoL Biol.18499-105，1985)。采用此處描述的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以替換在酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的分泌信號以從這些細(xì)胞分泌蛋白。
用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的優(yōu)選質(zhì)粒包括pET表達(dá)載體(如pET-l la，pET-12a-c，pET-15b；見美國專利4,952,496；可以從Novagen，Madison，WI.獲得)。其它優(yōu)選的質(zhì)粒包括pKK質(zhì)粒，特別是pKK223-3，它含有tac啟動(dòng)子(Brosius et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.816929，1984；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology；美國專利5,122,463，5,173,403，5,187,153，5,204,254，5,212,058，5,212,286，5,215,907，5,220,013，5,223,483和5,229,279)。已經(jīng)通過用卡那霉素基因替代氨芐青霉素抗性基因而修飾質(zhì)粒pKK(可以從Pharmacia；得自pUC4K，見例如Vieira et al(Gene 19259-268，1982；和美國專利4,719,179.)。桿狀病毒載體，例如pBlueBac(也稱作pJVETL及其衍生物)，特別是pBlueBac III(見例如美國專利5,278,050，5,244,805，5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784；可以從Invitrogen，San Diego得到)也可以用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多肽。其它質(zhì)粒包括pIN-IIIompA質(zhì)粒(見美國專利4,575,013；也見Duffaud et al.，Meth.Enz.153492-507，1987)，例如pIN-IIIompA2。
優(yōu)選地，DNA分子在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制，優(yōu)選在大腸桿菌中復(fù)制。優(yōu)選的DNA分子也包括細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)，以保證DNA分子在細(xì)菌的各代中保留。以此方式，可以通過在細(xì)菌中的復(fù)制產(chǎn)生大量DNA分子。優(yōu)選的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于fl-ori和col E1復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞含有可操作性連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如lacUV啟動(dòng)子的編碼T7 RNA聚合酶的DNA(見美國專利4,952,496)。所述宿主包括，但不限于溶原體大腸桿菌株HMS174(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysS，HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是優(yōu)選的。pLys提供了低水平的T7溶菌酶，即T7 RNA聚合酶的一種天然抑制劑。
提供了DNA分子也可以含有編碼阻遏蛋白的基因。阻遏蛋白能夠抑制含有結(jié)合于阻遏蛋白的核苷酸序列的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^改變細(xì)胞的生理?xiàng)l件而解除啟動(dòng)子的阻遏。例如，該改變可以通過在生長培養(yǎng)基中加入抑制與操縱子或調(diào)節(jié)蛋白或DNA的其它區(qū)域相互作用的能力的分子或通過改變生長培養(yǎng)基的溫度而完成。優(yōu)選的阻遏蛋白包括，但不限于反應(yīng)于IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌lacI阻遏物，溫度敏感性λcI857阻遏物等。
概言之，本發(fā)明的重組構(gòu)建體也將含有轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件。具體地，這些元件是優(yōu)選的，其中含有編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸的重組表達(dá)構(gòu)建體將用于在宿主細(xì)胞或生物中報(bào)道。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以通過放置啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的基因而完成細(xì)胞結(jié)合域免疫球蛋白-融合蛋白編碼基因的細(xì)胞類型優(yōu)選性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。啟動(dòng)子的選擇將取決于待轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型和所需控制的程度或類型。啟動(dòng)子可以是組成型的或有活性的，并且可以進(jìn)一步是細(xì)胞類型特異性的，組織特異性的、各個(gè)細(xì)胞特異性的、事件特異性的、時(shí)間特異性的或誘導(dǎo)型的。細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子和事件類型特異性的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。組成型或非特異性啟動(dòng)子的例子包括SV40早期啟動(dòng)子(美國專利5,118,627)、SV40晚期啟動(dòng)子(美國專利5,118,627)、CMV早期基因啟動(dòng)子(美國專利5,168,062)，以及腺病毒啟動(dòng)子。除病毒啟動(dòng)子外，細(xì)胞啟動(dòng)子也用于本發(fā)明的內(nèi)容。具體地，可以使用用于所謂的管家基因的細(xì)胞啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈円话闶潜燃?xì)胞啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子。已經(jīng)在許多真核生物，包括高等真核生物中鑒定了啟動(dòng)子區(qū)，這樣本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易選擇用于特定宿主的適當(dāng)啟動(dòng)子。
也可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括由地塞米松誘導(dǎo)的MMTV LTR(PCT WO 91/13160)、由重金屬誘導(dǎo)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子；和由cAMP誘導(dǎo)的具有cAMP反應(yīng)元件的啟動(dòng)子。通過使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列可以由本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體遞送至細(xì)胞，并且保持靜止，直到加入誘導(dǎo)劑。這允許了對基因產(chǎn)物的產(chǎn)生時(shí)間的進(jìn)一步控制。
事件類型特異性啟動(dòng)子僅僅在發(fā)生某種事件，如致腫瘤性或病毒感染時(shí)才有活性或被上調(diào)。HIV LTR是事件類型特異性啟動(dòng)子的公知例子。該啟動(dòng)子是無活性的，除非存在tat基因產(chǎn)物，這是在病毒感染時(shí)發(fā)生的。一些事件類型特異性啟動(dòng)子也是組織特異性的。
此外，可以使用由特定細(xì)胞基因協(xié)同調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)需要特定結(jié)合域融合蛋白編碼基因的表達(dá)與一個(gè)或多個(gè)額外內(nèi)源性或外源性引入的基因協(xié)同時(shí)，可以使用協(xié)同表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。當(dāng)已知與在免疫系統(tǒng)的特定組織中引入免疫應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)模式時(shí)，這種類型的啟動(dòng)子特別有用，這樣該組織內(nèi)的特異性免疫感受態(tài)細(xì)胞可以被激活或募集參與免疫應(yīng)答。
除了啟動(dòng)子外，可以插入阻遏序列、負(fù)調(diào)節(jié)子、或組織特異性沉默子，以減少某些情況下結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼基因的非特異性表達(dá)，所述情況例如，作為治療策略的一部分而瞬時(shí)無免疫應(yīng)答的宿主。可以在啟動(dòng)子區(qū)插入多種阻遏元件。轉(zhuǎn)錄的阻遏是不依賴于阻遏元件的方向或與啟動(dòng)子的距離的。一種類型的阻遏序列是絕緣序列。這種序列抑制轉(zhuǎn)錄(Dunaway et al.，Mol Cell Biol 17182-9，1997；Gdula et al.，Proc Natl Acad Sci USA 939378-83，1996，Chan et al.，JVirol 705312-28，1996；Scott and Geyer，EMBO J 146258-67，1995；Kalos and Fournier，Mol Cell Biol 15198-207，1995；Chung et al.，Cell74505-14，1993)并將沉默本底轉(zhuǎn)錄。
也在II型(軟骨)膠原、堿性?；D(zhuǎn)移酶、白蛋白(Hu et al.，J.CellGrowth Differ.3(9)577-588，1992)、磷酸甘油激酶(PGK-2)(Misuno etal.，Gene 119(2)293-297，1992)的啟動(dòng)子區(qū)和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶基因中鑒定了阻遏元件(Lemaigre et al.，Mol.Cell Biol.11(2)1099-1106)。此外，在許多肝臟特異性基因中鑒定了陰性負(fù)調(diào)節(jié)元件Tse-1，發(fā)現(xiàn)其阻斷cAMP反應(yīng)元件-(CRE)介導(dǎo)的肝細(xì)胞中基因激活的誘導(dǎo)(Boshart et al.，Cell 61(5)905-916，1990)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將增加所需產(chǎn)物的表達(dá)的元件摻入構(gòu)建體中。所述元件包括內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES；Wang and Siddiqui，Curr.Top.Microbiol.Immunol 20399，1995；Ehrenfeld and Semler，Curr.Top.Microbiol.Immunol.20365，1995；Rees et al.，Biotechniques 20102，1996；Sugimoto et al.，Biotechnology 12694，1994)。IRES增加翻譯效率。同樣，其它序列也增加表達(dá)。對于一些基因，特別是在5’端的序列抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。這些序列通常是可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的回文序列。一般去除待遞送核酸中的這種序列。對轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行了測定，以證實(shí)或確定哪些序列影響表達(dá)。可以用任何公知的方法測定轉(zhuǎn)錄水平，包括RNA印跡雜交，RNA酶探針保護(hù)等。可以通過任意公知的方法測定蛋白水平，包括ELISA，蛋白印跡，免疫細(xì)胞化學(xué)或其它公知方法。
可以將其它元件摻入本發(fā)明的結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄終止子序列，包括聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，以及增強(qiáng)子。也可以摻入其它用于表達(dá)構(gòu)建體和將其維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它真核細(xì)胞中的元件(如復(fù)制起點(diǎn))。由于這些構(gòu)建體可以方便地在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生，摻入了對于在細(xì)菌中增殖是必要的，或者增強(qiáng)在細(xì)菌中增殖的元件。所示元件包括復(fù)制起點(diǎn)、可選擇標(biāo)記等。
此處通過同時(shí)遞送兩種或更多的不同調(diào)節(jié)的核酸構(gòu)建體而使用本發(fā)明的構(gòu)建體將對結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸的表達(dá)的附加控制遞送給細(xì)胞。使用這樣的多核酸構(gòu)建體方法可以允許免疫應(yīng)答的協(xié)同調(diào)節(jié)，例如，依賴于細(xì)胞類型和/或另一所表達(dá)的被編碼成分的空間時(shí)間協(xié)同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，通過選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可以用相似的方式完成多個(gè)水平的被調(diào)節(jié)基因表達(dá)，所述調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它公知的基因調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明也涉及載體，以及通過包含本發(fā)明的核酸的公知載體制備的構(gòu)建體，特別涉及包含結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的任何編碼核酸的“重組表達(dá)構(gòu)建體”和上文提供的本發(fā)明的多肽；涉及通過用本發(fā)明的載體和/或構(gòu)建體而基因工程化的宿主細(xì)胞，以及通過重組技術(shù)施用包含本發(fā)明的所述結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白，或其片段或變體的編碼核酸的方法。結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白基本可以在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)，這取決于構(gòu)建體的性質(zhì)(如上文所述啟動(dòng)子的類型)，以及所需宿主細(xì)胞的性質(zhì)(如是有絲分裂后最終分化或活躍分裂；如表達(dá)構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中是作為附加體存在還是整合到宿主基因組中)。用于原核和真核宿主的適當(dāng)克隆和表達(dá)載體描述于Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，(1989)，如上文所指出，在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在用本發(fā)明的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)。
一般地，用質(zhì)粒載體遞送構(gòu)建體。優(yōu)選的構(gòu)建體是改進(jìn)的pNASS載體(Clontech，Palo Alto，CA)，其具有編碼氨芐青霉素抗性基因的核酸、聚腺苷酸化信號和T7啟動(dòng)子位點(diǎn)。其它適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體是公知的(見，例如，Ausubel et al.，1995；Sambrook et al.，supra；也見，例如catalogues from Invitrogen，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia，Piscataway，NJ，及其它)。目前可以制備的優(yōu)選構(gòu)建體包含適當(dāng)調(diào)控下的二氫喋呤還原酶(DHFR)編碼序列，用于增加結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的產(chǎn)生水平，該水平是通過在施用適當(dāng)選擇試劑(如methetrexate)后進(jìn)行基因擴(kuò)增而達(dá)到的。
一般地，重組表達(dá)載體包括允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記，以及來自于高表達(dá)的基因、用于指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的上文所述的啟動(dòng)子。異源結(jié)構(gòu)序列與翻譯起始和終止序列組裝在適當(dāng)噬菌體中。因此，例如，此處提供的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸可以包含在各種表達(dá)載體中，所述載體構(gòu)建為重組表達(dá)構(gòu)建體，用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含在體內(nèi)給藥的制劑中。所述載體和構(gòu)建體包括染色體的、非染色體的和合成DNA序列，如，SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒，來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA的聯(lián)合的載體、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒，以及假狂犬病病毒或復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA，如下文所述。然而，任何其它載體可以用于制備重組表達(dá)構(gòu)建體，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是可復(fù)制的，并且可在宿主中存活。
可以通過各種程序?qū)⑦m當(dāng)?shù)腄NA序列插入載體中。概言之，通過本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于酶促反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括DNA連接酶，DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等，以及各種分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和通常使用的。許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于，例如Ausubel et al.(1993 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook et al.(1989 Molecular Cloning，Second Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Plainview，NY)；Maniatis et al.(1982 MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)；Glover(Ed.)(1985 DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK)；Hames andHiggins(Eds.)，(1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK)；及其它。
表達(dá)載體中的DNA序列與至少一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(如組成型啟動(dòng)子或受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子)操作性連接，以指導(dǎo)mRNA合成。這種表達(dá)控制序列的代表性例子包括真核細(xì)胞啟動(dòng)子或上述真核細(xì)胞病毒?？梢允褂肅AT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它具有可選擇標(biāo)記的載體從任何需要的基因選擇啟動(dòng)子區(qū)。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子和小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。適當(dāng)啟動(dòng)子的選擇處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)，此處描述了某些特別優(yōu)選的重組表達(dá)構(gòu)建體的制備，其中包含與編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可操作性連接的至少一種啟動(dòng)子或受調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
由高等真核動(dòng)物進(jìn)行的編碼本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)錄可以通過將增強(qiáng)子序列插入載體而增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子的例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)100-270bp的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。
此處在某些實(shí)施方案中提供的載體可以是病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Miller et al.，1989 BioTechniques 7980；Coffin and Varmus，1996 Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.)。例如，可以得到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括，但不限于莫洛尼鼠類白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種通過DNA中間體能復(fù)制并整合到宿主細(xì)胞基因組中的RNA病毒。該DNA中間體，或前病毒，可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞DNA。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，疫苗可以包含摻入了編碼外源蛋白的外源基因而替代正常逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒伴隨感染進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，外源基因也引入細(xì)胞中，然后可以作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分而整合到宿主細(xì)胞DNA中。該外源基因的在宿主中的表達(dá)導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)。
開發(fā)用于基因治療的大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)都是基于鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒以兩種形式存在，即作為稱作毒粒的游離病毒顆粒，或作為整合到宿主細(xì)胞DNA中的前病毒。毒粒形式的病毒含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白(包括逆轉(zhuǎn)錄酶)、病毒基因組的兩個(gè)RNA拷貝、以及含有病毒被膜糖蛋白的來源細(xì)胞質(zhì)膜的部分。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組組織為四個(gè)主要區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄起始和終止所必須的順式作用元件并且位于編碼基因的5’和3’的長末端重復(fù)(LTR)，以及三個(gè)編碼基因gag，pol和env。這三個(gè)基因gag，pol和env分別編碼內(nèi)部病毒結(jié)構(gòu)、酶蛋白(如整合酶)以及賦予病毒感染性和宿主范圍特異性的被膜糖蛋白(稱為gp70和pl5e)，以及未確定功能的“R”肽。
已經(jīng)開發(fā)了單獨(dú)的包裝細(xì)胞系和載體產(chǎn)生細(xì)胞系，這是出于逆轉(zhuǎn)錄病毒使用的安全性考慮，包括它們在本發(fā)明的疫苗中使用的安全性。簡言之，該方法使用了兩種成分，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞系(PCL)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有長末端重復(fù)(LTRs)、待轉(zhuǎn)移的外源DNA和包裝序列(y)。該逆轉(zhuǎn)錄載體自身不會復(fù)制，因?yàn)榫幋a結(jié)構(gòu)蛋白和被膜蛋白的基因沒有包含在載體基因組中。PCL含有編碼gag，pol和env蛋白的基因，但不含包裝信號″y″。這樣，PCL自身只能形成空的毒粒。在此普通方法中，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入PCL中，從而建立載體產(chǎn)生細(xì)胞系(VCL)。該VCL制造僅含有逆轉(zhuǎn)錄病毒(外源)基因組的毒粒，因此被認(rèn)為是用于質(zhì)粒用途的安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”是指在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中能夠指導(dǎo)目的序列或基因，如結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸序列的表達(dá)的組裝體。簡言之，逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體可以包含5′LTR、tRNA結(jié)合位點(diǎn)、包裝信號、第二條鏈DNA合成的起點(diǎn)和3′LTR。可以將多種異源序列包含在載體構(gòu)建體中，例如，編碼蛋白(如細(xì)胞毒性蛋白、疾病相關(guān)抗原、免疫輔助分子或替代基因)的序列，或自身作為分子的序列(如作為核酶或反義序列)。
可以容易從多種逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體，包括例如B、C和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒以及泡沫病毒和慢病毒(見，例如RNATumor Viruses，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒可以容易從存放處或保藏中心獲得，例如從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(″ATCC″；Rockville，Maryland)，或者使用常用技術(shù)從公知來源分離。根據(jù)此處提供的公開內(nèi)容和標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)，可以使用上述任意逆轉(zhuǎn)錄病毒以組裝或構(gòu)建本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體、包裝細(xì)胞或生產(chǎn)細(xì)胞(如Sambrook et al，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Kunkle，PNAS 82488，1985)。
用于病毒載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子可以包括，但不限于描述于Miller，etal.，Biotechniques 7980-990(1989)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動(dòng)子和人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，和任意其它啟動(dòng)子(如細(xì)胞啟動(dòng)子，如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可以使用的病毒啟動(dòng)子包括，但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。根據(jù)此處包含的教導(dǎo)和上文描述的受調(diào)節(jié)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白適當(dāng)啟動(dòng)子的選擇。
如此處所描述，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢赞D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞系包括，但不限于Miller，HumanGene Therapy，15-14(1990)中描述的PE501，PA317，ψ-2，ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ψCRE，ψCRIP，GP+E-86，GP+envAml2和DAN細(xì)胞系。載體可以通過本領(lǐng)域的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系。這些方法包括，但不限于，電穿孔，脂質(zhì)體的使用和CaPO4沉淀。在另一選擇中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包被在脂質(zhì)體中，或偶聯(lián)于脂，然后給予宿主。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生包含編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列?？梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括，但不限于，胚胎干細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、循環(huán)外周血單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞，包括骨髓單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成肌細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、淋巴結(jié)和脾的淋巴和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
作為本發(fā)明的用病毒載體制備重組結(jié)合域-免疫球蛋白融合表達(dá)構(gòu)建體的實(shí)施方案的另一個(gè)例子，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用指導(dǎo)結(jié)合域免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白表達(dá)的重組病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生病毒顆粒，該病毒顆粒含有被表達(dá)的來源于病毒出芽時(shí)由病毒顆粒摻入的宿主細(xì)胞膜的部分的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白融合多肽或融合蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及含有上述重組結(jié)合域-免疫球蛋白融合表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。用本發(fā)明的載體和/或表達(dá)構(gòu)建體基因工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的宿主細(xì)胞可以是，例如，克隆載體、穿梭載體或表達(dá)構(gòu)建體。該載體或構(gòu)建體可以是，例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。工程化的宿主細(xì)胞可以在經(jīng)改進(jìn)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基適于激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增特定基因如編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合多肽或結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的基因。選擇用于表達(dá)的特定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件，如溫度、pH等對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易理解的。
宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。適當(dāng)宿主細(xì)胞的代表性例子包括，但不需要限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO，COS或293細(xì)胞；腺病毒；植物細(xì)胞，或適于體外繁殖或從頭建立的適當(dāng)細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處的教導(dǎo)應(yīng)該能夠選擇適當(dāng)宿主細(xì)胞。
也可以使用多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman，Cell 23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7系，以及其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包含復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子，以及必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，例如此處所提供的關(guān)于結(jié)合域-免疫球蛋白融合表達(dá)構(gòu)建體的制備。來源于SV40剪接的DNA序列，以及聚腺苷酸化位點(diǎn)可以用于提供需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種方法而實(shí)現(xiàn)，包括但不限于，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔(Davis et al.，1986 Basic Methods inMolecular Biology)。
可以將本發(fā)明的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白制劑化為藥物組合物，用于根據(jù)常規(guī)方法給藥。藥物組合物一般包含一種或多種重組表達(dá)構(gòu)建體，和/或所述構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物，并組合了可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。所述載體在使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的。對于基于核酸的制劑，或包含本發(fā)明的重組構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物的制劑，將給予約0.01μg/kg-約100mg/kg體重，一般通過真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈途徑或其它途徑。優(yōu)選的劑量為約1μg/kg-約1mg/kg，約5μg/kg-約200μg/kg是特別優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，給藥的次數(shù)和頻率將取決于宿主的反應(yīng)。用于治療用途的“可藥用載體”是制藥領(lǐng)域公知的，描述于，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。例如，可以使用生理pH的無菌鹽水和磷酸緩沖鹽水。可以通過藥物組合物形式提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和調(diào)味劑。例如，可以添加苯甲酸鈉、山梨酸和β-羥基苯甲酸的酯作為防腐劑。Id.1449。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。Id。
“可藥用鹽”是指本發(fā)明的化合物的鹽，它來自于所述化合物和有機(jī)或無機(jī)酸(酸加成鹽)或有機(jī)或無機(jī)堿(堿加成鹽)的組合。本發(fā)明的化合物可以以游離堿或鹽形式使用，兩種形式都考慮處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
含有一種或多種結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構(gòu)建體(或它們的表達(dá)產(chǎn)物)的藥物組合物可以是允許將該組合物給予患者的任何形式。例如，該組合物可以是固體、液體或氣體(氣溶膠)。典型的給藥途徑包括，但不限于口服、局部、腸胃外(如舌下或頰)、舌下、直腸、陰道和鼻內(nèi)給藥。此處使用的術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、腔道內(nèi)、尿道內(nèi)注射和輸注技術(shù)。對藥物組合物進(jìn)行制劑化，從而允許其中含有的活性成分在將組合物給予患者時(shí)是生物可利用的。將給予患者的組合物是一種或多種劑量單位的形式，例如，片劑可以是單劑量單位，本發(fā)明的氣溶膠形式的一種或多種化合物的容器可以具有多個(gè)劑量單位。
對于口服給藥，可以存在賦形劑和/或粘合劑。其例子包括蔗糖、高嶺土、甘油、淀粉糊精、藻酸鈉、羧甲基纖維素和乙基纖維素?？梢源嬖谥珓┖?或調(diào)味劑。可以使用包衣。
組合物可以是液體，如酏劑、糖漿、溶液、乳狀液或懸浮液形式。該液體可以用于作為兩個(gè)例子的口服給藥或通過注射遞送。當(dāng)用于口服給藥時(shí)，除一種或多種結(jié)合域-免疫球蛋白融合構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物外，優(yōu)選的組合物還含有一種或多種增甜劑、防腐劑、染料/著色劑和調(diào)味劑。在用于注射給藥的組合物中，可以含有一種或多種表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等滲劑。
不論是溶液、懸浮液或其它形式，此處用到的液體藥物組合物可以包含一種或多種一些佐劑無菌稀釋劑如用于注射的水、鹽溶液，優(yōu)選生理鹽水、林格氏液、等滲氯化鈉，固定的油，如可以作為溶劑或懸浮介質(zhì)的合成甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑如氯化鈉或右旋糖。腸胃外制劑可以包含于玻璃或塑料制備的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的佐劑?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選是無菌的。
制劑中也可能需要包含其它成分，如遞送載體，包括但不限于鋁鹽、油包水乳狀液、生物可降解油載體、水包油乳狀液、生物可降解微膠囊和脂質(zhì)體。用于所述載體中的免疫刺激物質(zhì)(佐劑)包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-異谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干擾素和IL-15。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可以使用任何適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的載體，載體的類型將根據(jù)給藥方式和是否需要持續(xù)釋放而不同。對于腸胃外給藥，如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可以使用任何上述載體或固體載體如甘露醇、乳糖、淀粉硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以將生物可降解微球體(如polylactic galactide)也可以用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。適當(dāng)?shù)纳锟山到馕⑶蝮w公開于，例如美國專利4,897,268和5,075,109。在這一點(diǎn)上，微球體優(yōu)選大于約25微米。
藥物組合物也可以包含稀釋劑如緩沖液、抗氧化劑如抗壞血酸、低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽、蛋白、氨基酸、糖，包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑如EDTA、谷胱甘肽及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是極為適合的稀釋劑。優(yōu)選地，用作為稀釋劑的適當(dāng)賦性溶液(如蔗糖)將該產(chǎn)物制劑化為凍干物。
如上文所述，本發(fā)明包括能夠遞送編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸分子的組合物。所述組合物包括重組病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒(見WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698和WO 94/03622)，腺病毒(見Berkner，Biotechniques 6616-627，1988；Liet al.，Hum.Gene Ther.4403-409，1993；Vincent et al.，Nat.Genet.5130-134，1993；和Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994)，以及痘病毒(見美國專利4,769,330；美國專利5,017,487和WO 89/01973))，復(fù)合于聚陽離子分子的重組表達(dá)構(gòu)建體核酸分子(見WO 93/03709)，和脂質(zhì)體相關(guān)的核酸(見Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847851，1987)。在某些實(shí)施方案中，DNA可以連接于殺死的或滅活的腺病毒(見Curiel et al.，Hum.Gene Ther.3147-154，1992；Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094，1992)。其它適當(dāng)?shù)慕M合物包括DNA-配體(見Wu et al.，J.Biol.Chem.26416985-16987，1989)和脂質(zhì)-DNA組合(見Felgner et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA847413-7417，1989)。
除了定位于體內(nèi)程序，也可以使用體外程序，其中從宿主取出細(xì)胞，進(jìn)行修飾，然后置于相同或另一宿主動(dòng)物。明顯的是，可以使用上述任意一種組合物，將結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白或結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸分子引入體外的組織細(xì)胞。病毒、物理和化學(xué)攝取方法的程序是本領(lǐng)域公知的。
因此，本發(fā)明用于治療B細(xì)胞疾病或惡性狀況的患者，或用于治療來源于所述患者的細(xì)胞培養(yǎng)物。此處用到的“患者”是指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選人?；颊呖梢曰加邪┌Y，如B細(xì)胞淋巴瘤或可以是正常的(即沒有可檢測的疾病和感染)?！凹?xì)胞培養(yǎng)物”是任何可以進(jìn)行離體處理的制備物，例如，含有免疫系統(tǒng)的免疫感受態(tài)細(xì)胞或分離細(xì)胞(包括但不限于T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞)的制備物。所述細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)進(jìn)行分離(如Ficoll-hypaque密度離心)。細(xì)胞可以(但不是必須)從B細(xì)胞疾病或惡性狀況的患者中分離，并且可以在治療后重新引入患者。
用于腸胃外或口服給藥的液體組合物可以含有一定量的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物，從而獲得適當(dāng)?shù)膭┝俊Ｒ话愕?，該量為組合物中含有至少0.01wt％結(jié)合域-免疫球蛋白融合構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)用于口服給藥時(shí)，該量可以是組合物的0.1-70wt％。優(yōu)選口服組合物含有約4-50wt％的結(jié)合域-免疫球蛋白融合構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選組合物和制劑制備物一個(gè)腸胃外劑量單位含有0.01-1wt％活性化合物。
藥物組合物可以用于局部給藥，在此情況下載體可以適當(dāng)包括溶液、乳狀液、油膏或凝膠基質(zhì)。該基質(zhì)，例如可以包含一種或多種一些成分礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑如水和醇，以及乳化劑和穩(wěn)定劑。用于局部給藥的藥物組合物中可以存在增稠劑。如果用于經(jīng)皮給藥，該組合物可以包含經(jīng)皮貼劑或離子電滲設(shè)備。局部制劑可以含有濃度為約0.1-10％w/v(每單位體積的重量)的結(jié)合域-免疫球蛋白融合構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物。
組合物可以用于以在直腸中溶解并釋放藥物的栓劑形式進(jìn)行直腸給藥。用于直腸給藥的組合物可以含有油性基質(zhì)，如適當(dāng)?shù)姆谴碳ば再x形劑。所述基質(zhì)包括，但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
在本發(fā)明的方法中，可以通過插入物、珠、時(shí)間控制釋放制劑、貼劑或快速釋放制劑的形式給予結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構(gòu)建體或表達(dá)產(chǎn)物。
以下實(shí)施例是作為舉例而不是限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例12H7可變區(qū)的克隆和2H7SCFV-IG的測序該實(shí)施例說明了編碼單克隆抗體2H7的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA分子的克隆。該實(shí)施例也證明了2H7scFv-Ig的構(gòu)建、測序和表達(dá)。
特異性結(jié)合于CD20的表達(dá)2H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞是由華盛頓州西雅圖的華盛頓大學(xué)的Ed Clark提供的。在收獲之前，將雜交瘤細(xì)胞在補(bǔ)加了谷氨酰胺、丙酮酸、DMEM非必須氨基酸和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中維持于對數(shù)生長期。通過離心從培養(yǎng)基重沉淀細(xì)胞，用2×107個(gè)細(xì)胞制備RNA。使用Pharmingen(San Diego，CA)總RNA分離試劑盒(目錄號45520K)根據(jù)試劑盒所附制造商的說明從產(chǎn)生2H7的雜交瘤細(xì)胞分離RNA。用1微克(μg)總RNA作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。結(jié)合RNA和300ng隨機(jī)引物并且在加入酶之前在72℃下變性10分鐘。在5X第二條鏈緩沖液存在下以總體積25μl向RNA加引物混合物中加入Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，并且隨酶提供0.1M DTT。在42℃下使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。
用隨機(jī)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)產(chǎn)生的2H7 DNA和V區(qū)特異性引物通過PCR擴(kuò)增2H7抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)。以公開序列(VL的Genbank編號M17954，VH為M17953)為指導(dǎo)，設(shè)計(jì)V區(qū)特異性引物。兩個(gè)可變鏈設(shè)計(jì)為具有相容末端序列，使得可以通過在擴(kuò)增和限制酶消化后連接兩個(gè)V區(qū)而組裝scFv。
通過向2H7的VL的反義引物加入額外的核苷酸而摻入將在兩個(gè)V區(qū)之間插入的(gly4ser)3肽接頭。也在兩個(gè)V區(qū)的接合處引入Sac I限制位點(diǎn)。用于擴(kuò)增包含限制位點(diǎn)HindIII的2H7 VL和輕鏈前導(dǎo)肽的有義引物為5′-gtcaag cttgcc gccatggat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3′(SEQ ID NO23)。反義引物為5′-gtc gtcgag ctccca cct cct cca gat ccacca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtccc-3′(SEQ ID NO24)。V區(qū)的閱讀框架表示為粗體，加下劃線的密碼子。Hind II和SacI位點(diǎn)表示為加下劃線的斜體序列。
對VH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行擴(kuò)增，而沒有前導(dǎo)肽，但包含用于融合于VL的5′SacI限制位點(diǎn)和用于融合于各種尾，包括人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域和截短形式的CD40配體CD154的位于3’末端的BclI限制位點(diǎn)。有義引物為5′-gct gctgag ctctcaggc tta tct aca gca agt ctg g-3′(SEQ ID NO25)。SacI位點(diǎn)表示為斜體和加下劃線的字體。VH結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)氨基酸的密碼子的閱讀框架表示為粗體和加下劃線的字體。反義引物為5′-gtt gtctga tcagagacg gtg acc gtg gtc cc-3′(SEQ ID NO26)。BelI位點(diǎn)表示為斜體和加下劃線的字體。VH結(jié)構(gòu)域序列的最后一個(gè)絲氨酸表示為粗體和加下劃線的字體。
通過將2H7 scFv HindIII-BclI片段插入含人IgG1鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)、用限制性酶HindIII和BclI消化的pUC19中而組裝scFv-Ig。連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)菌中。用位于作為診斷位點(diǎn)的2H7的VL-VH結(jié)合處的SacI位點(diǎn)篩選陽性克隆的適當(dāng)插入的片段。使2H7scFv-Ig cDNA在熱循環(huán)儀上進(jìn)行循環(huán)測序，采用25個(gè)循環(huán)的程序，在96℃變性10秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸4分鐘。測序引物是pUC正向和反向引物和退火于IgG恒定區(qū)部分中的人CH2結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部引物。用Big Dye Terminator Ready測序混合物(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測序反應(yīng)。隨后用Centrisep柱(目錄號CS-901，PrincetonSeparations，Adelphia，N.J.)純化樣品，并且在Savant真空干燥器中干燥，在模板抑制試劑(PE-ABI)中變性，并且在ABI 310基因分析儀(PE-Applied Biosystems)上分析。用Vector Nti 6.0版(Informax，North Bethesda，MD)編輯、翻譯和分析序列。圖1表示2H7scFv-Ig構(gòu)建體的cDNA和推測氨基酸序列。
實(shí)施例22H7 SCFV-IG在穩(wěn)定CHO細(xì)胞系中的表達(dá)該實(shí)施例說明在真核細(xì)胞中表達(dá)2H7scFv-Ig，以及通過SDS-PAGE和功能測定，包括ADCC和補(bǔ)體固定鑒定被表達(dá)的2H7scFv-Ig。
將具有正確序列的2H7scFv-Ig HindIII-XbaI(約1.6kb)插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pD18，用QIAGEN治療制備試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)擴(kuò)增陽性克隆的DNA。然后在非必要區(qū)通過用AscI消化將重組質(zhì)粒DNA(100μg)線性化，通過酚提取而純化，在組織培養(yǎng)基Excell302(目錄號14312-79P，JRH Biosciences，Lenexa，KS)中重懸。使用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CHO DG44細(xì)胞處于對數(shù)生長，每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)收獲107個(gè)細(xì)胞。將線性化的DNA以0.8ml的總體積加入CHO用于電穿孔。
通過可選擇、可擴(kuò)增質(zhì)粒pD18的電穿孔至中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中完成2H7 scFv-Ig融合蛋白(SEQ.ID NO15)的穩(wěn)定產(chǎn)生，該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子控制下的2H7 scFv-Ig cDNA。將2H7表達(dá)盒作為約1.6kb的HindIII-XbaI片段亞克隆至CMV啟動(dòng)子下游載體多克隆位點(diǎn)中。pD18載體是編碼DHFR可選擇標(biāo)記的pcDNA3的修飾形式，用減弱的啟動(dòng)子增加質(zhì)粒的選擇壓力。用Qiagen maxiprep試劑盒制備質(zhì)粒DNA，然后在酚提取和乙醇沉淀之間在獨(dú)特的AscI位點(diǎn)線性化純化的質(zhì)粒。將鮭魚精子DNA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作為載體DNA加入，用100μg每種質(zhì)粒和載體DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)染107個(gè)CHO DG44細(xì)胞。在含有谷氨酰胺(4mM)、丙酮酸、重組胰島素、青霉素-鏈霉素和2X DMEM非必須氨基酸(均來自于Technologies，Gaithersburg，Maryland)的Excell 302培養(yǎng)基(JRHBiosciences，此后稱作“Excell 302完全”培養(yǎng)基)中使細(xì)胞生長至對數(shù)期。用于被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基也含有HT(從次黃嘌呤和胸苷的100X溶液稀釋)(Life Technologies)。用于在選擇下轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基含有各種水平的作為選擇試劑的氨甲喋呤(Sigma-Aldrich)，濃度為50nM-5μM。在275伏特，950μF下進(jìn)行電穿孔。允許轉(zhuǎn)染細(xì)胞在非選擇性培養(yǎng)基中回收過夜，然后在96孔平底板(Costar)中，以125細(xì)胞/孔-2000細(xì)胞/孔的各種系列稀釋進(jìn)行選擇性鋪板。用于細(xì)胞克隆的培養(yǎng)基是Excell 302完全培養(yǎng)基，含有100nM氨甲喋呤。一旦克隆生長足夠，篩選孔中的培養(yǎng)上清液的系列稀釋液中與CD20-CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。將具有最高融合蛋白產(chǎn)量的克隆擴(kuò)增至T25燒瓶，然后擴(kuò)增至T75燒瓶中，以提供足夠數(shù)量的細(xì)胞，用于冷凍和2H7scFvIg的擴(kuò)大產(chǎn)生。通過在含氨甲喋呤的培養(yǎng)基中逐步擴(kuò)增而在三個(gè)克隆的培養(yǎng)物中進(jìn)一步增加產(chǎn)生水平。在細(xì)胞的每個(gè)連續(xù)傳代中，Excell 302完全培養(yǎng)基含有增加濃度的氨甲喋呤，這樣只有擴(kuò)增了DHFR質(zhì)粒的細(xì)胞可以存活。
從表達(dá)2H7scFv-Ig的CHO細(xì)胞收集上清液，通過0.2μm PES加壓濾膜(Nalgene，Rochester，NY)進(jìn)行過濾，然后通過蛋白A-瓊脂糖(IPA 300交聯(lián)瓊脂糖)柱(Repligen，Needham，MA)。用PBS洗滌柱，然后用pH 3.0的0.1M檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。收集級分并且用1M Tris，pH 8.0中和洗脫的蛋白，然后在PBS中透析過夜。通過280nm處的吸光度測定純化的2H7scFv-Ig(SEQ ID NO15)的濃度。用VectorNti軟件包(Informax，North Bethesda，MD)中的蛋白分析工具測定出1.77的消光系數(shù)。該程序使用氨基酸組合物數(shù)據(jù)計(jì)算消光系數(shù)。
通過流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定CHO細(xì)胞的2H7scFv-Ig產(chǎn)生水平。使CHO細(xì)胞的純化2H7scFv-Ig與表達(dá)CD20的CHO細(xì)胞(CD20CHO)結(jié)合，并且使用熒光素偶聯(lián)的抗人IgG第二步驟試劑(目錄號H10101和H10501，CalTag，Burlingame，CA)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。圖2(上)表示通過滴定2H7scFv-Ig與CD20 CHO的結(jié)合產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在2H7scFv-Ig的每一個(gè)濃度下，表示出了以線性單位表示的熒光信號平均亮度。從含有表達(dá)2H7scFv-Ig的穩(wěn)定CHO細(xì)胞克隆的T燒瓶中收集上清液，然后使其與CD20 CHO結(jié)合，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合。測量由上清液中含有的2H7scFv-Ig產(chǎn)生的熒光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中的2H7scFv-Ig濃度(圖2，下)。
通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化的2H7scFv-Ig(SEQ IDNO15)。通過獨(dú)立的蛋白A瓊脂糖柱純化的2H7scFv-Ig樣品在沒有二硫鍵還原的SDS樣品緩沖液中煮沸，并應(yīng)用于SDS 10％ Tris-BIS凝膠(目錄號NP0301，Novex，Carlsbad，CA)。將20微克每種純化的批量樣品加載到凝膠上。電泳后通過考馬斯亮蘭(Pierce Gel Code BlueStain Reagent，目錄號24590，Pierce，Rockford，IL)顯色，然后在蒸餾水中脫色。在相同的凝膠上包含分子量標(biāo)記(Kaleidoscope PrestainedStandards，目錄號161-0324，Bio-Rad，Hercules，CA)。結(jié)果表示于圖3。泳道上的數(shù)字表示獨(dú)立的純化批。以千道爾頓表示的大小標(biāo)記的分子量表示于圖左側(cè)。用替代樣品制備條件進(jìn)行的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表示通過在含有DTT或2-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液中煮沸蛋白而進(jìn)行的二硫鍵還原導(dǎo)致2H7scFv-Ig聚集。
用本領(lǐng)域公知的常規(guī)測定可以監(jiān)測任何其它的免疫參數(shù)。這些測定可以包括，例如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)測定，第二體外抗體應(yīng)答，采用確立的標(biāo)記抗原系統(tǒng)進(jìn)行的多種外周血或淋巴單核細(xì)胞亞群流式免疫細(xì)胞熒光測定分析，免疫組化或其它相關(guān)測定。這些和其它測定可以參加，例如Rose et al.(Eds.)，Manual ofClinical Laboratory Immunology，5thEd.，1997 American Society ofMicrobiology，Washington，DC。
用B細(xì)胞系Ramos和Bjab在補(bǔ)體存在下檢測2H7scFv-Ig殺滅CD20陽性細(xì)胞的能力。在測定中使用最終稀釋度為1/10的兔補(bǔ)體(PelFreez，Rogers，AK)。用B細(xì)胞和補(bǔ)體在37℃下將純化的2H7scFv-Ig孵育45分鐘，然后通過臺昐藍(lán)排除計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。圖4A的結(jié)果表明，在兔補(bǔ)體存在下，2H7scFv-Ig裂解表達(dá)CD20的細(xì)胞。
通過在4小時(shí)測定中使用100∶1的PBMC與Bjab細(xì)胞比例測量51Cr從標(biāo)記的Bjab細(xì)胞的釋放而檢驗(yàn)2H7scFv-Ig在外周血單核細(xì)胞(PBMC)存在下殺滅CD20陽性細(xì)胞的能力。圖4B所示結(jié)果表明，2H7scFv-Ig可以介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，因?yàn)镻BMC和2H7scFv-Ig存在下的51Cr釋放高于PBMC或2H7scFv-Ig單獨(dú)存在下的51Cr釋放。
實(shí)施例3CD20和CD40的同時(shí)連接對正常B細(xì)胞生長，以及對CD95表達(dá)和凋亡誘導(dǎo)的作用該實(shí)施例說明了細(xì)胞表面表達(dá)的CD20和CD40的交聯(lián)對細(xì)胞增殖的作用。
通過Percoll分步梯度從人扁桃體分離密集的靜息B細(xì)胞，通過E-rosetting去除T細(xì)胞。通過4天實(shí)驗(yàn)的最后12個(gè)小時(shí)的3[H]-胸苷攝取測量密集的扁桃體B細(xì)胞。在四份培養(yǎng)物中測量增殖，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差如圖所示。使用單獨(dú)的或與抗鼠κmAb 187.1(抗CD20XL)交聯(lián)的鼠抗人CD20 mAb 1F5(抗CD20)。使用與鼠CD8(CD154)(Hollenbaugh et al.，EMBO J 114212-21(1992))融合的可溶性人CD154完成CD40激活，使用抗鼠CD8 mAb 53-6(CD154XL)完成CD40交聯(lián)。該程序允許細(xì)胞表面CD20和CD40的同時(shí)交聯(lián)。結(jié)果見圖5。
檢驗(yàn)了CD20和CD40在一種B淋巴瘤細(xì)胞系Ramos細(xì)胞上的交聯(lián)。使用特異性結(jié)合于CD20(1F5)和CD40(G28-5)的鼠單克隆抗體分析處理(無山羊抗小鼠IgG(GAM))后18小時(shí)Ramos細(xì)胞的CD95(Fas)表達(dá)和凋亡百分比和/或交聯(lián)(+GAM)。用特異于CD3的非結(jié)合性同種型對照(64.1)處理對照細(xì)胞。
收獲處理后的Ramos細(xì)胞，用FITC-抗-CD95孵育，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析測定CD20或CD40交聯(lián)后細(xì)胞表面上的Fas相對表達(dá)水平。將數(shù)據(jù)作圖為用指出的刺激處理后細(xì)胞的平均熒光(圖6A)。
收獲相同實(shí)驗(yàn)的處理后的Ramos細(xì)胞，測定膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，用于表示經(jīng)處理的培養(yǎng)物中的凋亡百分比。使用1F5和G28-5以及隨后的與GAM的交聯(lián)，通過CD20和CD40交聯(lián)18小時(shí)后的膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合而測量凋亡。使用FITC-膜聯(lián)蛋白V試劑盒(目錄號PN-IM2376，Immunotech，Marseille，F(xiàn)rance，)測量膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合。已知膜聯(lián)蛋白V結(jié)合是細(xì)胞發(fā)展為凋亡中的早期事件。凋亡，或程序性細(xì)胞死亡，是以通過自殺導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分解代謝反應(yīng)級聯(lián)為特征的過程。在凋亡的早期階段中，在細(xì)胞改變外形和水解DNA之前，保持了細(xì)胞膜的完整性，但細(xì)胞失去了它們的膜磷脂的不對稱性，暴露了帶負(fù)電的磷脂，如細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸。膜聯(lián)蛋白V，即一種鈣和磷脂結(jié)合蛋白，優(yōu)先結(jié)合磷脂酰絲氨酸，并且對其有高親和力。證明CD20和CD40的交聯(lián)對FAS受體(CD95)表達(dá)的作用的結(jié)果表示于圖6B。CD20和CD40的交聯(lián)對膜聯(lián)蛋白結(jié)合于細(xì)胞的作用見圖6B。
實(shí)施例42H7 ScFv-CD 154融合蛋白的構(gòu)建和表征為了構(gòu)建能夠結(jié)合CD20和CD40這兩者的分子，將編碼2H7 scFv的cDNA與編碼CD154，即CD40配體融合的cDNA。從2H7 scFvIg構(gòu)建體去除在HindIII-BclI片段上編碼的2H7 scFv cDNA，與編碼人CD154的胞外域的BamHI-XbaI cDNA片段一起插入pD18載體。胞外域在CD154的羧基末端編碼，與其它II型膜蛋白相似。
用隨機(jī)引物和來自于用PHA(植物凝集素)激活的人T淋巴細(xì)胞的RNA對人CD154的胞外域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物組包括兩個(gè)不同的5’或有義引物，它們在CD154的胞外域中的兩個(gè)不同位置產(chǎn)生融合接合處。兩個(gè)不同融合接合處設(shè)計(jì)為產(chǎn)生一種包含胞外域的氨基酸108(Glu)-261(Leu)+(Glu)的短或截短形式(S4形)，以及包含胞外域的氨基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的長或完全形式(L2形)，它們都構(gòu)建為BamHI-XbaI片段。將兩個(gè)不同的截短胞外域融合于2H7scFv的有義引物包括用于克隆的BamHI位點(diǎn)。CD154 cDNA的S4形的有義引物命名為SEQUENCE ID NO27或CD154BAM108，并且編碼具有以下序列的34聚體5′-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tgaaat gca a-3′，而反義引物命名為SEQUENCE ID NO28或CD154XBA，并且編碼具有以下序列的44聚體5′-gtt gtt tct aga tta tcactc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3′。
用于擴(kuò)增CD154胞外域的長形式(L2)的編碼氨基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的寡核苷酸引物如下命名為CD154 BAM48(SEQUENCE ID NO29)的有義引物編碼具有以下序列的35聚體5′-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3′。命名為CD154XBA(SEQUENCE ID NO28)的反義引物編碼具有以下序列的44聚體5′-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3′。其它PCR反應(yīng)條件與用于擴(kuò)增2H7 scFv的條件相同(見實(shí)施例1)。用PCR快速試劑盒(QIAGEN，San Diego，CA)純化PCR片段，在30μl ddH2O中洗脫，然后用BamHI和XbaI(Roche)限制性內(nèi)切酶在37℃下以40μl的反應(yīng)體積消化3小時(shí)。凝膠純化片段，根據(jù)制造商的說明(QIAGEN)用QIAEX試劑盒純化，并且與2H7 HindIII-BclI片段一起連接到用HindIII+XbaI消化的pD18表達(dá)載體中。將連接反應(yīng)轉(zhuǎn)移到DH5-α化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌中，并且鋪于含100μg/ml氨芐青霉素的LB板上。使轉(zhuǎn)染物在37℃生長過夜，用分離的菌落接種含100μg/ml氨芐青霉素的Luria培養(yǎng)液中的3ml液體培養(yǎng)物。微量質(zhì)粒制備(QIAGEN)后篩選用于插入2H7 scFv和CD154胞外域片段的克隆。
在PE 9700熱循環(huán)儀上使用25個(gè)循環(huán)的程序?qū)?H7scFv-CD154構(gòu)建體cDNA進(jìn)行循環(huán)測序，包括在96℃變性10秒，在50℃退火5秒，在60℃延伸4分鐘。使用的測序引物為pD18正向(SEQ ID NO305′-gtctatataagcagagctctggc-3′)和pD18反向(SEQ ID NO315′-cgaggctgatcagcgagctctagca-3′)引物。此外，使用了與人CD154序列(SEQ ID NO325′-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3′)具有特異性的內(nèi)部引物。測序反應(yīng)包含3.2pmol的引物，約200ng DNA模板，以及8μl測序混合物。使用Big Dye Terminator Ready測序混合物(PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測序反應(yīng)。隨后用Centrisep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)純化樣品。在Savant加速真空干燥器中干燥洗脫物，95℃下在20μl模板抑制試劑(ABI)中變性2分鐘，并且在ABI 310基因分析儀(PE-AppliedBiosystems)上分析。使用Vector Nti 6.0版(Informax，North Bethesda，MD)編輯、翻譯和分析序列。2H7scFv-CD 154 L2 cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列見圖7A，2H7scFv-CD154 S4 cDNA cDNA序列和預(yù)測的氨基酸序列見圖7B。
通過流式細(xì)胞術(shù)測定了2H7 scFv-CD154融合蛋白(SEQ.ID NO33和34)與CD20和CD40的同時(shí)結(jié)合活性。該測定使用表達(dá)CD20的CHO細(xì)胞靶。用2H7 scFv-CD154表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液孵育CD20 CHO細(xì)胞45分鐘后，洗滌CD20 CHO細(xì)胞兩次，用PBS/2％FBS中的生物素偶聯(lián)的CD40-Ig融合蛋白孵育。45分鐘后，洗滌細(xì)胞兩次，用1∶100溶于PBS/2％FBS的藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鏈霉素(Molecular Probes，Eugene OR)進(jìn)行孵育。孵育額外的30分鐘后，洗滌細(xì)胞兩次，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明2H7 scFv-CD154分子能夠結(jié)合細(xì)胞表面上的CD20并且從溶液中捕獲生物素偶聯(lián)的CD40。
為確定2H7scFv-CD154對B淋巴瘤和成淋巴細(xì)胞系的生長和存活的作用，用2H7scFv CD154 L2(SEQ.ID NO33)孵育細(xì)胞12小時(shí)，然后檢驗(yàn)?zāi)ぢ?lián)蛋白V的結(jié)合。使用FITC-膜聯(lián)蛋白V試劑盒(Immunotech，Marseille，F(xiàn)rance，目錄號PN-IM2376)測量膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合。用來自于表達(dá)分泌形式的2H7scFv-CD 154融合蛋白的細(xì)胞的濃縮、經(jīng)滲透上清液的稀釋液在1ml培養(yǎng)物中孵育B細(xì)胞系。
通過24小時(shí)培養(yǎng)的最后6小時(shí)的3H-胸苷攝取檢驗(yàn)2H7scFv-CD154存在下Ramos B淋巴瘤細(xì)胞的生長速度。2H7scFv-CD154對細(xì)胞增殖的作用見圖10。
實(shí)施例5CYTOXB抗體衍生物的構(gòu)建和表征CytoxB抗體衍生自2H7 scFv-IgG多肽。通過改變的鉸鏈區(qū)(見圖11)將2H7 scFv(見實(shí)施例1)連接于人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域。通過定點(diǎn)誘變和其它本領(lǐng)域公知的方法用絲氨酸殘基取代鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基。將突變鉸鏈區(qū)融合于野生型Fc結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生一種命名為CytoB-MHWTG1C的構(gòu)建體，或融合于在CH2結(jié)構(gòu)域中引入了額外突變的突變Fc結(jié)構(gòu)域(CytoxBMHMG1C)。與效應(yīng)物功能有關(guān)的CH2中的氨基酸序列見圖11。這些殘基中的一個(gè)或多個(gè)的突變可以減少FcR結(jié)合和效應(yīng)物功能的介導(dǎo)。在此實(shí)施例中，在2H7 scFv融合蛋白CytoxB[MG1H/MG1C]中，本領(lǐng)域公知對Fc受體結(jié)合具有重要性的亮氨酸殘基234進(jìn)行了突變。在另一構(gòu)建體中，用人IgA鉸鏈區(qū)的一部分取代了人IgG1鉸鏈區(qū)，該部分與野生型人Fc結(jié)構(gòu)域融合(CytoxB-IgAHWTHGIC)(見圖11)。該突變的鉸鏈區(qū)允許保持了人IgG1 CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的功能特性的單體和二聚體分子混合物的表達(dá)。根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法構(gòu)建了用于這些分子的重組cDNA表達(dá)盒并且在CHODG44細(xì)胞中表達(dá)了多肽。
根據(jù)實(shí)施例2中描述的方法通過SDS-PAGE分析了CytoxB-scFvIg分子的純化融合蛋白衍生物。在非還原和還原條件下進(jìn)行了聚丙烯酰氨凝膠電泳。在每個(gè)凝膠上加載兩個(gè)不同的分子量標(biāo)記系列BioRad預(yù)染色標(biāo)記(BioRad，Hercules，CA)和Novex Multimark分子量標(biāo)記。不同構(gòu)建體和RituximabTM的遷移模式見圖12。
用Bjab B淋巴瘤細(xì)胞作為靶和新制備的人PBMCs作為效應(yīng)細(xì)胞測量CytoxB-scFvIg分子的不同衍生物介導(dǎo)ADCC的能力(見實(shí)施例2)。效應(yīng)物與靶的比例改變?nèi)缦?0∶1，35∶1，和18∶1，每孔的Bjab細(xì)胞數(shù)保持恒定，但PBMCs的數(shù)目不同。用51Cr標(biāo)記Bjab細(xì)胞2小時(shí)，以5×104細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度等分至平底96孔板的每個(gè)孔中。以10mg/ml的濃度將純化的融合蛋白或rituximab加入PBMCs的各種稀釋液。在不添加PBMC或融合蛋白的情況下測量自發(fā)釋放，通過向適當(dāng)?shù)目刂萍尤胂礈靹?1％NP-40)而測量最大釋放。將反應(yīng)孵育4小時(shí)，將100μl培養(yǎng)上清液收獲至Lumaplate(Packard Instruments)并且干燥過夜，然后計(jì)數(shù)釋放的cpm。結(jié)果見圖13。
也測量了CytoxB衍生物的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性?；景磳?shí)施例2中的描述進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果見圖14，表示為每個(gè)融合蛋白濃度下死亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。
實(shí)施例6在獼猴中進(jìn)行的體內(nèi)研究在非人靈長類動(dòng)物中進(jìn)行了CytoxB衍生物的初步體內(nèi)研究。圖15表示了鑒定CytoxB在猴中的血清半衰期的數(shù)據(jù)。在箭頭所示日，給予每只猴6mg/kg的劑量后，對從兩只不同的獼猴(J99231和K99334)獲得的血清樣品進(jìn)行測量。對于每種樣品，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較評估存在的2H7scFvIg水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過純化CytoxB-(MHWTGlC)-Ig融合蛋白與CD20 CHO細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生的(見實(shí)施例2)。數(shù)據(jù)見圖15下部。
研究了CytoxB-(MHWTGlC)Ig融合蛋白對所研究的獼猴中循環(huán)CD40+細(xì)胞水平的作用。在圖16所示的每一天進(jìn)行全血計(jì)數(shù)。此外，使用CD40特異性熒光素偶聯(lián)的抗體對外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行FACS(熒光激活細(xì)胞分類)測定，以檢測細(xì)胞群中的B細(xì)胞。然后用陽性細(xì)胞百分比計(jì)算原始樣品中的B細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)作圖為注射后的體定日測量的千B細(xì)胞數(shù)/升血液(圖16)。
實(shí)施例7抗-CD19 scFv-IG融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)根據(jù)實(shí)施例1、2和5描述的方法以及本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建了抗-CD19scFv-Ig融合蛋白，將其轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞，并進(jìn)行表達(dá)。從分離自產(chǎn)生抗體HD37的雜交瘤細(xì)胞的RNA克隆重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，HD37特異性結(jié)合于CD19。測量了HD37scFv-IgAHWTG1C和HD37scFv-IgMHWTG1C的表達(dá)水平，并且與用純化HD37 scFvIg產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，結(jié)果見圖17。
實(shí)施例8抗-L6 scFv-IG融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)用來源于抗癌mAb即L6的可變區(qū)構(gòu)建scFv-Ig融合蛋白。根據(jù)實(shí)施例1、2和5描述的方法以及本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建融合蛋白，轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中，并且進(jìn)行表達(dá)。測量了L6scFv-IgAHWTG1C和L6scFv-IgMHWTG1C的表達(dá)水平，并且與用純化HD37 scFvIg產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，結(jié)果見圖18。
實(shí)施例9多種scFv-IG融合蛋白的表征除已經(jīng)描述的scFv-Ig融合蛋白，基本按實(shí)施例1和5的描述制備G28-1(抗CD37)scFv-Ig融合蛋白。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)。根據(jù)上述方法(見實(shí)施例2)確定2H7-MHWTG1C，2H7-IgAHWTG1C，G28-1-MHWTG1C，G28-1 IgAHWTG1C，HD37-MHWTG1C和HD37-IgAHWTG1C的ADCC活性。結(jié)果見圖19。用2981人肺癌細(xì)胞系測量L6scFv-IgAHWTG1C和L6scFv-IgMHWTG1C的ADCC活性。結(jié)果見圖20。已知鼠L6單克隆抗體沒有ADCC活性。
通過SDS-PAGE在還原和非還原條件下分析純化蛋白。基本按實(shí)施例2和5的描述制備樣品和進(jìn)行凝膠電泳。L6和2H7 scFv-Ig融合蛋白的結(jié)果見圖21，G28-1和HD37 scFv-Ig融合蛋白的結(jié)果見圖22。
從上文中可以理解，盡管處于說明的目的描述了本發(fā)明的許多特定實(shí)施方案，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下進(jìn)行多種修飾。因此，本發(fā)明并不受其限制，而是由所附權(quán)利要求進(jìn)行限定。
序列表<110>基因工藝公司J.A.勒貝特爾M.海登-勒貝特爾<120>結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白<130>390069.401PC<140>PCT<141>2002-01-17<160>38<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>812<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>V_區(qū)<222>(79)..(396)<223>抗CD20 scFv的輕鏈可變區(qū)<220>
<221>misc_特征<222>(397)..(444)<223>asp-gly3ser(gly4ser)2-ser肽接頭<220>
<221>V_區(qū)<222>(445)..(808)<223>抗CD20 scFv的重鏈可變區(qū)<400>1aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggtg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat ca 812
<210>2<211>1518<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(807)<223>鼠抗人CD20 scFv<220>
<221>C_區(qū)<222>(808)..(1513)<223>人工IgG1 Fc尾，野生型鉸鏈區(qū)，CH2和CH3<400>2aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttgtga caaaactcac840acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc900ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500ccgggtaaat gatctaga 1518<210>3<211>1518<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(807)<223>小鼠抗人CD20 scFv
<220>
<221>C_區(qū)<222>(808)..(1513)<223>突變?yōu)榻z氨酸的鉸鏈區(qū)半胱氨酸(826-829；844-847；853-856)CH2中脯氨酸至絲氨酸的突變破壞效應(yīng)物功能<400>3aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac840acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc900ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500ccgggtaaat gatctaga 1518<210>4<211>1518<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(807)<223>小鼠抗人CD20 scFv<220>
<221>C_區(qū)<222>(808)..(1513)<223>突變?yōu)榻z氨酸的鉸鏈區(qū)半胱氨酸(826-829；844-847；853-856)野生型CH2和CH3結(jié)構(gòu)域介異效應(yīng)物功能<400>4aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac840acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc900ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg960gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500ccgggtaaat gatctaga 1518<210>5<211>1524<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠人嵌合融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(796)<223>小鼠抗人CD20 scFv<220>
<221>N_區(qū)<222>(797)..(864)<223>人IgA鉸鏈區(qū)<220>
<221>C_區(qū)<222>(865)..(1518)<223>人IGG1 CH2和CH3野生型FC結(jié)構(gòu)域<400>5atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataattgcc 60agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag120gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag180ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccccatcca acctggcttc tggagtccct240gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag300gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtt ttaacccacc cacgttcggt360gctgggacca agctggagct gaaagatggc ggtggctcgg gcggtggtgg atctggagga420ggtgggagct ctcaggctta tctacagcag tctggggctg agctggtgag gcctggggcc480tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg540gtaaagcaga cacctagaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt600gatacttcct acaatcagaa gttcaagggc aaggccacac tgactgtaga caaatcctcc660agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgaag actctgcggt ctatttctgt720gcaagagtgg tgtactatag taactcttac tggtacttcg atgtctgggg cacagggacc780acggtcaccg tctctgatca gccagttccc tcaactccac ctaccccatc tccctcaact840ccacctaccc catctccctc atgcgcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc900ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg960
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1020gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1080gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1140gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacaa tctccaaagc caaagggcag 1200ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1260gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1320agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1380tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1440ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1500ctgtctccgg gtaaatgatc taga 1524<210>6<211>711<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人部分融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(705)<223>突變?yōu)榻z氨酸的鉸鏈區(qū)半胱氨酸(19-21；37-39；46-48)<400>6gatcaggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatccc caccgtcccc agcacctgaa 60ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc120tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc180aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag240gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg300ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag360aaaacaatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca420tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat480cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc540acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac600aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac660aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgatctag a 711<210>7<211>729<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人部分融合基因<220>
<221>N_區(qū)<222>(1)..(69)<223>人IgA鉸鏈區(qū)<220>
<221>C_區(qū)<222>(70)..(723)<223>人野生型IGG1 CH2和CH3，F(xiàn)C<400>7gatcagccag ttccctcaac tccacctacc ccatctccct caactccacc taccccatct 60ccctcatgcg cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc120aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc180cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc240
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc300gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc360ctcccagccc ccatcgagaa aacaatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag420gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc480ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg540gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac600agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg660atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa720tgatctaga729<210>8<211>825<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(72)<223>輕鏈前導(dǎo)肽<220>
<221>V_區(qū)<222>(73)..(405)<223>小鼠抗人CD19HD37的輕鏈可變區(qū)<220>
<221>misc_特征<222>(406)..(450)<223>合成的(GLY4SER)3接頭肽<220>
<221>V_區(qū)<222>(454)..(825)<223>小鼠抗人CD19HD37的重鏈可變區(qū)<400>8aagcttgccg ccatggagac agacacactc ctgctatggg tgctgctgct ctgggttcca 60ggctccactg gtgacattgt gctgacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggg120cagagggcca ccatctcctg caaggccagc caaagtgttg attatgatgg tgatagttat180ttgaactggt accaacagat tccaggacag ccacccaaac tcctcatcta tgatgcatcc240aatctagttt ctgggatccc acccaggttt agtggcagtg ggtctgggac agacttcacc300ctcaacatcc atcctgtgga gaaggtggat gctgcaacct atcactgtca gcaaagtact360gaggatccgt ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaaggtgg cggtggctcg420ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatcg tcacaggttc agctgcagca gtctggggct480cagctggtga ggcctgggtc ctcagtgaag atttcctgca aggcttctgg ctatgcattc540agtagctact ggatgaactg ggtgaagcag aggcctggac agggtcttga gtggattgga600cagatttggc ctggagatgg tgatactaac tacaatggaa agttcaaggg taaagccact660ctgactgcag acgaatcctc cagcacagcc tacatgcaac tcagcagcct agcatctgag720gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg gagactacga cggtaggccg ttattactat780gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca825<210>9<211>795<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(72)<223>輕鏈前導(dǎo)肽序列<220>
<221>V_區(qū)<222>(73)..(393)<223>小鼠抗人CD19G28-1的輕鏈可變區(qū)<220>
<221>misc_特征<222>(394)..(441)<223>編碼的合成接頭肽(GLY4SER)3<220>
<221>V_區(qū)<222>(442)..(795)<223>小鼠抗人CD19G28-1的輕鏈可變區(qū)<400>9aagcttgccg ccatggtatc cacagctcag ttccttgggt tgctgctgct gtggcttaca 60ggtggcagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga120gagactgtca ccatcacatg tcgaacaagt gaaaatgttt acagttattt ggcttggtat180cagcagaaac agggaaaatc tcctcagctc ctggtctctt ttgcaaaaac cttagcagaa240ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcagc300agcctgcagc ctgaagattc tggaagttat ttctgtcaac atcattccga taatccgtgg360acgttcggtg gaggcaccga actggagatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg420tcgggtggcg gcggatcgtc agcggtccag ctgcagcagt ctggacctga gctggaaaag480cctggcgctt cagtgaagat ttcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacaat540atgaactggg tgaagcagaa taatggaaag agccttgagt ggattggaaa tattgatcct600tattatggtg gtactaccta caaccggaag ttcaagggca aggccacatt gactgtagac660aaatcctcca gcacagccta catgcagctc aagagtctga catctgagga ctctgcagtc720tattactgtg caagatcggt cggccctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc780gtctcttctg atcag 795<210>10<211>824<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的小鼠SCFV融合基因<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(61)<223>天然輕鏈前導(dǎo)肽<220>
<221>V_區(qū)<222>(62)..(397)<223>小鼠抗人CD22G28-7的輕鏈可變區(qū)<220>
<221>misc_特征<222>(398)..(445)<223>(gly4ser)3接頭肽
<220>
<221>V_區(qū)<222>(445)..(818)<223>小鼠抗人CD22G28-7的重鏈可變區(qū)<220>
<221>misc_特征<222>(819)..(824)<223>BclI限制位點(diǎn)<400>10atggagtcac attcccaggt ctttctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctgtggg 60aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt cagcaggaga aaaggtcact120atgaactgta agtccagtca aagtgttttc tacagttcaa atcagaggaa ttatttggcc180tggtatcagc agaaaccagg gcagtctccc aaattgctga tctactgggc atctactagg240gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatccg ggacagactt tactcttacc300atcagcagtg tacatactga agacctggca gtttattact gtcatcaatt cctctcttcg360tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaggcg gtggtggttc gggtggtggt420ggttcgggtg gcggcggatc ttctcaggtc caactgcagc agcctggggc tgaactggtg480aagcctggga cttcagtgaa gctgtcctgc aaggcctctg gctacacctt caccaactac540tggatggtct gggtgaagca gacgcctgga gaaggccttg agtggattgg agaaattatt600cctagcaacg gtcgtactaa atacaatgag aagttcaaga gcaaggccac actgactgca660gacaaatcct cccgcacagc ctacatgcaa ctcagcagcc tggcatctga ggactctgcg720gtctattatt gtgcaagaga gatgtccatt attactacgg tactgactcc cggtttgctt780actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagcctg atca 824<210>11<211>266<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>INIT_MET<222>(1)..(1)<220>
<221>信號<222>(1)..(22)<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(23)..(128)<223>小鼠抗人CD20的輕鏈可變區(qū)<220>
<221>位點(diǎn)<222>(129)..(144)<223>ASP-(GLY3SER)-(GLY4SER)2-SER接頭肽<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(145)..(266)<223>小鼠抗人CD20的重鏈可變區(qū)<400>11Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp260 265<210>12<211>271<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(271)<223>小鼠抗人CD19 SCFV<400>12Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro50 55 60Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser65 70 75 80Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys100 105 110Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg145 150 155 160Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe165 170 175
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu180 185 190Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn195 200 205Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser210 215 220Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val225 230 235 240Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr245 250 255Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser260 265 270<210>13<211>259<212>PRT<213>小鼠<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(259)<223>小鼠抗人CD37 SCFV<400>13Met Val Ser Thr Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr1 5 10 15Gly Gly Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro50 55 60Gln Leu Leu Val Ser Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser85 90 95Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His His Ser100 105 110Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ala130 135 140Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser145 150 155 160Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly180 185 190Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met210 215 220Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr245 250 255Val Ser Ser<210>14<211>272<212>PRT
<213>小鼠<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(272)<223>小鼠抗人CD22 SCFV<400>14Met Glu Ser His Ser Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Val Phe Tyr Ser Ser Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val His Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys His Gln Phe Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly130 135 140Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val145 150 155 160Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr165 170 175Phe Thr Asn Tyr Trp Met Val Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Glu Gly180 185 190Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ile Pro Ser Asn Gly Arg Thr Lys Tyr195 200 205Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser210 215 220Arg Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala225 230 235 240Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Met Ser Ile Ile Thr Thr Val Leu Thr245 250 255Pro Gly Leu Leu Thr Gly Ala Lys Gly Leu Trp Ser Leu Ser Leu Gln260 265 270<210>15<211>499<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(265)<223>小鼠抗人CD20 SCFV2H7<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(266)..(499)<223>人IgG1野生型鉸鏈區(qū)，CH2，CH3 FC<400>15
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys260 265 270Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly275 280 285Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met290 295 300Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His305 310 315 320Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val325 330 335His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr340 345 350Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly355 360 365Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile370 375 380Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val385 390 395 400Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser405 410 415Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu420 425 430Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro435 440 445Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val450 455 460Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met465 470 475 480His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser485 490 495
Pro Gly Lys<210>16<211>499<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(265)<223>靶向于人CD20的2H7 SCPV<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(265)..(499)<223>突變?yōu)榻z氨酸的鉸鏈區(qū)半胱氨酸(氨基酸272，278，281)CH2中突變?yōu)榻z氨酸的脯氨酸(氨基酸290)<400>16Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser260 265 270Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly275 280 285Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met290 295 300Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
305 310 315 320Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val325 330 335His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr340 345 350Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly355 360 365Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile370 375 380Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val385 390 395 400Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser405 410 415Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu420 425 430Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro435 440 445Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val450 455 460Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met465 470 475 480His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser485 490 495Pro Gly Lys<210>17<211>499<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(265)<223>小鼠抗人CD20 SCFV2H7<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(266)..(499)<223>突變?yōu)榻z氨酸的鉸鏈區(qū)半胱氨酸(氨基酸272，278，281)CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的序列是野生型<400>17Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser260 265 270Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly275 280 285Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met290 295 300Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His305 310 315 320Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val325 330 335His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr340 345 350Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly355 360 365Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile370 375 380Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val385 390 395 400Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser405 410 415Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu420 425 430Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro435 440 445Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val450 455 460Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met465 470 475 480His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser485 490 495Pro Gly Lys<210>18<211>505<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(265)<223>小鼠抗人CD20 SCFV2H7
<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(266)..(288)<223>野生型2GA鉸鏈區(qū)<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(289)..(505)<223>人IGG1 CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，野生型序列<400>18Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ilc Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Pro Val Pro Ser Thr260 265 270Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys275 280 285Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys290 295 300Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val305 310 315 320Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr325 330 335Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu340 345 350Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His355 360 365Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys370 375 380Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln385 390 395 400Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
405 410 415Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro420 425 430Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn435 440 445Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu450 455 460Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val465 470 475 480Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln485 490 495Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys500 505<210>19<211>234<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(234)<223>突變的IGG1鉸鏈區(qū)氨基酸7，13，16)野生型CH2和CH3結(jié)構(gòu)域SCFVIG融合蛋白的替代羧基末端<400>19Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser1 5 10 15Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro20 25 30Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys35 40 45Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp50 55 60Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu65 70 75 80Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu85 90 95His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn100 105 110Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly115 120 125Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu130 135 140Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr145 150 155 160Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn165 170 175Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe180 185 190Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn195 200 205Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr210 215 220Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>20<211>240<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(23)<223>SCFVIG融合蛋白的替代羧基末端<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(24)..(240)<223>人IGG1野生型CH2和CH3 FC<400>20Asp Gln Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro1 5 10 15Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser20 25 30Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg35 40 45Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro50 55 60Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala65 70 75 80Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val85 90 95Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr100 105 110Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr115 120 125Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu130 135 140Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys145 150 155 160Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser165 170 175Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp180 185 190Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser195 200 205Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala210 215 220Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230 235 240<210>21<211>1470<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交體<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(808)<223>小鼠抗人CD20 SCFV<220>
<221>misc_特征<222>(814)..(1455)<223>人胞外域長型，CD154
<400>21aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat ccaagaaggt tggacaagat agaagatgaa840aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa900agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag960gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt 1020gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct 1080gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa 1140aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 1200ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 1260tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 1320ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 1380gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 1440ggcttactca aactcgagtg ataatctaga1470<210>22<211>1290<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交體<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(808)<223>小鼠抗人CD20 SCFV<220>
<221>misc_特征<222>(814)..(1275)<223>人胞外域，短型，CD154<400>22aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat ccagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt840
gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct900gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa960aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 1020ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 1080tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 1140ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 1200gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 1260ggcttactca aactcgagtg ataatctaga1290<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>23gtcaagcttg ccgccatgga ttttcaagtg cagatttttc agc 43<210>24<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>24gtcgtcgagc tcccacctcc tccagatcca ccaccgcccg agccaccgcc acctttcagc 60tccagcttgg tccc 74<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>25gctgctgagc tctcaggctt atctacagca agtctgg 37<210>26<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>26gttgtctgat cagagacggt gaccgtggtc cc 32<210>27<211>34
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>27gttgtcggat ccagaaaaca gctttgaaat gcaa34<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>28gttgtttcta gattatcact cgagtttgag taagccaaag gacg 44<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>29gttgtcggat ccaagaaggt tggacaagat agaag 35<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>30gtctatataa gcagagctct ggc23<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>31cgaggctgat cagcgagctc tagca 25<210>32<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>32ccgcaatttg aggattctga tcacc 25<210>33<211>482<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(266)<223>小鼠抗人CD20 SCFV<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(268)..(481)<223>細(xì)胞外域，長型，人CD154<400>33Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Pro Arg Arg Leu Asp Lys260 265 270
Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr275 280 285Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys290 295 300Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu305 310 315 320Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly325 330 335Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser340 345 350Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met355 360 365Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys370 375 380Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn385 390 395 400Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys405 410 415Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His420 425 430Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val435 440 445Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro450 455 460Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys465 470 475 480Leu Glu<210>34<211>422<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>小鼠-人雜交融合蛋白<220>
<221>位點(diǎn)<222>(1)..(266)<223>小鼠抗人ScFv<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(268)..(421)<223>細(xì)胞外域，短型、人CD154<400>34Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Pro Glu Asn Ser Phe Glu260 265 270Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser275 280 285Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly290 295 300Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln305 310 315 320Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr325 330 335Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser340 345 350Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala355 360 365Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His370 375 380Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn385 390 395 400Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe405 410 415Gly Leu Leu Lys Leu Glu420<210>35<211>63<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>N_區(qū)<222>(1)..(63)<223>只含1個(gè)半胱氨酸的人IGA鉸鏈區(qū)的部分<400>35ccagttccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60tgc 63<210>36<211>21<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>36
Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr1 5 10 15Pro Ser Pro Ser Cys20<210>37<211>763<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(6)<223>融合于氨基末端SCFVS的BCLI位點(diǎn)<220>
<221>N_區(qū)<222>(8)..(752)<223>野生型IGA鉸鏈區(qū)，CH2，CH3結(jié)構(gòu)域截短以去除分泌成分連接<400>37tgatcagcca gttccctcaa ctccacctac cccatctccc tcaactccac ctaccccatc 60tccctcatgc tgccaccccc gactgtcact gcaccgaccg gccctcgagg acctgctctt120aggttcagaa gcgatcctca cgtgcacact gaccggcctg agagatgcct caggtgtcac180cttcacctgg acgccctcaa gtgggaagag cgctgttcaa ggaccacctg accgtgacct240ctgtggctgc tacagcgtgt ccagtgtcct gccgggctgt gccgagccat ggaaccatgg300gaagaccttc acttgcactg ctgcctaccc cgagtccaag accccgctaa ccgccaccct360ctcaaaatcc ggaaacacat tccggcccga ggtccacctg ctgccgccgc cgtcggagga420gctggccctg aacgagctgg tgacgctgac gtgcctggca cgtggcttca gccccaagga480tgtgctggtt cgctggctgc aggggtcaca ggagctgccc cgcgagaagt acctgacttg540ggcatcccgg caggagccca gccagggcac caccaccttc gctgtgacca gcatactgcg600cgtggcagcc gaggactgga agaaggggga caccttctcc tgcatggtgg gccacgaggc660cctgccgctg gccttcacac agaagaccat cgaccgcttg gcgggtaaac ccacccatgt720caatgtgtct gttgtcatgg cggaggtgga ctgataatct aga 763<210>38<211>250<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(3)..(250)<223>截短的形式，去除介導(dǎo)與分泌成分連接的最后三個(gè)氨基酸<400>38Asp Gln Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro1 5 10 15Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg20 25 30Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Ile Leu Thr Cys35 40 45Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr50 55 60Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Asp Arg Asp Leu65 70 75 80Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro85 90 95
Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser100 105 110Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg115 120 125Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn130 135 140Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp145 150 155 160Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys165 170 175Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr180 185 190Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys195 200 205Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala210 215 220Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val225 230 235 240Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp245 250
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽，其中所述鉸鏈區(qū)多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基并且來源于具有一個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(ii)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于具有兩個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區(qū)多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽和(v)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽；(b)與鉸鏈區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)；和(c)與CH2恒定區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽，其中(1)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和補(bǔ)體固定的免疫活性，并且(2)結(jié)合域多肽能夠特異性結(jié)合于抗原。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽是一種突變的鉸鏈區(qū)多肽，并且相對于野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區(qū)多肽，表現(xiàn)出二聚化的能力降低。
3.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結(jié)合域多肽包括至少一種選自免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)多肽和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)多肽的免疫球蛋白可變區(qū)多肽。
4.權(quán)利要求3的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白可變區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白。
5.權(quán)利要求1的結(jié)合域Fv-免疫球蛋白融合蛋白，其中結(jié)合域多肽包含(a)至少一種免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)多肽；(b)至少一種免疫球蛋白重鏈可變區(qū)多肽；和(c)至少一種與(a)的多肽和與(b)的多肽融合的接頭肽。
6.權(quán)利要求5的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白。
7.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中至少一種免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽來源于人免疫球蛋白重鏈。
8.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH2和CH3多肽屬于選自人IgG和人IgA的同種型。
9.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中抗原選自CD19，CD20，CD37，CD40和L6。
10.權(quán)利要求5的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接頭多肽包括至少一種具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽。
11.權(quán)利要求5的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接頭多肽包括具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽的至少三次重復(fù)。
12.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽包括人IgA鉸鏈區(qū)多肽。
13.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結(jié)合域多肽包括CD154胞外域。
14.權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結(jié)合域多肽包括CD154胞外域和至少一種免疫球蛋白可變區(qū)多肽。
15.一種編碼結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的分離的多核苷酸，所述蛋白包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合域多肽，其中所述鉸鏈區(qū)多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基并且來源于具有一個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(ii)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于具有兩個(gè)或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽的突變的鉸鏈區(qū)多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區(qū)多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽和(v)含有一個(gè)半胱氨酸殘基并且來源于野生型人IgA區(qū)多肽的突變的人IgA鉸鏈區(qū)多肽；(b)與鉸鏈區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)；和(c)與CH2恒定區(qū)多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)多肽，其中(1)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和補(bǔ)體固定的免疫活性，并且(2)結(jié)合域多肽能夠特異性結(jié)合于抗原。
16.一種包含與啟動(dòng)子可操作性連接的權(quán)利要求15的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體。
17.用權(quán)利要求16的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
18.生產(chǎn)結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)在允許結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞；和(b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白。
19.含有與生理可接受載體組合的權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白的藥物組合物。
20.治療具有或懷疑具有惡性狀況或B細(xì)胞疾病的受試者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求1的結(jié)合域-免疫球蛋白融合蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中惡性狀況或B細(xì)胞疾病選自B細(xì)胞淋巴瘤和以自身抗體產(chǎn)生為特征的疾病。
22.權(quán)利要求20的方法，其中惡性狀況或B細(xì)胞疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、格雷夫斯病、I型糖尿病、多發(fā)性硬化和自身免疫病。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的結(jié)合域－免疫球蛋白融合蛋白，其特征在于對相關(guān)結(jié)構(gòu)，如抗原、反受體等的結(jié)合域、具有0或1個(gè)半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)多肽、以及免疫球蛋白CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。盡管主要作為單體多肽存在，該融合蛋白能夠ADCC和/或CDC。該融合蛋白可以高表達(dá)水平重組產(chǎn)生。也提供了相關(guān)的組合物和方法，包括免疫治療應(yīng)用。
文檔編號C12N15/62GK1911965SQ20061009369
公開日2007年2月14日 申請日期2002年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月17日
發(fā)明者J·A·勒貝特爾, M·海登-勒貝特爾 申請人:特魯比昂藥品公司