專利名稱：肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不必通過復(fù)雜的合成方法，即能簡便經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)二肽的方法，更具體地說是涉及肽生成酶的基因、肽生成酶、以及用該酶生產(chǎn)二肽的方法。
背景技術(shù)：
二肽應(yīng)用于醫(yī)藥原料、功能性食品等各種領(lǐng)域。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可用作無血清培養(yǎng)基的成分，并因其比L-谷氨酰胺穩(wěn)定、水溶性也更好，從而可以用作輸液成分。
至目前為止，己知的二肽生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，但該生產(chǎn)方法未必是簡單的方法。已知使用化學(xué)合成法的例子有用N-芐氧羰基丙氨酸(以下稱為Z-丙氨酸)和保護(hù)的L-谷氨酰胺的方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)、Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))、用Z-丙氨酸酯和保護(hù)的L-谷氨酸-γ-甲酯的方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))、用Z-丙氨酸和無保護(hù)的谷氨酸的方法(特開平1-96194號公報(bào))、用2-取代的丙酰鹵為原料，合成N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物作為中間體的方法(特開平6-234715號公報(bào))等。
但是，上述的所有方法都必須要引入和脫去保護(hù)基，或合成中間體，所以這些生產(chǎn)方法不能充分滿足對工業(yè)上有利的要求。已知用酶生產(chǎn)二肽的代表性方法有用N保護(hù)、C無保護(hù)的羧基成分和N無保護(hù)、C保護(hù)的胺成分的縮合反應(yīng)(反應(yīng)1)，以及用N保護(hù)、C保護(hù)的羧基成分和N無保護(hù)、C保護(hù)的胺成分的置換反應(yīng)(反應(yīng)2)；作為反應(yīng)1的例子有由Z-天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生產(chǎn)Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法(特開昭53-92729號公報(bào))，作為反應(yīng)2的倒子有由乙酰苯丙氨酸乙酯和亮氨酰胺生產(chǎn)乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺的方法(Biochemical J.，163，531(1977))。有關(guān)用N無保護(hù)、C保護(hù)的羧基成分的方法的研究報(bào)告例很少，在專利WO 90/01555中，描述了用N無保護(hù)、C保護(hù)的羧基成分和N無保護(hù)、C保護(hù)的胺成分進(jìn)行置換反應(yīng)(反應(yīng)3)的例子，例如，由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生產(chǎn)精氨酰亮氨酰胺的方法。在專利EP 278787A中，描述了用N無保護(hù)、C保護(hù)的羧基成分和N無保護(hù)、C無保護(hù)的胺成分進(jìn)行置換反應(yīng)(反應(yīng)4)的例子，例如，由酪氨酸乙酯和丙氨酸生產(chǎn)酪氨酰丙氨酸的方法。這些方法中，能成為最廉價(jià)的生產(chǎn)方法的，自然是屬于保護(hù)基團(tuán)數(shù)最少的反應(yīng)4范疇內(nèi)的反應(yīng)。
但是，先前的技術(shù)中，反應(yīng)4(EP278787A)所用的酶是霉菌、植物來源的比較昂貴的羧肽酶制劑，而且所生產(chǎn)的二肽含有疏水度較高的氨基酸。在反應(yīng)4方面，未見有用細(xì)菌或酵母來源的酶的方法，也未知有關(guān)生產(chǎn)高親水性的丙氨酰谷氨酰胺或丙氨酰天冬氨酸的方法。在這樣的情況下，希望開發(fā)一種該類肽的價(jià)格低廉的工業(yè)生產(chǎn)方法。
另一方面，脯氨酸亞氨肽酶是一種催化N末端含有脯氨酸的肽裂解出該N末端脯氨酸的反應(yīng)的酶，已知這種酶存在于多種生物中。例如，已知在豚鼠(腦)(J.Biol.Chem.，258，6147-6154(1983))、鼠(腦、腎)(Eur.J.Biochem.，190，509-515(1990))等高等動(dòng)物；杏籽(J.Biochem.，92，413-421(1982))等高等植物；細(xì)齒木(Trichodermadenticola)(Infect.Immun.，64，702-708(1996))等口腔螺旋體屬；青霉菌等絲狀菌(特開平1-215288)；香菇等擔(dān)子菌(特開昭58-36387)；皺褶鏈霉菌(Biochem.Biophys.Res.Commun.，184，1250-1255(1992))等放線菌類；變異棒桿菌(J.Appl.Microbiol.，90，449-456(2001))等細(xì)菌中，存在脯氨酸亞氨肽酶。
此外，有關(guān)脯氨酸亞氨肽酶的基因，也已報(bào)道了煙草節(jié)桿菌(FEMSMicrobiol.Lett.，78，191-197(1999))、大腸桿菌(特開平2-113887)、腦膜膿毒性金黃桿菌(Arch.Biochem.Biophys.，336，35-41(1996))、蜂房哈夫尼菌(J.Bioichem.，119，468-474(1996))、debrueckii乳桿菌(Microbiology，140，527-535(1994))、凝結(jié)芽孢桿菌(J.Bacteriol.，174，7919-1925(1994))來源、溫和氣單胞菌來源(J.Biochem，116，818-825(1994))、野油菜黃單胞菌(特開平9-121860)、淋病奈瑟氏球菌(Mol.Microbiol.，9，1203-1211(1993))、費(fèi)氏丙酸桿菌(Appl.Environ.Micropbiol.，64，4736-4742(1998))、粘質(zhì)沙雷氏菌(J.Biochem.，122，601-605(1997))和嗜酸熱原體(FEBS Lett.，398，101-105(1996))的基因克隆和堿基序列。
此外，最近根據(jù)微生物的全基因組的分析，已報(bào)道了多種生物中推測為編碼脯氨酸亞氨肽酶的堿基序列。例如，已報(bào)道了銅綠假單胞菌的基因組的完整堿基序列(Nature，406，959(2000))，并在其中發(fā)現(xiàn)了推測為編碼脯氨酸亞氨肽酶的堿基序列。
另一方面，已發(fā)現(xiàn)，用脯氨酸亞氨肽酶，使L-脯氨酸或DL-脯氨酸的酯與α-氨基酸反應(yīng)，即生成含脯氨酸的二肽(特開平3-13391號公報(bào))。然而，脯氨酸亞氨肽酶是一種催化N末端含有脯氨酸的肽裂解出該N末端脯氨酸的反應(yīng)的酶，根據(jù)其底物特異性，自然考慮到脯氨酰氨基酸是由脯氨酸酯和氨基酸生成，而對于用脯氨酸亞氨肽酶，由脯氨酸以外的氨基酸酯和氨基酸來合成肽卻完全不清楚。當(dāng)然，訖今為止，對于由L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺也是完全未知的。此外，盡管假單胞菌ATCC 12633的脯氨酸亞氨肽酶的部分堿基序列已公開(AF032970)，但對其活性，包括檢測，都尚未進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用廉價(jià)獲得的出發(fā)原料和能夠廉價(jià)提供的酶源(微生物的培養(yǎng)物、微生物菌體、菌體處理物等)，利用對工業(yè)上有利而且簡便的途徑生產(chǎn)二肽的方法。
本發(fā)明人根據(jù)上述的目的反復(fù)努力研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)脯氨酸亞氨肽酶具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成肽的能力。此外，本發(fā)明人還對該酶的基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并用精制重組酶證實(shí)該酶在生成肽時(shí)具有廣譜底物特異性，由此而完成了本發(fā)明。
亦即，本發(fā)明如以下所述[1]下述(A)或(B)所示的蛋白質(zhì)。
(A)具有序列表的序列號5中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(B)具有在序列表的序列號5所述的氨基酸序列中，有1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。
下述(C)或(D)所示的蛋白質(zhì)。
(C)具有序列表的序列號15中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(D)具有序列表的序列號15所述的氨基酸序列中，有1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。
下述(E)或(F)所示的蛋白質(zhì)。
(E)具有序列表的序列號17中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(F)具有在序列表的序列號17所述的氨基酸序列中，有1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。
下述(a)或(b)所示的DNA。
(a)由序列表的序列號4中所述的堿基號57-1295的堿基序列構(gòu)成的DNA(b)與由序列表的序列號4中所述的堿基號57-1295的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交，并編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA[5]下述(c)或(d)所示的DNA。
(c)由序列表的序列號14中所述的堿基號486-1496的堿基序列構(gòu)成的DNA(d)與由序列表的序列號14中所述的堿基號486-1496的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交，并編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA[6]下述(e)或(f)所示的DNA。
(e)由序列表的序列號16中所述的堿基號311-1279的堿基序列構(gòu)成的DNA
(f)與由序列表的序列號16中所述的堿基號311-1279的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格的條件下雜交，并編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA[7]上述[4]-[6]中任意一項(xiàng)所述的DNA，其中的嚴(yán)格的條件為在相當(dāng)于1×SSC及0.1％SDS的鹽濃度、60℃下洗滌的條件。
插入了上述[4]-[7]中任意一項(xiàng)所述的DNA的重組DNA。
導(dǎo)入了上述[4]-[7]中任意一項(xiàng)所述的DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中的DNA按照能使其編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的方式導(dǎo)入。
一種二肽生成酶的生產(chǎn)方法，其特征在于將上述[9]中所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使具有由L-氨基酸酯和L氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中和/或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中積累。
一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于用上述[9]中所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生成的、具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽。
上述[11]中所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
上述[11]或[12]中所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于使具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸而合成二肽。
上述[14]中所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)來源于屬于棒桿菌屬、假單胞菌屬或芽孢桿菌屬的微生物。
上述[14]中所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)來源于谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌和凝結(jié)芽孢桿菌中的任何一種。
上述[14]-[16]中任何一項(xiàng)所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
上述[14]或[17]中任何一項(xiàng)所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于該方法使用屬于棒桿菌屬、假單胞菌屬或芽孢桿菌屬，并具有由L-氨基酸酯和L氨基酸生成二肽的活性的微生物培養(yǎng)物、從該培養(yǎng)物分離的微生物細(xì)胞或該微生物的菌體處理物，由氨基酸酯和氨基酸生產(chǎn)二肽。
上述[19]中所述的肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中的氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
上述[19]中所述的肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
附圖簡述

圖1表示添加抑制劑時(shí)的二肽合成活性。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供一種新的具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的DNA、以及利用該DNA和蛋白質(zhì)生產(chǎn)二肽的方法。本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法中的反應(yīng)用以下的反應(yīng)式表示。如下述化學(xué)式的例子所示，本說明書中所說的“二肽”是指有1個(gè)肽鍵的肽聚合物。
(式1)
(R表示取代或無取代的烴鏈，R1表示氨基酸酯的側(cè)鏈，R2表示氨基酸的側(cè)鏈)氨基酸酯是能以廉價(jià)獲得的化合物。以氨基酸酯和無保護(hù)的氨基酸作為出發(fā)原料，以細(xì)菌、酵母等作為酶源，使其在水中進(jìn)行反應(yīng)的本發(fā)明所述的方法，是新的前所未有的二肽生產(chǎn)方法，從而有可能提供更廉價(jià)二肽，用于醫(yī)藥材料、功能性食品。
以下，按下述順序?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物[II]分離編碼具有肽生成活性的蛋白質(zhì)的DNA[III]肽生成酶的性質(zhì)[IV]二肽的生產(chǎn)方法[I]具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物作為本發(fā)明使用的微生物，沒有特別的限定，可以使用具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物。具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物的例子有芽孢桿菌屬、棒桿菌屬和假單胞菌屬，具體可舉出以下的例子。
枯草芽孢桿菌ATCC 6633
(Bacillus subtilis)凝結(jié)芽孢桿菌EKO1(J.Bacteriol.，174，7919-7925(1992))(Bacillus coagulans)谷氨酸棒桿菌ATCC 13286(Coryebacterium glutamicum)惡臭假單胞菌AJ-2402 FERM BP-8101(Pseudomonas pudida)惡臭假單胞菌ATCC 12633(Pseudomonas pudida)惡臭假單胞菌AJ-2048 FERM BP-8123(Pseudomonas pudida)上述菌株中，以ATCC號表示的菌株保藏在American Type CultureCollection(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)，并可參照各個(gè)號碼提供再培養(yǎng)物。
上述菌株中，以FERM號表示的菌株是保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利微生物保藏中心(亍305-8566茨城縣つくば市東1-1-1中央第6)、并指定保藏號的微生物。惡臭假單胞菌AJ-2402于2001年10月1日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利微生物保藏中心，并指定其保藏號為FERM P-18544，隨后于2002年7月1日轉(zhuǎn)移至國際保藏，保藏號為FERM BP-8101。另外，根據(jù)以下的分類實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)ERM BP-8101(AJ-2402)被鑒定為上述的惡臭假單胞菌。此外，惡臭假單胞菌AJ-2048株于2002年7月22日保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利微生物保藏中心，并指定其保藏號為FERM BP-8123。
惡臭假單胞菌FERM BP-8101株是能運(yùn)動(dòng)的無孢子桿菌，根據(jù)其以下性質(zhì)，鑒定為假單胞菌屬細(xì)菌桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)、革蘭氏陰性、不生成芽孢、有運(yùn)動(dòng)性、菌落形態(tài)圓形，邊緣完全光滑，凸?fàn)?，有光澤，奶油色、?0℃下生長、過氧化氫酶陽性、氧化酶陽性以及OF測試(葡萄糖)陰性。進(jìn)一步根據(jù)以下生理學(xué)性質(zhì)鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudida)硝酸鹽還原陰性、吲哚產(chǎn)生陰性、葡萄糖生成酸陰性、精氨酸二氫酶陽性、脲酶陰性、七葉苷水解陰性、明膠水解陰性、β-半乳糖苷酶陰性、葡萄糖同化陽性、L-阿拉伯糖同化陰性、D-甘露糖同化陽性、D-甘露糖醇同化陽性、N-乙酰-D-葡萄糖胺同化陰性、麥芽糖同化陰性、葡糖酸鉀同化陽性、正癸酸同化陽性、己二酸同化陰性、dl-蘋果酸同化陽性、檸檬酸鈉同化陽性、苯乙酸同化陽性、氧化酶陽性、在King′s B瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光染料陽性、由蔗糖產(chǎn)生果聚糖陽性，以及山梨糖醇的微弱同化作用。
野生株或變異株的任何一種都可用作上述的微生物，此外，通過細(xì)胞融合或基因操作等遺傳方法而得到的重組株等也可以使用。
為了得到這些微生物的菌體，可以使該微生物在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)生長。對所用的培養(yǎng)基無特別限制，只要能使該微生物生長即可，該培養(yǎng)基可以是含有普通的碳源、氮源、磷源、硫源、無機(jī)離子、以及根據(jù)需要含有有機(jī)營養(yǎng)源的普通培養(yǎng)基。
例如，只要可以被上述的微生物利用，任何一種碳源都可使用，具體可以使用的有葡萄糖、果糖、麥芽糖、淀粉糖等糖類；山梨糖醇、乙醇、甘油等醇類；富馬酸、檸檬酸、乙酸和丙酸等有機(jī)酸類及其鹽類；石蠟等碳?xì)浠衔镱惢蛘咚鼈兊幕旌衔锏取?br> 作為氮源，可以使用的有硫酸銨、氯化銨等無機(jī)酸的銨鹽；富馬酸銨、檸檬酸銨等有機(jī)酸銨鹽；硝酸鈉、硝酸鉀等硝酸鹽；胨、酵母提取物、肉類提取物、玉米漿等有機(jī)氮化合物，或它們的混合物。
此外，可以將無機(jī)鹽、微量金屬鹽、維生素等用于普通培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源適當(dāng)?shù)鼗旌鲜褂谩?br> 在培養(yǎng)條件方面也沒有特別的限制，例如，可以在好氣的條件下，使pH和溫度適當(dāng)?shù)乜刂圃趐H為5-8的范圍，和溫度為15-40℃的范圍內(nèi)，培養(yǎng)12-48小時(shí)。
分離編碼具有肽合成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA[II-1]DNA的分離本發(fā)明人從上述的微生物中，分離出本發(fā)明的DNA，并確定其序列，該DNA編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白質(zhì)。從谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株分離出序列表的序列號4中所述的由堿基號57-1295的堿基序列構(gòu)成的DNA。此外，從惡臭假單胞菌ATCC 12633株分離出序列表的序列號14中所述的由堿基486-1496的堿基序列構(gòu)成的DNA。進(jìn)一步再從惡臭假單胞菌FERMBP-8123株分離出序列表的序列號16中所述的由堿基號311-1279的堿基序列構(gòu)成的DNA。另外要說明，本說明書中所說的“序列號4中所述的堿基序列”、“序列號14中所述的堿基序列”、“序列號16中所述的堿基序列”，除非預(yù)先說明，均指CDS部分。
分離DNA的一個(gè)例子如下所述首先，確定精制的肽生成酶的氨基酸序列。該氨基酸序列可以用Edman法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.4，227(1950))測定。此外，也可以用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的測序儀來測定氨基酸序列。測定精制的肽生成酶的N末端、或者測定由精制的肽生成酶通過賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶處理得到的肽的10-30個(gè)殘基的氨基酸序列，根據(jù)測定清楚的氨基酸序列，可以推測編碼該氨基酸序列的DNA的堿基序列。在推測DNA的堿基序列時(shí)，可以采用通用的密碼子。
根據(jù)所推測的堿基序列，合成約30個(gè)堿基對的DNA分子。合成該DNA分子的方法公開在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)中。此外，可以用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的合成儀來合成該DNA分子。用該DNA分子作為引物，通過PCR法，由染色體DNA可以擴(kuò)增編碼肽生成酶的DNA。但是，用PCR法擴(kuò)增的DNA不包含全長的編碼肽生成酶的DNA，因此，可以用PCR法擴(kuò)增的DNA作為探針，由谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌或凝結(jié)芽孢桿菌等各種菌株的染色體基因庫，分離全長的編碼肽生成酶的DNA。
或者，在基因的堿基序列的一部分為已知的場合，可以用含有該已知序列的DNA作為探針，由染色體基因庫，分離全長的編碼肽生成酶的DNA。
還有，在基因的堿基序列與已知的序列有同源性的場合，可以用含有該已知序列的DNA作為探針，由染色體基因庫，分離全長的編碼肽生成酶的DNA。
有關(guān)PCR的操作方法，在White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989)等中描述。有關(guān)染色體DNA的生產(chǎn)方法、以及用DNA分子作為探針，由基因庫分離目的DNA分子的方法，在MolecularCloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)等中已有描述。
測定分離的編碼肽生成酶的DNA堿基序列的方法在A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons，Inc.(1985)等中已有描述。此外，可以用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的測序儀來測定堿基序列。按上述方法，由谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株、惡臭假單孢菌ATCC 12633株、惡臭假單孢菌FERM BP-8123株分離的編碼肽生成酶的DNA分別在序列表的序列號4、14、16中表示。
可以用于本發(fā)明中的DNA不僅是序列表的序列號4、14、16所示的DNA。例如，以下用谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株分離的序列表的序列號4的DNA來說明，即使是經(jīng)過人工誘變，而變?yōu)橛晒劝彼岚魲U菌ATCC 13286株染色體DNA分離的編碼肽生成酶的DNA，就其編碼肽生成酶而言，也屬于本發(fā)明的DNA。常用的人工誘變法有Method.in Enzymol.，154(1987)中所述的定點(diǎn)誘變法。
此外，在嚴(yán)格條件下，與具有序列表的序列號4所述的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸雜交、并編碼具有肽生成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，也是可用于本發(fā)明的DNA。
還有，根據(jù)由序列表的序列4所述的CDS構(gòu)成的DNA制備成探針，通過分離在嚴(yán)格條件下與該探針雜交、而且編碼具有肽合成活性的蛋白質(zhì)的DNA，也可以獲得與本發(fā)明的DNA基本上相同的DNA。探針可以根據(jù)序列表的序列號4所述的堿基序列、按照常規(guī)方法制備。此外，一種利用探針挑選出與其雜交的DNA，從而分離出目的DNA的方法，也可以按照常規(guī)的方法進(jìn)行。例如，DNA探針可以用下述方法制備使克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體中的堿基序列擴(kuò)增，然后用限制酶切出要用作探針的堿基序列，并進(jìn)行抽提。酶切的位點(diǎn)可根據(jù)目的DNA進(jìn)行調(diào)節(jié)。
這里所說的“嚴(yán)格的條件”是指形成所謂特異的雜交、而不形成非特異雜交的條件。雖然該條件很難明確地?cái)?shù)值化，但舉例來說，這些條件包括使同源性高的DNA之間，例如具有50％以上、較優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上同源性的DNA之間發(fā)生雜交，而同源性低于此值的DNA之間不發(fā)生雜交；或者，在60℃、1×SSC、0.1％SDS的通常Southern雜交的洗滌條件下，優(yōu)選在60℃、鹽濃度相當(dāng)于0.1×SSC、0.1％SDS，更優(yōu)選在65℃、鹽濃度相當(dāng)于0.1×SSC、0.1％SDS的條件下雜交。肽生成酶的活性如上述的說明，但是，堿基序列與序列表的序列號4所述堿基序列的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格的條件下雜交時(shí)，要求在50℃、pH8的條件下，保持具有序列表的序列號4所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的10％以上、更優(yōu)選50％以上的酶活性。
還有，與序列表的序列號4所述DNA編碼的肽生成酶基本上相同的蛋白質(zhì)，也可用于本發(fā)明。因此，編碼下述蛋白質(zhì)的DNA也可用于本發(fā)明中，即該蛋白質(zhì)“具有在序列表的序列號5所述氨基酸序列中，包含1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列，而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成肽的酶活性”。這里所說的“多個(gè)”是指，對含氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)、或肽生成酶活性無明顯影響的范圍內(nèi)的個(gè)數(shù)，具體為2-50個(gè)、優(yōu)選2-30個(gè)、更優(yōu)選2-10個(gè)。此外，肽生成酶的活性如上述說明。但是，具有在序列表的序列號5所述氨基酸序列中，包含1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列時(shí)，要求在50℃、pH8的條件下，保持具有序列表的序列號5所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的10％以上、更優(yōu)選50％以上的酶活性。
如以上所述，作為本發(fā)明的DNA，除了由谷氨酸棒桿菌ATCC13286株分離的DNA、由惡臭假單胞菌ATCC 12633株分離的DNA、由惡臭假單胞菌FERM BP-8123株分離的DNA之外，與這些DNA基本上相同的DNA也在本發(fā)明范圍內(nèi)。亦即，本發(fā)明提供的DNA如下(i)含有序列表的序列號4、14或16所述的CDS的DNA。
(ii)與含有序列表的序列號4、14或16所述的CDS的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交、而且編碼具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應(yīng)的肽生成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
(iv)編碼具有序列表的序列號5、15或17所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA。
(v)編碼下述蛋白質(zhì)的DNA具有在序列表的序列號5所述氨基酸序列中，包含1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列、而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應(yīng)的肽生成酶活性的蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)化體的生產(chǎn)下面，對生產(chǎn)表達(dá)具有肽生成酶活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行說明。已知，利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)酶、生理活性物質(zhì)等有用蛋白質(zhì)的例子有很多，通過利用重組DNA技術(shù)可以大量生產(chǎn)天然微量存在的有用蛋白質(zhì)。
可以用于本發(fā)明的方法中的合適的轉(zhuǎn)化體有，例如，能夠表達(dá)下述(AA)、(BB)、(CC)等蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。
(AA)具有序列表的序列號5、15或17所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
(BB)具有在序列表的序列號5所述氨基酸序列中，包含1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列、而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應(yīng)的肽生成酶活性的蛋白質(zhì)。
(CC)由下述DNA編碼的蛋白質(zhì)與含有序列表的序列號4、16或18的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸、或者根據(jù)序列號4、16或18的堿基序列制備的探針，在嚴(yán)格的條件下雜交、而且編碼具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽反應(yīng)的肽生成酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
為了生產(chǎn)表達(dá)上述(AA)-(CC)具有肽生成活性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體，將上述[II-1]欄中所示的(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞即可。即，將(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的DNA插入可能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組DNA中、具體是插入表達(dá)載體等中，然后將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
此外，上述(BB)所示的變異可以通過以下方法獲得，例如，通過定點(diǎn)誘變法，使該酶基因的特定部位氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入、添加的堿基序列改變。此外，上述那樣改變的DNA也可以通過已知的誘變處理而得到。誘變處理的例子包括，將編碼本酶的DNA用羥胺等在體外處理的方法、以及將包含編碼本酶的DNA的大腸桿菌屬細(xì)菌，用紫外照射或者用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、或亞硝酸等通常人工誘變所用的誘變劑處理的方法。
用重組DNA技術(shù)大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)，該蛋白質(zhì)聚集在生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子體內(nèi)而形成包涵體，這種方式也作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。這種表達(dá)和生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)是可防止目的蛋白被菌體內(nèi)存在的蛋白酶所消化、以及目的蛋白可通過將菌體破碎后離心的方法而簡單地進(jìn)行純化等。
這樣所得到的蛋白質(zhì)包涵體用蛋白變性劑溶解后，通過以除去該變性劑為主的活性再生操作，即轉(zhuǎn)變?yōu)檎_折疊的有生理活性的蛋白質(zhì)。例如，包括白細(xì)胞介素-2的活性再生(特開昭61-257931號公報(bào))等許多例子。
為了從蛋白質(zhì)包涵體得到活性型的蛋白質(zhì)，必需經(jīng)過溶解-復(fù)性的一系列操作，因而比直接生產(chǎn)活性型蛋白質(zhì)的方法復(fù)雜。但是，在菌體內(nèi)大量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)影響到菌體的生長時(shí)，通過在菌體內(nèi)積累失活形式的蛋白質(zhì)包涵體，可以抑制該影響。
大量生產(chǎn)包涵體形式的目的蛋白的方法中，除了在強(qiáng)啟動(dòng)子控制下單獨(dú)表達(dá)目的蛋白的方法以外，還有一種方法是使目的蛋白作為己知大量表達(dá)的蛋白質(zhì)的融合蛋白的形式而表達(dá)。
還有，以融合蛋白的形式表達(dá)后，為了將目的蛋白切出，將限制酶的識別序列排列在適當(dāng)?shù)奈恢靡彩且环N可行的方法。
用重組DNA技術(shù)大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)的場合，可用細(xì)菌細(xì)胞、放線菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等作為被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，但一般采用大腸桿菌等腸內(nèi)細(xì)菌、優(yōu)選用大腸桿菌(Escherichia coli)，因?yàn)橛嘘P(guān)用大腸桿菌等腸內(nèi)菌大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)的技術(shù)，積累了很多實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。以下，對用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)肽生成酶的方法中的一種方式加以說明。
通常大腸桿菌中生產(chǎn)異源蛋白所用的啟動(dòng)子可以作為使編碼肽生成酶的DNA表達(dá)的啟動(dòng)子，例如，T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體的PR啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子等強(qiáng)啟動(dòng)子。
為了使肽生成酶以融合蛋白包涵體的形式進(jìn)行生產(chǎn)，在肽生成酶基因的上游或下游，連接編碼其他蛋白質(zhì)，優(yōu)選連接編碼親水性肽的基因，從而形成融合蛋白基因。其中所說的編碼其他蛋白質(zhì)的基因只要是使融合蛋白的積累量增加、變性-復(fù)性過程后提高融合蛋白的溶解性的基因都可以使用，例如，T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脫氫葉酸還原酶基因、干擾素γ基因、白細(xì)胞介素-2基因、凝乳酶原基因等侯選基因。
這些基因和編碼肽生成酶的基因連接時(shí)，按照讀碼框一致的方式進(jìn)行連接；可以在合適的限制酶位點(diǎn)連接，或者使用合適的合成DNA序列進(jìn)行連接。
此外，為了增加產(chǎn)量，優(yōu)選有時(shí)在融合蛋白基因的下游連接終止子形式的轉(zhuǎn)錄終止序列。該終止子包括T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環(huán)素抗性基因的終止子、大腸桿菌trpA基因的終止子等。
優(yōu)選所謂多拷貝型的載體作為將編碼肽生成酶、或編碼肽生成酶和其他蛋白質(zhì)的融合蛋白的基因?qū)氪竽c桿菌的載體，例如具有ColE1來源的復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，如pUC系列的質(zhì)粒、pBR322系列的質(zhì)粒或其衍生物。這里所說的“衍生物”是指對質(zhì)粒通過堿基的置換、缺失、插入、添加或倒位加以修飾后所得的質(zhì)粒。另外，這里所說的修飾包括用誘變劑或紫外照射等誘變處理，或通過自然變異等產(chǎn)生的修飾。更具體地說，可用的載體例如有pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。其他噬菌體DNA、轉(zhuǎn)座子DNA的載體也可以使用。
此外，為了篩選轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選該載體含有氨芐青霉素抗性基因等標(biāo)記。市場上可購買到具有強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體(pUC系列(寶酒造公司生產(chǎn))、pPROK系列(Clontech公司生產(chǎn))、pKK322-2(Clontech公司生產(chǎn))及其他)用作這樣的質(zhì)粒。
將由啟動(dòng)子、編碼肽生成酶或肽生成酶和另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白的基因、以及根據(jù)情況而定的終止子按順序連接起來的DNA片段與載體DNA連接即可得到重組DNA。
用該重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌、并培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的大腸桿菌時(shí)，可使肽生成酶或肽生成酶和另一蛋白質(zhì)的融合蛋白表達(dá)和生產(chǎn)。雖然可以使用異源基因表達(dá)中通常所用的菌株作為轉(zhuǎn)化的宿主，但優(yōu)選用，例如，大腸桿菌JM109菌株。轉(zhuǎn)化的方法、以及轉(zhuǎn)化體篩選的方法在Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)等中已有描述。
以融合蛋白形式表達(dá)的場合，可以用血液凝固因子Xa、激肽釋放酶等肽生成酶內(nèi)不存在的序列作為限制性蛋白酶的識別序列，通過限制性蛋白酶將融合蛋白中的肽生成酶切出。
M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等培養(yǎng)大腸桿菌通常所用的培養(yǎng)基也可以用作生產(chǎn)培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)條件、生產(chǎn)誘導(dǎo)條件可根據(jù)所用的載體的標(biāo)記、啟動(dòng)子、宿主菌等的種類適當(dāng)?shù)剡x擇。
肽生成酶或肽生成酶和另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白的回收有以下等方法。如果肽生成酶或其融合蛋白在菌體內(nèi)是可溶的，回收菌體后，可將菌體破碎或溶菌，作為粗酶液使用。進(jìn)一步根據(jù)需要，也可以通過常規(guī)的沉淀、過濾、層析等技術(shù)將肽生成酶或其融合蛋白純化后使用。在這種場合，也可以采用利用肽生成酶或其融合蛋白的抗體的純化方法。
在形成蛋白質(zhì)包涵體的場合，可用變性劑將其溶解。雖然可以將該蛋白質(zhì)包涵體與菌體蛋白一起溶解，但從隨后的純化操作考慮，優(yōu)選將包涵體取出，然后將其溶解。從菌體中回收包涵體時(shí)，可以采用常規(guī)的已知方法進(jìn)行。例如，通過將菌體破壞、離心操作等回收包涵體。使蛋白質(zhì)包涵體溶化的變性劑有鹽酸胍(例如，6M，pH5-8)、尿素(例如，8M)等。
通過透析將這些變性劑除去后，即復(fù)性為有活性的蛋白質(zhì)。透析中所用的透析溶液可以用Tris-鹽酸緩沖液和磷酸緩沖液，濃度為20mM-0.5M，pH為5-8。
復(fù)性步驟期間的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)選控制在500μg/ml以下。為了抑制再生的肽生成酶本身發(fā)生交聯(lián)，透析溫度優(yōu)選在5℃以下。此外，除去變性劑的方法除了上述的透析法以外，還有稀釋法、超濾法等。預(yù)期用任何一種都可以使酶復(fù)性。
用序列表的序列號4所示的DNA作為編碼肽生成酶的DNA時(shí)，產(chǎn)生具有序列號5所示的氨基酸序列的肽生成酶。此外，用序列表的序列號14所示的DNA作為編碼肽生成酶的DNA時(shí)，產(chǎn)生具有序列號15所示的氨基酸序列的肽生成酶。同樣，用序列表的序列號16所示的DNA作為編碼肽生成酶的DNA時(shí)，產(chǎn)生具有序列號17所示的氨基酸序列的肽生成酶。
另外說明，有關(guān)基因工程的技術(shù)可以按照Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harborpress(1989)等所述的方法進(jìn)行。
肽生成酶的性質(zhì)下面，以谷氨酸棒桿菌ATCC 13286菌株作為上述的微生物中的一例，對由其純化的肽生成酶性質(zhì)進(jìn)行說明。
以L-丙氨酸酯和L-谷氨酰胺為原料(底物)的場合為例，該肽生成酶具有用L-丙氨酸酯和L-谷氨酰胺為底物，產(chǎn)生L-丙氨酰L-谷氨酰胺的活性。此外，以L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺為原料的場合為例，該肽生成酶具有用L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺為底物，產(chǎn)生L-丙氨酰-L-天冬酰胺的活性。
就酶的作用而言，以L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺為原料的場合為例，該肽生成酶由1分子的L-丙氨酸酯和1分子的L-谷氨酰胺，產(chǎn)生1分子的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1分子的醇；由1分子的L-丙氨酸酯和1分子的L-天冬酰胺，產(chǎn)生1分子的L-丙氨酰-L-天冬酰胺和1分子的醇。
最適pH在6.0-10.0附近，最適溫度在30-50℃附近。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時(shí)，計(jì)算得其亞基的分子量為42,000-46,000。
二肽的生產(chǎn)方法本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法是用具有合成二肽活性的酶，或含有該酶的物質(zhì)由L-氨基酸酯和L-氨基酸生產(chǎn)二肽。具體是，用具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、該微生物的菌體處理物、或者該微生物來源的肽生成酶，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生產(chǎn)二肽。另外，只要具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性，上述或者下述表1等中所示微生物來源的、具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)也可以使用。
上述微生物產(chǎn)生的肽生成酶具有以L-氨基酸酯和L-氨基酸為底物生成二肽的活性。
使上述微生物產(chǎn)生的肽生成酶作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法可以是在培養(yǎng)上述微生物時(shí)，直接將底物加入培養(yǎng)液中；也可以在培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心將菌體與培養(yǎng)液或微生物培養(yǎng)物分離后，將菌體直接或洗凈后再懸浮于緩沖液中，然后加入L-氨基酸酯和L-氨基酸使其進(jìn)行反應(yīng)。或者，可以使用由聚丙烯酰胺凝膠法、角叉菜膠法、藻酸凝膠法等已知方法固定化的菌體。
此外，破碎的菌體、丙酮處理的菌體、冷凍干燥的菌體也可以作為微生物菌體的處理物使用。菌體的破碎可以采用超聲波破碎、French壓力破碎、玻璃珠破碎等方法，而在溶菌的場合，采用蛋白溶菌酶、肽酶處理或?qū)⑵溥m當(dāng)組合的方法。
也可以進(jìn)一步從該微生物菌體處理物回收肽生成酶，作為粗酶液使用，還可以根據(jù)需要，將酶純化后使用。普通的酶純化方法可以用于由培養(yǎng)物純化酶。具體是通過以下操作對上述的肽生成酶進(jìn)行純化通過離心分離等收集菌體；用超聲波處理、玻璃珠、電動(dòng)磨等機(jī)械方法破碎菌體；離心分離除去細(xì)胞碎片等固形物，得到粗酶；然后進(jìn)行超離心分級、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾層析、疏水性層析等。
還要說明，所說的“微生物來源的肽生成酶”，不僅包括由該微生物菌體處理物通過上述純化步驟所得的酶，還包括通過使該酶的基因在異源或同源的宿主中表達(dá)、或通過基因工程的方法所生產(chǎn)的酶。
亦即，只要是具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的部分，酶和含酶物都可使用。這里所說的“含酶物”是指含有酶的物質(zhì)，具體的形式包括產(chǎn)生該酶的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、菌體處理物等。微生物的培養(yǎng)物是指培養(yǎng)微生物得到的物質(zhì)，更具體的是指微生物菌體、培養(yǎng)該微生物所用的培養(yǎng)基、以及由培養(yǎng)的微生物所生成的物質(zhì)的混合物。此外，也可以將微生物菌體洗凈，作為洗凈的菌體使用。還有，菌體處理物包括將菌體破碎、溶菌、冷凍干燥后的處理物，還包括將菌體等處理后回收的粗酶、進(jìn)一步純化的精制酶等。用各種純化方法所得的部分純化的酶等也可以作為純化處理的酶使用，還可以使用通過共價(jià)結(jié)合法、吸附法、包埋法等固定化的固定化酶。此外，根據(jù)所用的微生物，在培養(yǎng)中有一部分發(fā)生溶菌現(xiàn)象，所以，在這種情況下，培養(yǎng)液的上清也可以作為含酶物而利用。
另外，在使用培養(yǎng)物、培養(yǎng)菌體、洗凈菌體、破碎菌體或溶菌所得的菌體處理物的場合，大多數(shù)存在與肽的生成無關(guān)的、分解生成的肽的酶，在這種情況下，有時(shí)優(yōu)選添加金屬酶抑制劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬蛋白酶抑制劑。添加量為0.1mM-100mM的范圍，優(yōu)選為1mM-50mM。
酶或含酶物的使用量只要是能達(dá)到目的效果的量(有效量)就可以，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，通過簡單的預(yù)備實(shí)驗(yàn)很容易求得，例如，用于洗凈菌體的場合為每升反應(yīng)液1-500g。
在該肽生成酶的底物特異性方面，只要能與L-氨基酸生成二肽，任何一種L-氨基酸酯都可使用，例如，L-氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯、正丁酯、異丁酯和叔丁酯。此外，不僅對應(yīng)于天然型的L-氨基酸的氨基酸酯可以使用，而且對應(yīng)于非天然型的氨基酸或其衍生物的L-氨基酸酯也可以使用。本發(fā)明中，可優(yōu)選用作L-氨基酸酯的有L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-酯二甲基酯、L-谷氨酰胺-γ-酯。
在該肽生成酶的底物特異性方面，對于L-氨基酸無特別的限定，只要是能與L-氨基酸酯生成二肽的L-氨基酸，已知的L-氨基酸都可以使用。優(yōu)選用于本發(fā)明的L-氨基酸有L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸等，特別優(yōu)選L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。
每種用作出發(fā)原料的L-氨基酸酯和L-氨基酸的濃度為1mM-10M，優(yōu)選0.05M-2M，但有時(shí)優(yōu)選L-氨基酸對L-氨基酸酯的添加量之比為等量以上。此外，必要時(shí)，例如，在高濃度的底物抑制反應(yīng)的場合，可以將反應(yīng)中的底物調(diào)至無抑制的濃度，然后逐步添加。
反應(yīng)溫度為3-70℃、優(yōu)選5-50℃，反應(yīng)pH為2-12、優(yōu)選3-11。這樣，通過進(jìn)行約2-48小時(shí)的反應(yīng)，反應(yīng)混合物中生成并積累了二肽。生成的二肽按常規(guī)的方法回收，并根據(jù)需要進(jìn)行純化。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。另外，實(shí)施例中的L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-天冬酰胺用高效液相色譜法(柱Inertsil ODS-2(GL Science公司生產(chǎn))，洗脫液磷酸水溶液(pH2.2，5.0mM 1-辛烷磺酸鈉溶液/甲醇＝100/15)，流量1.0ml/min，檢測210nm)進(jìn)行定量。
(實(shí)施例1)添加EDTA對L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成的影響在500ml的坂口氏燒瓶中，加入50ml每升含有5g葡萄糖、5g硫酸銨、1g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10g酵母提取物和10g胨的培養(yǎng)基(pH7.0)，在115℃下滅菌15分鐘。然后接種1鉑金環(huán)已在含有同樣組成的斜面培養(yǎng)基(瓊脂20g/L，pH7.0)上，30℃下培養(yǎng)了24小時(shí)的惡臭假單胞菌FERM BP-8101株，在30℃、120次往復(fù)/分鐘下振動(dòng)培養(yǎng)17小時(shí)。培養(yǎng)后，離心分離菌體，然后懸浮于100mM的硼酸緩沖液(pH9.0)中，制備成100g/L的濕菌體。分別取1ml，加入1ml未添加EDTA，或含20mM EDTA的含有200mML-丙氨酸乙酯鹽酸鹽、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸緩沖液(pH9.0)(底物溶液)中，使總量為2ml，然后在30℃反應(yīng)1小時(shí)。結(jié)果，在未添加EDTA的區(qū)域，生成4.9mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在添加EDTA的區(qū)域，生或10.1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
另外說明，在上述反應(yīng)體系中，用1ml100mM的硼酸緩沖液(pH9.0)代替菌體懸浮液加入1ml底物溶液中(未添加菌體區(qū)域)；和用1ml不含L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺的、未添加EDTA或含有20mMEDTA的100mM的硼酸緩沖液(pH9.0)代替底物溶液，加入菌體懸浮液中(未添加底物區(qū)域)，任何一種條件下都未見生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
(實(shí)施例2)用氨基酸酯作為底物在1ml含有20mMEDTA和200mM下述的L丙氨酸酯鹽酸鹽、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸緩沖液(pH 9.0)中，分別加入1ml與實(shí)施例1同樣地制備的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)FERM BP-8101株的菌體懸浮液濕菌體(100g/L)，總量調(diào)整至2ml后，在30℃反應(yīng)1小時(shí)。結(jié)果，用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物時(shí)，生成14.9mM的L-丙氨酰L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸乙酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物時(shí)，生成11.4mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸叔丁酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物時(shí)，生成0.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
(實(shí)施例3)用L-氨基酸作為底物在1ml含有20mM EDTA和200mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、以及400mM L-谷氨酰胺或L-天冬酰胺的100mM硼酸緩沖液(pH9.0)中，分別加入1ml與實(shí)施例1同樣地制備的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)FERM BP-8101株的菌體懸浮液濕菌體(100g/L)，總量調(diào)整至2ml后，在30℃反應(yīng)1小時(shí)。結(jié)果，用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物時(shí)，生成12.7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-天冬酰胺為底物時(shí)，生成4.8mM的L-丙氨酰-L-天冬酰胺。
(實(shí)施例4)生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的微生物用下述的培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)1升中1含有5g葡萄糖、5g硫酸銨、1g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10g酵母提取物和10g胨的培養(yǎng)基(pH7.0)，取50ml加入500ml的坂口氏燒瓶中，在115℃下滅菌15分鐘。在上述培養(yǎng)基中接種1鉑金環(huán)表1所示的已在1升中含有5g葡萄糖、10g酵母提取物和10g胨的斜面瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂2g/L，pH7.0)上、30℃下培養(yǎng)了24小時(shí)的細(xì)菌，在30℃、120次往復(fù)/分下振動(dòng)培養(yǎng)17小時(shí)。培養(yǎng)后，離心分離菌體，然后懸浮于含10mM EDTA的0.1M的硼酸緩沖液(pH9.0)中，制備成100g/L的濕菌體。在0.1ml的這些微生物菌體懸浮液中，分別加入0.1ml含有10mM EDTA、200mM L-丙氨酸甲基酯鹽酸鹽、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸緩沖液(pH9.0)，總量調(diào)整為0.2ml后，在25℃下反應(yīng)2小時(shí)。這時(shí)的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的生成量(mM)如表1所示。
表1

(實(shí)施例5)溫度對L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)生成的影響在1ml含有10mM EDTA、200mML-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸緩沖液(pH9.0)中，分別加入1ml按照實(shí)施例4的微生物培養(yǎng)法制備的惡臭假單胞菌FERM BP-8101株的菌體懸浮液(100g/L)，將總量調(diào)至2ml后，分別在20℃、30℃、40℃下反應(yīng)1小時(shí)，結(jié)果如表2所示。在用惡臭假單胞菌FERM BP-8101株的場合，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的生成量在40℃下為最高值。
表2

(實(shí)施例6)谷氨酸棒桿菌(Corynebavterium glutamicum)ATCC13286菌株的肽生成酶的純化和用純化的酶生產(chǎn)L-丙氨酰L-谷氨酰胺在5L的坂口氏燒瓶中，加入500ml每升含有5g甘油、5g酵母提取物、5g胨、5g氯化鈉、5g L-丙氨酰胺鹽酸鹽的培養(yǎng)基，在120℃下滅菌20分鐘。然后按5％(V/V)接種已在含有同樣組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了20小時(shí)的谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株的培養(yǎng)液，在30℃、120次往復(fù)/分鐘下振動(dòng)培養(yǎng)20小時(shí)。通過離心分離，從8升該培養(yǎng)液收集菌體。然后在冰上或4℃下進(jìn)行以下的操作。用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)將菌體洗凈后，用直徑為0.1mm的玻璃珠破碎處理約10分鐘。將玻璃珠與菌體破碎液分離，在20,000×g下離心30分鐘，除去菌體碎片，得到無細(xì)胞提取液。進(jìn)一步在200,000×g下超離心60分鐘，除去不溶部分，得到可溶性的上清液部分。在所得的可溶性部分中，加入硫酸銨，使其達(dá)到60％飽和的濃度，通過20,000×g下離心30分鐘，回收沉淀。用少量的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)溶解沉淀，并對50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)進(jìn)行透析。將此酶溶液加到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)預(yù)平衡的Q-Sepharose HP柱上，然后用含0-1.0M氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性濃度梯度將酶洗脫。收集活性部分，加到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)預(yù)平衡的Superdex 200pg柱上，然后用同樣的緩沖液將酶洗脫。收集活性部分，對含0.5M磷酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)進(jìn)行透析后，加到用含有0.5M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose HP柱上，用含0.5-0M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性濃度梯度將酶洗脫。收集活性部分，對50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)進(jìn)行透析，并將其加到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)預(yù)平衡的MonoQ柱上，然后用含0-1.0M氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性濃度梯度將酶洗脫。這樣，純化得到電泳純的精制的肽生成酶。
本精制酶的比活性為9.841U/mg，通過這些純化步驟，該精制的肽生成酶的比活性提高至約246倍。此外，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定本精制酶標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果，在計(jì)算分子量為42,000-46,000的位置，檢測到均一的條帶。另外，酶的滴度按以下所述進(jìn)行。加入200μmol Tris-HCl緩沖液(pH9.0)、50μmol L-丙氨酰胺和適量的酶液，使總體積為1ml，并混合，30℃反應(yīng)60分鐘后，加入4ml磷酸水溶液(pH2.1)終止反應(yīng)。生成的丙氨酸通過高效液相色譜進(jìn)行定量，在1分鐘內(nèi)生成1μmol L-丙氨酸的酶量定義為1個(gè)單位(U)。
將上述精制的酶加入含有EDTA、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽以及L-谷氨酰胺(或L-天冬酰胺)的硼酸緩沖液中，使其總體積為1ml，并混合(終濃度酶的添加量按丙氨酰胺分解活性計(jì)為2單位(U)、EDTA10mM、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽100mM、L-谷氨酰胺200mM(或L-天冬酰胺200mM)、硼酸緩沖液100mM)，30℃反應(yīng)4小時(shí)(另外說明，酶的單位數(shù)不表示由L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性，而是簡單地表示分解L-丙氨酰胺的活性)。此時(shí)，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成量為50.2mM，L-丙氨酰-L-天冬酰胺的生成量為49.8mM。
(實(shí)施例7)谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株的肽生成酶基因的分離及其在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)以下，對谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株的肽生成酶基因的分離及其在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行描述?；虻姆蛛x、表達(dá)都用大腸桿菌JM109作為宿主，pUC18用作載體。
1.根據(jù)確定的氨基酸序列制備PCR引物根據(jù)實(shí)施例1所得的谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株的肽生成酶的N末端氨基酸序列(序列表的序列號1)，制備分別示于序列表的序列號2、3的引物的混合引物。
2.菌體的獲得將谷氨酸棒桿菌ATCC 13286株在CM2Gly瓊脂培養(yǎng)基(0.5g/dl甘油、1.0g/dl酵母提取物、1.0g/dl胨、0.5g/dlNaCl、2g/dl瓊脂、pH7.0)上，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，使菌活化。然后將1白金環(huán)的該菌接入含有50mlCM2Gly液體培養(yǎng)基的坂口氏燒瓶中，30℃下好氣振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
3.由菌體獲得染色體DNA將50ml培養(yǎng)液離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集菌體。將該菌體懸浮于10ml含20mM EDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，通過離心回收菌體。再將該菌體懸浮于10ml含20mMEDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中。在該懸浮液中加入0.5ml20mg/ml的溶菌酶溶液、1ml 10％的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液后，在55℃溫育20分鐘。然后在該溫育的溶液中，加入等量用含1mMEDTA的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)飽和的酚，以除去蛋白。在分離的水層中，加入等量的異丙醇，使DNA沉淀并回收。沉淀的DNA溶于0.5ml含20mM EDTA的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)后，加入5μl 10mg/ml的RNase、5μl 10mg/ml的蛋白酶K，55℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后，該溶液中加入等量用含1mM EDTA的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)飽和的酚，以除去蛋白。再在分離的水層中加入等量24∶1的氯仿/異戊醇并攪拌，回收水層。該操作再進(jìn)行2次后，在所得的水層中，加入3M醋酸鈉溶液(pH5.2)，使其終濃度為0.4M，再加入2倍體積的乙醇?；厥丈傻腄NA沉淀，用70％的乙醇洗凈后使其干燥，然后溶于1ml含1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中。
4.用序列盒式PCR法獲得含有肽生成酶基因的一部分的DNA片段采用TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(寶酒造公司生產(chǎn))，用盒式PCR法分離、擴(kuò)增含有編碼肽生成酶的基因(aah)的DNA分子。以下，除非預(yù)先說明，否則實(shí)驗(yàn)按照說明書的方法進(jìn)行。序列盒式PCR法中，以引物1(第1輪PCR，序列表的序列號2)和引物2(第2輪PCR，序列表的序列號3)作為引物的場合，擴(kuò)增與EcoR I序列盒之間的約0.5kb的條帶(片段1)。通過測定該片段的堿基序列，證實(shí)片段1為aah的一部分。
5.由基因庫克隆肽生成酶的基因下面，為了獲得全長的aah，首先以片段1作為探針進(jìn)行Southern雜交。將用作探針的DNA片段調(diào)整至50ng/μl，使用DIG High Prime(Boehring Mannheim)、按照其提供的方案在37℃溫育24小時(shí)，對16μl的該DNA溶液進(jìn)行探針標(biāo)記。
1μg染色體DNA用各種限制酶的組合進(jìn)行消化、并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳后，印跡在帶正電的尼龍膜(Boehring Mannheim，帶正電的尼龍膜)上。按照以下常規(guī)的方法進(jìn)行Southern雜交。雜交用DIG Easy Hyb(Boehring Mannheim)進(jìn)行，50℃、30分鐘進(jìn)行預(yù)雜交后，加入探針，然后在50℃雜交18小時(shí)。用DIG核苷酸檢測試劑盒(Boehring Mannheim)進(jìn)行檢測。
結(jié)果，BglII的酶切產(chǎn)物中，在約7kb的位置檢測出條帶?；厥赵?kb范圍的片段并連接到pUC18上，用大腸桿菌JM109生產(chǎn)成文庫(120株)，按照以下的常規(guī)方法進(jìn)行菌落雜交將菌落轉(zhuǎn)印至尼龍膜(Boehring Mannheim，用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜)上，然后進(jìn)行堿變性、中和、固定化的處理。雜交用DIG Easy Hyb進(jìn)行。將濾膜浸入緩沖液中，42℃下預(yù)雜交30分鐘，然后加入上述標(biāo)記的標(biāo)記探針，42℃雜交18小時(shí)。用SSC緩沖液洗凈后，用DIG NucleotideDetetion Kit選出1株陽性克隆。
6.谷氨酸棒桿菌ATCC 13286來源的肽生成酶基因的堿基序列按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)中所述的方法，制備選出的轉(zhuǎn)化體中含有的質(zhì)粒，測定其與探針雜交部分及其附近部分的堿基序列，其中存在編碼含有肽生成酶氨基酸序列N末端30個(gè)殘基的蛋白質(zhì)的讀碼框(ORF)，證實(shí)為編碼肽生成酶的基因aah。肽生成酶基因全長的堿基序列如序列表的序列號4所示。所得的ORF與已知的丙酸桿菌屬(Propionibacterium)細(xì)菌來源的脯氨酸亞氨肽酶(Proline iminopeptidase)的堿基序列有57.6％的同源性。另外說明，同源性的數(shù)值是用Genetyx所得的值(以下同本實(shí)施例)。
7.肽生成酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了使aah在大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建了將aah連接在pUC18的lac啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒pUCAAH。以谷氨酸棒桿菌ATCC 13286的染色體DNA為模板、表3所示的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增得到片段，用Sac I、Sma I處理該片段并與pUC18的Sac I、Sma I的酶切物連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素抗性株中選出含有目的質(zhì)粒的菌株，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒命名為pUCAAH。
表3 由于構(gòu)建肽生成酶基因的表達(dá)載體的引物

將含有pUCAAH并表達(dá)肽生成酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種于含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)。在裝入50mlLB培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，接種上述預(yù)培養(yǎng)液1ml，在37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)2小時(shí)后，加入異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為1mM，再繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體、洗凈、懸浮于10ml的20mM磷酸緩沖液(pH8.0)中，180W、超聲破碎30分鐘。回收溶液，12,000g離心10分鐘，其上清為無細(xì)胞提取液。
(實(shí)施例8)肽生成酶活性的測定1.谷氨酸棒桿菌ATCC 13286來源的酶活性按以上所述完成培養(yǎng)后，制備無細(xì)胞提取液用作酶源，測定肽生成酶的活性。肽生成酶活性的測定方法如下含100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、150mM L-谷氨酰胺、100mM硼酸緩沖液(pH9.0)、10mMEDTA和酶溶液的反應(yīng)液，在30℃溫育60分鐘后，添加4倍體積的磷酸(pH1.5)使其停止反應(yīng)。用HPLC定量測定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量。對于酶活性的單位(U)，1單位(U)定義為在該條件下，1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性。
分析所用的HPLC的條件如下柱Inertsil ODS-2移動(dòng)相(磷酸水溶液(pH 2.1))，2.5mM 1-辛磺酸鈉/甲醇＝10/1
柱溫度40℃流速1.0ml/分檢測UV 210nm結(jié)果，在導(dǎo)入了pUC18AAH的情況下，檢測出由L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性為0.54U/mg，證實(shí)克隆的aah基因在大腸桿菌中表達(dá)。另外，作為對照，在僅導(dǎo)入pUC18的情況下，未檢測到活性。
2.His-Tag肽生成酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了使aah在大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建了在pUC18的啟動(dòng)子下游以His-Tag蛋白的形式表達(dá)肽生成酶的質(zhì)粒pQEAAH。以谷氨酸棒桿菌ATCC 13286的染色體DNA為模板、表4所示的寡核苷酸為引物，通過PCR擴(kuò)增得到片段，用Sac I、Sma I處理該片段并與pQE-30(Qiagen公司)的Sac I、Sma I的酶切物連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素抗性株中選出含有目的質(zhì)粒的菌株，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒命名為pQEAAH。
表4 用于構(gòu)建His-Tag肽生成酶表達(dá)載體的引物

用實(shí)施例8同樣的方法測定含有pQEAAH并表達(dá)肽生成酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的活性時(shí)，所顯示的肽生成酶活性為5.28U/mg。
3.His-Tag精制酶的生產(chǎn)按上述的方法破碎由150ml含有pQEAAH的大腸桿菌JM109的培養(yǎng)液得到的菌體，用His Trap Kit(Amersham Pharmacia Biotech公司生產(chǎn))，按照其提供的方案純化His-TagL-丙氨酰胺水解酶。得到24mg SDS-PAGE上單一條帶的蛋白質(zhì)。該精制酶由L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的比活為148.3U/mg，相對于L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽為50.7％。
4.用His-Tag精制酶進(jìn)行的底物特異性研究用His-Tag精制酶進(jìn)行由獲得的肽生成酶合成除L-丙氨酰-L-谷氨酰胺之外的肽的研究。
由L-丙氨酸甲酯和其他L-氨基酸合成肽合成反應(yīng)按下述方法進(jìn)行含100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、150mM被測氨基酸、100mM硼酸緩沖液(pH9.0)、10mMEDTA和酶溶液(0.05U/ml)的反應(yīng)液在25℃下溫育3小時(shí)，生成的肽用HPLC定量。結(jié)果，用L-天冬酰胺作為L-氨基酸時(shí)，生成22.34mM的L-丙氨酰-L-天冬酰胺；用甘氨酸時(shí)，生成5.66mM的L-丙氨酰-甘氨酸；用L-丙氨酸時(shí)，生成10.63mM的L-丙氨酰-L-丙氨酸；用L-亮氨酸時(shí)，生成13.73mM的L-丙氨酰-L-亮氨酸；用L-蛋氨酸時(shí)，生成48.80mM的L-丙氨酰-L-蛋氨酸；用L-脯氨酸時(shí)，生成1.02mM的L-丙氨酰-L-脯氨酸；用L-苯丙氨酸時(shí)，生成16.13mM的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸；用L-色氨酸時(shí)，生成15.31mM的L-丙氨酰-L-色氨酸；用L-絲氨酸時(shí)，生成26.14mM的L-丙氨酰-L-絲氨酸；用L-蘇氨酸時(shí)，生成24.23mM的L-丙氨酰-L-蘇氨酸；用L-酪氨酸時(shí)，生成0.96mM的L-丙氨酰-L-酪氨酸；用L-賴氨酸時(shí)，生成7.91mM的L-丙氨酰-L-賴氨酸；用L-精氨酸時(shí)，生成24.87mM的L-丙氨酰-L-精氨酸；用L-組氨酸時(shí)，生成23.16mM的L-丙氨酰-L-組氨酸；以及用L-谷氨酸時(shí)，生成1.11mM的L-丙氨酰-L-谷氨酸。
(2)由其他L-氨基酸甲酯和L-谷氨酰胺合成肽用L-丙氨酸甲酯以外的氨基酸甲酯進(jìn)行反應(yīng)。
合成反應(yīng)按下述方法進(jìn)行含100mM被測氨基酸甲酯、150mM L-谷氨酰胺、100mM硼酸緩沖液(pH9.0)、10mM EDTA和酶溶液(0.05U/ml)的反應(yīng)液在25℃下溫育3小時(shí)，生成的肽用HPLC定量。結(jié)果，用甘氨酸甲酯作為L-氨基酸甲酯時(shí)，生成52.19mM的甘氨酰-L-谷氨酰胺；用L-纈氨酸甲酯時(shí)，生成5.94mM的L-纈氨酰-L-谷氨酰胺；用異亮氨酸甲酯時(shí)，生成0.59mM的L-異亮氨酰-L-谷氨酰胺；用L-蛋氨酸甲酯時(shí)，生成4.31mM的L-蛋氨酰-L-谷氨酰胺；用L-苯丙氨酸甲酯時(shí)，生成3.67mM的L-苯丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-絲氨酸甲酯時(shí)，生成40.44mM的L-絲氨酰-L-谷氨酰胺；用L-蘇氨酸甲酯時(shí)，生成3.85mM的L-蘇氨酰-L-谷氨酰胺；用L-谷氨酰胺甲酯時(shí)，生成0.23mM的L-谷氨酰-L-谷氨酰胺；用L-酪氨酸甲酯時(shí)，生成1.24mM的L-酪氨酰-L-谷氨酰胺；用L-精氨酸甲酯時(shí)，生成6.52mM的L-精氨酰-L-谷氨酰胺；用L-天冬氨酸-α-甲酯時(shí)，生成8.22mM的L-天冬氨酰-α-L-谷氨酰胺。此外，也證實(shí)了L-亮氨酸甲酯、或L-天冬酰胺甲酯、或L-賴氨酸甲酯、或L-天冬氨酸-β-甲酯、或L-天冬氨酸-α，β-二甲酯、或L-谷氨酸-γ-甲酯用作氨基酸甲酯的場合，生成了由對應(yīng)的氨基酸和L-谷氨酰胺形成的肽(因?yàn)槲茨塬@得標(biāo)準(zhǔn)品，所以未進(jìn)行定量)。
(3)脯氨酸亞氨肽酶(pepI)活性的測定方法用反應(yīng)液(組成50mM硼酸緩沖液(pH9.0)，5mM EDTA，1mM脯氨酸2-萘酰胺(proline-pNA))，在30℃下進(jìn)行反應(yīng)。萘酰胺的釋放速度按照405nm的吸光度增加來測定(ε＝9.83)。1分鐘內(nèi)釋放出1μmol萘酰胺的活性定義為1單位(U)。
精制的脯氨酸亞氨肽酶的活性為5.83×103U/mg。
(實(shí)施例9)惡臭假單胞菌ATCC 12633株脯氨酸亞氨肽酶(pepI)基因的分離和在大腸桿菌中的表達(dá)1.脯氨酸亞氨肽酶(pepI)基因部分片段的獲得用實(shí)施例的3同樣的方法，由惡臭假單胞菌ATCC 12633的培養(yǎng)菌體(50ml培養(yǎng))分離DNA。
另一方面，根據(jù)在Genbank中公開的惡臭假單胞菌ATCC12633株脯氨酸亞氨肽酶的部分堿基序列(AF032970)制備合成的DNA寡聚物(序列號10GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A、和序列號11GGC GGA TC AGG TCG CCG CGT TCT TC)，用此寡聚物作為引物，用TaKaRa LA(寶酒造公司生產(chǎn))通過PCR法擴(kuò)增基因的部分片段。
2.由基因庫克隆全長的脯氨酸亞氨肽酶基因?yàn)榱双@得全長的惡臭假單胞菌ATCC 12633的脯氨酸亞氨肽酶基因(pepI)，首先，用上述部分片段作為探針，用實(shí)施例7的第5部分所述的方法同樣進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果，在XhoI的酶切物中檢測出位于約2.8kb的條帶。然后，回收該條帶范圍的片段并與pUC18的SalI位點(diǎn)連接，制備大腸桿菌JM109文庫(100株)。按實(shí)施例同樣的方式進(jìn)行菌落雜交，篩選出1株陽性克隆。
3.惡臭假單胞菌ATCC 12633的脯氨酸亞氨肽酶基因的堿基序列按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)所述的方法，制備篩選出的轉(zhuǎn)化體所含有的質(zhì)粒，測定其與探針雜交部分及其附近部分的堿基序列，其中存在編碼由337個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白的讀碼框(ORF)，證實(shí)已獲得了全長的該基因。脯氨酸亞氨肽酶基因全長的堿基序列示于序列表的序列號14。
另外，所得的ORF顯示出與已知的棒桿菌屬細(xì)菌來源的脯氨酸亞氨肽酶堿基序列有46.3％的同源性；與惡臭假單胞菌PA01的脯氨酸亞氨肽酶有82.4％的同源性。
4.脯氨酸亞氨肽酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了使脯氨酸亞氨肽酶(pepI)在大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建了將pepI連接在pUC18的lac啟動(dòng)子下游的質(zhì)粒pUCPPPEPI。以染色體DNA為模板、序列號9、11所示的寡核苷酸(序列號9GGC GGA TCC GGTGCT CAA AGC GCA A；序列號11CAC GCG CTG CAG CAA ACCCCT CAT)為引物，通過PCR擴(kuò)增得到片段，對該片段進(jìn)行處理并與pUC18的酶切物連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素的抗性株中篩選出含有目的質(zhì)粒的菌株，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒命名為pUCPPPEPI。
將含有pUCPPPEPI的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種于含有0.1mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16小時(shí)。在裝入50ml LB培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，接種入1ml該預(yù)培養(yǎng)液，37℃下進(jìn)行正式培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始2小時(shí)后，加入異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為1mM，再繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體、洗凈、懸浮于10ml的20mM磷酸緩沖液(pH8.0)中，180W、超聲破碎30分鐘?；厥杖芤?，12,000g離心10分鐘，其上清為無細(xì)胞提取液。結(jié)果，只有導(dǎo)入pUCPPPEPI的場合才能檢測出脯氨酸亞氨肽酶的活性(1.21×103U/mg)，證實(shí)克隆的pepI已在大腸桿菌中的表達(dá)。
(實(shí)施例10)用惡臭假單胞菌ATCC 12633菌株的脯氨酸亞氨肽酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1.惡臭假單胞菌ATCC 12633株中的脯氨酸亞氨肽酶的檢測將惡臭假單胞菌ATCC 12633株在L液體培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)過夜，得到菌體。將所得的菌體懸浮于0.1M硼酸緩沖液(pH9.0)、10mMEDTA中，用作酶液。另外，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性按下述的酶活性測定法進(jìn)行測定。用含有0.1M硼酸緩沖液(pH9.0)、10mMEDTA、100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、以及150mM L-谷氨酰胺的反應(yīng)溶液在30℃進(jìn)行酶反應(yīng)，通過HPLC定量測定反應(yīng)過程中生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。1分鐘內(nèi)生成1μmol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性定義為1單位(U)。
檢測得每1ml培養(yǎng)液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性為0.051U。
2.由表達(dá)脯氨酸亞氨肽酶的大腸桿菌合成L-丙氨酰L-谷氨酰胺用上述的無細(xì)胞提取液測定其L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性。結(jié)果，在導(dǎo)pUCPPPEPI的場合，檢測出7.88U/mg的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性，由此證實(shí)克隆的pepI基因是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶的基因。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大積累量為25mM。
(實(shí)施例11)惡臭假單胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亞氨肽酶(pepI)基因的分離和在大腸桿菌中的表達(dá)1.脯氨酸亞氨肽酶(pepI)基因片段的獲得為了獲得惡臭假單胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亞氨肽酶基因(pepI)，按實(shí)施例1同樣的方法，由惡臭假單胞菌FERM BP-8123株的培養(yǎng)菌體(50ml培養(yǎng))分離DNA。
另一方面，用實(shí)施例9中擴(kuò)增的惡臭假單胞菌ATCC 12633株的pepI基因部分片段作為探針，首先，按實(shí)施例9第5部分的同樣的方法進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果，在pstI的酶切物中，檢測到位于約6.5kb的條帶。
隨后，回收該6.5kb范圍的片段并與pUC18的pstI位點(diǎn)連接，用大腸桿菌JM109制成文庫(200株)。用與實(shí)施例同樣的方法進(jìn)行菌落雜交，選出2株陽性克隆。
2.惡臭假單胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亞氨肽酶基因的堿基序列按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)所述的方法，制備選出的轉(zhuǎn)化體所含有的質(zhì)粒，測定其與探針雜交及其附近部分的堿基序列，其中存在編碼由323個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)的讀碼框(ORF)，由此證實(shí)己獲得了全長的該基因。脯氨酸亞氨肽酶基因全長的堿基序列如序列表的序列號16所示。所得的ORF與惡臭假單胞菌ATCC 12633株的脯氨酸亞氨肽酶基因有83％的同源性，氨基酸序列有85％的同源性。
3.脯氨酸亞氨肽酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)為了使pepI在大腸桿菌中表達(dá)，構(gòu)建了將pepI連接在pUC18的lac啟動(dòng)子的下游的質(zhì)粒pUCAAH。以染色體DNA為模板、序列號12、13所示的寡核苷酸(序列號12CCC GAA TTC TTA CGG AGCGCG CAA TG，序列號13CGG GGA TCC CTT CAT GCT TCT TCAGG)為引物，通過PCR擴(kuò)增得到片段，對該片段進(jìn)行處理并與pUC18的酶切物連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從氨芐青霉素抗性株中篩選出含有目的質(zhì)粒的菌株，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒命名為pUCPGPEPI。
按照與實(shí)施例8同樣的方法，用含有pUCPGPEPI的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制成無細(xì)胞提取液、測定其脯氨酸亞氨肽酶活性時(shí)，檢測到活性(3.48×101U/mg)，證實(shí)了克隆的pepI基因已在大腸桿菌中表達(dá)。
(實(shí)施例12)用惡臭假單胞菌FERM BP-8123菌株的脯氨酸亞氨肽酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1.惡臭假單胞菌FERM BP-8123菌株的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性的檢測與實(shí)施例10同樣地培養(yǎng)惡臭假單胞菌FERM BP-8123株，測定其酶活性。測得每1ml培養(yǎng)液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性為0.054U。
2.L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶活性的檢測用含有pUCPGPEPI的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的無細(xì)胞提取液，測定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性。結(jié)果，在導(dǎo)入pUCPGPEPI的場合，測得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性為0.470U/mg，證實(shí)了pepI基因是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶基因。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大積累量為30mM。
(實(shí)施例13)用凝結(jié)芽孢桿菌EK01株的具有脯氨酸亞氨肽酶活性的酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺用東洋紡公司的市售凝結(jié)芽孢桿菌EK01株的精制酶(3.93×105U/mg)，按實(shí)施例10所公開的方法測定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性。結(jié)果，測得活性為52.0U/mg，證實(shí)該脯氨酸亞氨肽酶是具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性的酶。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大積累量為18mM。
(實(shí)施例14)抑制劑對獲得的酶活性的影響研究了抑制劑對獲得的脯氨酸亞氨肽酶的影響。用含有0.1M硼酸緩沖液(pH9.0)、10mM EDTA、100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、150mML-谷氨酰胺、以及1mM抑制劑的反應(yīng)溶液在30℃進(jìn)行30分鐘的酶反應(yīng)，然后測定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成。對凝結(jié)芽孢桿菌EK01株、惡臭假單胞菌ATCC12633株、惡臭假單胞菌FERM BP-8123株，在加入1mM的NEM(N-乙基馬來酰亞胺)時(shí)，酶活性即兒乎完全被抑制。此外，加入1mM IAA(碘乙酰胺)時(shí)，酶活性會(huì)降低至某種程度。另一方面，添加1mM的PMSF(苯基甲基磺酰氟)時(shí)，對活性沒有影響。對于谷氨酸棒桿菌ATCC 13286，其活性不受所研究的任何一種抑制劑的影響。
(序列表說明)序列號1谷氨酸棒桿菌來源的肽生成酶的N末端氨基酸序列序列號2PCR引物序列號3PCR引物序列號4谷氨酸棒桿菌來源的肽生成酶的編碼序列序列號5谷氨酸棒桿菌來源的肽生成酶的氨基酸序列序列號6引物序列號7引物序列號8引物序列號9引物序列號10引物序列號11引物序列號12引物序列號13引物序列號14惡臭假單胞菌ATCC 12633來源的肽生成酶的編碼序列序列號15惡臭假單胞菌ATCC 12633來源的肽生成酶的氨基酸序列序列號16惡臭假單胞菌FERM BP-8123來源的肽生成酶的編碼序列序列號17惡臭假單胞菌FERM BP-8123來源的肽生成酶的氨基酸序列產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用可能性根據(jù)本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法，不必通過復(fù)雜的合成方法，即可用價(jià)格低廉且容易獲得的L-氨基酸酯和L-氨基酸生產(chǎn)二肽，有可能降低用作醫(yī)藥原料、功能性食品等的二肽的生產(chǎn)成本。此外，根據(jù)本發(fā)明的二肽生產(chǎn)方法，用各種不同種類的氨基酸酯和氨基酸為原料，可以生成各種類型的二肽。
序列表<110>味之素株式會(huì)社<120>肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生產(chǎn)方法<130>PAMA-14174<150>JP Patent Application 2001-226568<151>2001-07-26<150>JP Patent Application 2001-310547<151>2001-10-05<160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>1Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu1 5 10 15Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Xaa Arg Xaa Glu Xaa20 25 30<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述盒式PCR引物1<400>2gghwsnytbc arytbgarga ratyac 26<210>3
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述盒式PCR引物2<400>3carytbgarg aratyacbyt bacbytb 27<210>4<211>1307<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(57)..(1295)<400>4ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt ccacccctgc gcgtaacctg ggaagc atg 59Met1act aaa aca ctt ggt tcc ctt caa ctt gaa gaa att acc ttg acg ctc107Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu5 10 15cct ctg act gaa gat gtg gcc gat gaa cgc acc att gat gtg ttc gca155Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe Ala20 25 30cgc att gcc aca cgc gtc ggt ggg gaa gac ctt cca tat tta gta ttc203Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val Phe35 40 45ctg cag ggt ggg cct ggc aat gaa gct cca cgt cca agc ctt aat ccc251Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn Pro50 55 60 65ctc aac ccc aat tgg ttg ggc gtg gcc ttg gag gaa tac cgc gtg gtc299Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val Val70 75 80
atg ttg gat caa cgt ggc acc ggc cgt tcc acc cca gtg ggt aat gat347Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn Asp85 90 95att ttg gaa aaa ccc aca gca gaa gta gtg gag tac tta tcc cac ctg395Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His Leu100 105 110cgc gca gat ggc att gtg cga gat gct gaa gcc ctg cgt aag cat ttg443Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His Leu115 120 125ggt gtg aat cag tgg aac ctt tta ggc cag tcc ttc gga ggt ttc acc491Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe Thr130 135 140 145acc ctg cat tac ttg tcc cgg cac gcc gat tcc ttg gac aac gtg ttt539Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val Phe150 155 160att acc ggc ggt ctc agc gct att gat cgc cca gca gaa gac gtg tat587Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val Tyr165 170 175gcc aac tgt tac aac cgc atg cgc cga aac tct gag gaa ttc tac cgt635Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr Arg180 185 190cgc ttc ccg caa tta cgg gaa act ttc cga ggg ttg gtt aat cgt gct683Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg Ala195 200 205cgc gcc ggg gag att gtg ctt ccc acc ggc gaa gtt gtg tca gaa acc731Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu Thr210 215 220 225agg ctg cga tcc ctt ggt cac ttg ttg ggt agc aat gac ggc tgg ttt779Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Phe230 235 240gat ctg tac aac ctg ctg gaa tta gat ccc acc tcc aac gct ttt gtc827Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe Val245 250 255
cat gac ctg gca gga ctt ttg cct ttc ggc aac cgc aac cca att tat875His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile Tyr260 265 270tac gtg ctc cat gag tcc tct tac gcc gac ggt gtg gtg aca aat tgg923Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn Trp275 280 285gca gca gag cgt gtg ctt cca gag gat ttc cgc gag gat cca aca ctg971Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr Leu290 295 300 305ctc acc ggt gag cac gtg ttc cag gag tgg aca gac acc gtg ccg tcg1019Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro Ser310 315 320ctc aag ccg tgg aag gac gtt gcc ctg gca ttg gct cag cag gaa tgg1067Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu Trp325 330 335ccc aag ctt tat gat gcg aag gca ttg gaa aac tca cag gcc aag ggc1115Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys Gly340 345 350gct gca gca gtg tat ghc aat gac gtt ttc gtc cca gtg gat tac tct1163Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr Ser355 360 365ctg gaa acc gca caa cac ctg ccc ggt gtg cag ctg ttt atc acc agc1211Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr Ser370 375 380 385cag cat gaa cac aat gga ctt cgt gcc agc tca ggc gca gta ctg rag1259Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu Xaa390 395 400cac ctt ttc gat ctg gcc cac ggc cga gag gta cgc tgagggcccc cg 1307His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg405 410<210>5<211>413
<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>5Met Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe20 25 30Ala Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val35 40 45Phe Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn50 55 60Pro Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val65 70 75 80Val Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn85 90 95Asp Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His100 105 110Leu Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His115 120 125Leu Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe130 135 140Thr Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val145 150 155 160Phe Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val165 170 175Tyr Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr180 185 190Arg Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg195 200 205Ala Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu
210 215 220Thr Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp225 230 235 240Phe Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe245 250 255Val His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile260 265 270Tyr Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn275 280 285Trp Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr290 295 300Leu Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro305 310 315 320Ser Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu325 330 335Trp Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys340 345 350Gly Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr355 360 365Ser Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr370 375 380Ser Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu385 390 395 400Xaa His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg405 410<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7cgggggccct cagcgtacct ctcggccgtg 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ggcgagctca tgactaaaac acttggttcc 30<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggcggatccg gtgctcaaag cgcaa25<210>10
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10ggcggatcag gtcgccgcgt tcttc25<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11cacgcgctgc agcaaacccc tcat 24<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12cccgaattct tacggagcgc gcaatg 26<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13
cggggatccc ttcatgcttc ttcagg 26<210>14<211>2078<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220>
<221>CDS<222>(486)..(1496)<400>14agatctggcg cccgtatcac ggcacccttc ggcgcgaact ggaccggttg cgcgagcagt 60ttggctatgc cctgttgtgg gatgcccact cgatccgctc gcacatcccg cacctgttcg 120atggcaagtt gccggacttc aacctgggta ccttcaatgg cgccagctgc gatccggtgc 180tggccgagcg gttgcagggc gtgtgcgccg aagcgacagg ttacagtcat gtgttgaatg 240gtcggttcaa aggcggacac atcacccggc actatggtga ccccgcgaag catatccatg 300cggtgcagct ggagttggcg caaagcacgt acatggagga aaccgagccg tttacctacc 360gggaagacct ggcgcaaccg acgcaggtgg ttctgaagca gcttttgcaa gcgctgctgg 420cttggggggc agaacgatac cagcgttgag tggaagaggc ggtgctcaaa gcgcaattca 480ggttt atg atg ccc aac ggc agt caa tat cct cac acg gag tgc gca atg 530Met Met Pro Asn Gly Ser Gln Tyr Pro His Thr Glu Cys Ala Met1 5 10 15cag acc ctc tac ccg cag atc aaa ccc tac gcc cgg cac gat ctg gcc 578Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Arg His Asp Leu Ala20 25 30gtg gaa gcg ccg cat gtg ctg tat gtc gat gaa agc ggc tcg ccg gaa 626Val Glu Ala Pro His Val Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro Glu35 40 45ggt ctg ccc gtg gta ttc atc cac ggt ggc ccg ggt gct ggc tgc gac 674Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys Asp50 55 60
gcc cag agc cgt tgc tac ttt gac ccc aac ctg tac cgc atc atc acc722Ala Gln Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Ile Thr65 70 75ttc gac cag cgc ggc tgt ggc cgc tcc acg ccc cat gcc agc ctg gag770Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro His Ala Ser Leu Glu80 85 90 95aac aac aca acc tgg cac ctg gtc gag gac ctg gag cgc atc cgc gag818Asn Asn Thr Thr Trp His Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ile Arg Glu100 105 110cac ctg ggc atc gac aaa tgg gtg ctg ttc ggc ggc tcg tgg ggt tcg866His Leu Gly Ile Asp Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly Ser115 120 125acc ctg gcc ctg gcc tac gcc cag acc cac ccc gag cgt gtg cat ggg914Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Glu Arg Val His Gly130 135 140ctg atc ctg cgg ggc atc ttc ctg tgc cgg ccg cag gag atc gag tgg962Leu Ile Leu Arg Gly Ile Phe Leu Cys Arg Pro Gln Glu Ile Glu Trp145 150 155ttc tac cag gag ggc gcc agc cgc ctg ttc ccc gac tac tgg cag gac1010Phe Tyr Gln Glu Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln Asp160 165 170 175tac atc gcg ccg att ccg ccg gaa gaa cgc ggc gac ctg gtc aag gcc1058Tyr Ile Ala Pro Ile Pro Pro Glu Glu Arg Gly Asp Leu Val Lys Ala180 185 190ttc cac aag cgc ctc acc ggt aac gat cag att gcc cag atg cac gcc1106Phe His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His Ala195 200 205gcc aag gcg tgg tct acc tgg gag ggc cgt acc gcc acc ctg cgc ccg1154Ala Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Pro210 215 220aac ccg ctg gtg gtc gac cgc ttc tcc gag ccg cag cgg gcg ctg tcg1202Asn Pro Leu Val Val Asp Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu Ser225 230 235
atc gcc cgg atc gag tgc cac tac ttc atg aac aac gcc ttc ctc gaa1250Ile Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Met Asn Asn Ala Phe Leu Glu240 245 250 255ccg gac cag ttg atc cgc gac ctg ccg aag atc gcc cac ctg cca gcg1298Pro Asp Gln Leu Ile Arg Asp Leu Pro Lys Ile Ala His Leu Pro Ala260 265 270gtg atc gtg cac ggt cgc tat gac gtg atc tgt ccg ctg gac aac gcc1346Val Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Val Ile Cys Pro Leu Asp Asn Ala275 280 285tgg gcc ctg cac cag gcc tgg ccg aac agc gaa ctg aag gtg atc cgc1394Trp Ala Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Lys Val Ile Arg290 295 300gac gcc ggc cac gcc gcg tcc gag ccg ggc atc acc gat gcc ctg gtg1442Asp Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu Val305 310 315cgg gca gcc gac cag atg gcc cgg cgc ctg ctc gac ctg ccc ctg gaa1490Arg Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Leu Glu320 325 330 335gaa gca tgaggggttt gctgcagcgc gtgcgcggtg cgcgggttga agtggcgggg 1546Glu Alacaggtggttg gcgcgatcga ccagggtttg ctggtgctgg tggccgtcga gcctgaagat 1606tcccgcgagc aggccgataa gctgttgcac aagctgctga actaccgtgt attcagcgat 1666gagcacggca agatgaacct gtcgctcaag gatgtcgggg gtggtttgtt gctggtgtcg 1726cagttcacct tggcggcgga cacccgcaac ggcatgcgtc cgagcttctc gacggcagcg 1786ccgccggccc tcggggctga attgttcgac tatcttttgc agcaagcgaa gcgccagcat 1846gccgacgtgg cgagcgggca attcggggca gacatgcagg tgcatctggt caatgatggc 1906cccgtaacat ttatgttaca aatatgaggt caaaaaaccc tttgtttata ggaaaacaag 1966gggttttgta cgataaatag ttgttccagc ctgatgcgtt gtcacgcgac ctgctggata 2026
atcgcgcgct gcatggacct gcgttcgcag gttcgtttca ctctgactcg ag 2078<210>15<211>337<212>PRT<213>惡臭假單胞菌<400>15Met Met Pro Asn Gly Ser Gln Tyr Pro His Thr Glu Cys Ala Met Gln1 5 10 15Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Arg His Asp Leu Ala Val20 25 30Glu Ala Pro His Val Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro Glu Gly35 40 45Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys Asp Ala50 55 60Gln Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Ile Thr Phe65 70 75 80Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro His Ala Ser Leu Glu Asn85 90 95Asn Thr Thr Trp His Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ile Arg Glu His100 105 110Leu Gly Ile Asp Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly Ser Thr115 120 125Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Glu Arg Val His Gly Leu130 135 140Ile Leu Arg Gly Ile Phe Leu Cys Arg Pro Gln Glu Ile Glu Trp Phe145 150 155 160Tyr Gln Glu Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln Asp Tyr165 170 175Ile Ala Pro Ile Pro Pro Glu Glu Arg Gly Asp Leu Val Lys Ala Phe180 185 190
His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His Ala Ala195 200 205Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Pro Asn210 215 220Pro Leu Val Val Asp Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu Ser Ile225 230 235 240Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Met Asn Asn Ala Phe Leu Glu Pro245 250 255Asp Gln Leu Ile Arg Asp Leu Pro Lys Ile Ala His Leu Pro Ala Val260 265 270Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Val Ile Cys Pro Leu Asp Asn Ala Trp275 280 285Ala Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Lys Val Ile Arg Asp290 295 300Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu Val Arg305 310 315 320Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Leu Glu Glu325 330 335Ala<210>16<211>1360<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220>
<221>CDS<222>(311)..(1279)<400>16ctggaagggt tcttggcgtg gggccagaag cactacacct gagtcaacga ggatcaaaat 60
gtgggagcgg gcttgtcagg tcgccgcatc gccgcgatgg cggtctgtca gttcccaata 120tgtcgactga tccgccgcta tcgcgagcaa gcccgctccc acacgtggtg cgcgaacctt 180cctggctgat cactgacaca ggtctaagtc ctcaaggaca tgctcattgc acaattcggg 240tttatgatgc cagacggcaa aataatagac gtccccccag ggatggaccc gaccccttac 300ggagcgcgca atg cag act ttg tac ccg cag atc aaa ccc tac gtc cgg349Met Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Val Arg1 5 10cac gat ctg gcc gtc gat gaa acc cac acg ctg tat gtc gac gaa agt 397His Asp Leu Ala Val Asp Glu Thr His Thr Leu Tyr Val Asp Glu Ser15 20 25ggt tcc ccg caa ggt ttg ccc gtg gtc ttc atc cat ggc ggt ccc ggc 445Gly Ser Pro Gln Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly30 35 40 45gcc ggc tgc gat gcc aat agc cgc tgc tat ttc gat ccg aac ctg tac 493Ala Gly Cys Asp Ala Asn Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr50 55 60cgc atc gtc acc ttt gac cag cgc ggc tgc ggg cgc tcc act ccg cgg 541Arg Ile Val Thr Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro Arg65 70 75gcc agc ctg gaa aac aac acc acc tgg gac ctg gtt gcc gac ctt gag 589Ala Ser Leu Glu Asn Asn Thr Thr Trp Asp Leu Val Ala Asp Leu Glu80 85 90cgc att cgc gag cac ctg ggg att gaa aaa tgg gtg ctg ttc ggt ggt 637Arg Ile Arg Glu His Leu Gly Ile Glu Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly95 100 105tcc tgg ggc tcg acc ctg gcc ctg gcc tat gca caa acc cac cct gat 685Ser Trp Gly Ser Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Asp110 115 120 125cgc gtg ctt ggc ctg att gtg cgc ggc atc ttc ctg gcc cgc ccc cag 733Arg Val Leu Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Phe Leu Ala Arg Pro Gln130 135 140
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ctg ccc cct gaa gaa gca tgaagggcct ttttgccnna cgggtgcgtg 1309Leu Pro Pro Glu Glu Ala320gcgccgggtc agtggcgggc aagtggtggg cgcgatagac cagggttgca g 1360<210>17<211>323<212>PRT<213>惡臭假單胞菌<400>17Met Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Val Arg His Asp Leu1 5 10 15Ala Val Asp Glu Thr His Thr Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro20 25 30Gln Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys35 40 45Asp Ala Asn Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Val50 55 60Thr Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro Arg Ala Ser Leu65 70 75 80Glu Asn Asn Thr Thr Trp Asp Leu Val Ala Asp Leu Glu Arg Ile Arg85 90 95Glu His Leu Gly Ile Glu Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly100 105 110Ser Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Asp Arg Val Leu115 120 125Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Phe Leu Ala Arg Pro Gln Asp Ile Gln130 135 140Trp Phe Tyr Gln Ala Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln145 150 155 160
Asp Tyr Ile Ala Pro Ile Pro Ala Glu Glu Arg His Asp Met Ile Ser165 170 175Ala Tyr His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His180 185 190Ala Ala Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Met Leu Gly Leu Cys195 200 205Pro Ser Pro Gln Leu Ile Glu Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu210 215 220Ser Ile Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Thr Asn Asn Ser Phe Leu225 230 235 240Glu Pro Asn Gln Leu Ile Arg Asp Met His Lys Ile Ala His Leu Pro245 250 255Gly Ile Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Met Ile Cys Pro Leu Asp Asn260 265 270Ala Trp Glu Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Gln Val Ile275 280 285Arg Glu Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu290 295 300Val Arg Ala Ala Gly Asp Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Pro305 310 315 320Glu Glu Ala
權(quán)利要求
1.下述(E)或(F)所示的蛋白質(zhì)(E)具有序列表的序列號17所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(F)具有在序列表的序列號17所述的氨基酸序列中，有1個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)。
2.下述(e)或(f)所述的DNA(e)由序列表的序列號16所述的堿基號311-1279的堿基序列構(gòu)成的DNA；(f)在嚴(yán)格的條件下，與由序列表的序列號16所述的堿基序列中堿基號311-1279的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA雜交，并且編碼具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA，其中嚴(yán)格的條件是在相當(dāng)于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度、60℃下進(jìn)行洗滌的條件。
4.一種重組DNA，其中插入了根據(jù)權(quán)利要求2-3的任何一項(xiàng)所述的DNA。
5.一種導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求2-3的任何一項(xiàng)所述的DNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中的DNA按照能使其編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的方式導(dǎo)入。
6.一種二肽生成酶的生產(chǎn)方法，其特征在于將權(quán)利要求5中所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基和/或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中積累。
7.一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于用權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生成的，具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
11.一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于使具有如權(quán)利要求1所述的由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽活性的蛋白質(zhì)作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸，合成二肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)來源于屬于棒桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬中的任何一種微生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亞氨肽酶活性的蛋白質(zhì)來源于谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌、凝結(jié)芽孢桿菌中的任何一種微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的生產(chǎn)肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生產(chǎn)肽生產(chǎn)方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述1種或2種的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16的任何一項(xiàng)所述的生產(chǎn)肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述的1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
18.一種生產(chǎn)二肽的方法，其特征在于該方法使用屬于棒桿菌屬、假單胞菌屬或芽孢桿菌屬，并具有如權(quán)利要求1所示的有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白質(zhì)的微生物培養(yǎng)物、從該培養(yǎng)物分離的菌體、該微生物的菌體處理物，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生產(chǎn)二肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生產(chǎn)肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯選自下述的1種或2種以上的L-氨基酸酯L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-纈氨酸酯、L-異亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-絲氨酸酯、L-蘇氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-賴氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生產(chǎn)肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸選自下述的1種或2種以上的L-氨基酸L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-谷氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用價(jià)格低廉、容易獲得的起始原料，通過工業(yè)上有利的簡便途徑生產(chǎn)二肽的方法。用具有由L－氨基酸酯和L－氨基酸生成二肽的活性的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的菌體、或該微生物的菌體處理物，由L－氨基酸酯和L－氨基酸生產(chǎn)二肽。
文檔編號C12N9/78GK1872872SQ20061009267
公開日2006年12月6日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者外內(nèi)尚人, 鈴木園子, 橫關(guān)健三, 野崎博之, 杉山雅一 申請人:味之素株式會(huì)社