專利名稱：核苷對(duì)映體的外消旋混合物的拆分方法
本專利申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?2144033.6的分案申請(qǐng)。原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為1992年2月22日；原申請(qǐng)的發(fā)明名稱為“核苷對(duì)映體的外消旋混合物的拆分方法”本發(fā)明涉及生物活性的核苷領(lǐng)域，特別是包括含有2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)的抗病毒組合物，其生理學(xué)上可接受的衍生物，或其生理學(xué)上可接受的鹽，和其拆分方法及(-)-β-L和(+)--β-DFTC對(duì)映體的用途。
1981年，一種疾病被確定為獲得性免疫缺乏綜合癥(AIDS)，這種疾病嚴(yán)重破壞人體免疫系統(tǒng)，而且?guī)缀鯖]有例外地導(dǎo)致病人死亡。1983年，測(cè)定了引起AIDS病因是人類免疫缺乏病毒(HIV)。到1990年12月，世界衛(wèi)生組織估計(jì)全世界感染HIV病人為8百萬到1千萬，在美國(guó)就有1,000,000——1,400,000人。
1985年報(bào)導(dǎo)了合成的核苷3’-疊氮-3’-脫氧胸苷(AZT)可以抑制人類免疫缺乏病毒的復(fù)制。后來證明許多其它合成的核苷，包括2’，3’-二脫氧肌苷(DDI)，2’3’-二脫氧胞苷(DDC)，3’-氟-3’-脫氧胸苷(FLT)，和2’，3’-二脫氧-2’，3’-二脫氫胸苷(D4T)可以有效地抗HIV。證明其它許多的2’，3’-二脫氧核苷在體外可以抑制多種病毒的生長(zhǎng)。很明顯，通過細(xì)胞激酶將細(xì)胞磷酸化為5’-三磷酸鹽后，這些合成的核苷并入病毒DNA的生長(zhǎng)線，由于沒有3’-羥基的存在引起鏈中止。
各種2’，3’-二脫氧核苷在體內(nèi)或體外抑制HIV復(fù)制的成功導(dǎo)致許多研究者設(shè)計(jì)和試驗(yàn)核苷，即在核苷的3’-位用雜原子取代碳原子。Norbeck等人公開了(±)-1-[(2β，4β)-2-(羥甲基)-4-(二氧戊環(huán)基)]胸腺嘧啶(稱為(±)-二氧戊環(huán)-T)顯示了抗HIV的中等活性(EC50在ATH8細(xì)胞中為20μm)，并且在濃度為200μm對(duì)于未感染的對(duì)照細(xì)胞沒有毒性，Tetrahedron Letters30(46)，6246，(1989)。歐洲專利申請(qǐng)公開No0337713和U.S.專利No5,041,449，轉(zhuǎn)讓給IAFBiochem International，Inc.，公開了2-取代的-4-取代的-1，3-二氧戊環(huán)，它顯示了抗病毒活性。
U.S.專利No5,047,407和歐洲專利申請(qǐng)公開No0382526，也轉(zhuǎn)讓給IAF Biochem International，Inc。公開了許多2-取代的-5-取代的-1，3-氧硫雜茂烷核苷具有抗病毒活性，特別是報(bào)導(dǎo)了2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(以下稱為(±)-BCH-189)的C1’-β異構(gòu)體的外消旋混合物(關(guān)于在4’-位)幾乎與AZT有相同的抗HIV活性，而且在試驗(yàn)水平?jīng)]有細(xì)胞毒性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(±)-BCH-189抑制體外從病人身體分離出的AZT-阻抗HIV的復(fù)制，該病人用AZT治療已超過36周。
另一種嚴(yán)重影響人類健康的病毒是肝炎B病毒(以下稱為“HBV”)。HBV引起人類癌癥僅次于煙草。HBV引起癌癥的機(jī)理還不清楚，盡管假定它可以直接觸發(fā)腫瘤的發(fā)展，或通過慢性炎癥，硬化及與感染有關(guān)的細(xì)胞再生間接觸發(fā)腫瘤的發(fā)展。
當(dāng)經(jīng)過2-6個(gè)月培養(yǎng)之后，其中宿主沒有感染，HBV感染可能導(dǎo)致急性肝炎和肝損傷，引起腹部疼痛，黃疸，及提高某些酶的血液水平。HBV可能引起暴發(fā)性肝炎，且迅速發(fā)展，使得肝大部分被破壞，以至常常成為致命的疾病。
一般急性肝炎病人可以痊愈，然而，有些病人其大量的病毒抗原仍留在血液中一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)，或不確定的時(shí)間，引起慢性感染。慢性感染可以導(dǎo)致慢性持續(xù)性肝炎。在發(fā)展中國(guó)家，感染慢性持續(xù)性HBV的病人最普遍。到1991年中期，僅在亞洲，慢性HBV攜帶者就有近2億2千500萬，全世界幾乎有3億攜帶者。慢性持續(xù)性肝炎可以引起疲勞，肝硬變，肝細(xì)胞癌，早期肝癌。
在西方工業(yè)國(guó)家，相當(dāng)多的人有染上HBV的危險(xiǎn)，包括那些與HBV攜帶者或他們的血樣接觸的人。HBV的傳播是與獲得性免疫缺乏綜合癥非常相似，這就說明了為什么患AIDS或AIDS相關(guān)綜合癥的病人普遍感染HBV，然而，HBV比HIV更容易接觸傳染。
用人類血清-衍生疫苗免疫病人對(duì)HBV有免疫力已經(jīng)發(fā)展起來。然而現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)疫苗的有效產(chǎn)生也會(huì)帶來一些麻煩，因?yàn)閺穆詳y帶者得到人類血清供應(yīng)是有限的，并且純化過程是費(fèi)時(shí)和昂貴的。進(jìn)而，由不同血清制備的每批疫苗必須在黑猩猩身上試驗(yàn)以保證安全。通過遺傳工程也已經(jīng)生產(chǎn)出疫苗。已經(jīng)顯示用α-干擾素——一種遺傳工程中的蛋白質(zhì)—進(jìn)行治療是有希望的。然而，迄今為止，還沒有一種藥學(xué)試劑可以有效地抑制病毒的復(fù)制。
為藥學(xué)目的銷售的核苷，它不僅必須是低毒性，而且必須是低成本生產(chǎn)。大量研究和發(fā)展新的、低成本的方法目的在于大規(guī)模生產(chǎn)核苷?，F(xiàn)行制備2’，3’-二脫氧核苷均通過以下二條路線之一原核苷的衍生或衍生糖部分與雜環(huán)堿縮合。盡管通過變化原核苷獲得新核苷類似物的方法有許多缺點(diǎn)，但是這個(gè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是幾乎已經(jīng)自然地建立起了絕對(duì)立體化學(xué)。然而，這種方法不能用于既含有人工產(chǎn)生的堿又含有人類產(chǎn)生的糖類部分(即不能用原核苷制備)的核苷如1，3-氧硫雜茂烷核苷和1，3-二氧戊環(huán)核苷的生產(chǎn)。
當(dāng)一個(gè)糖或一個(gè)糖類似部分與一個(gè)雜環(huán)堿縮合形成一個(gè)合成的核苷時(shí)，生產(chǎn)出的核苷有兩個(gè)手性中心(在C1’和C4’位)，因此為二個(gè)非對(duì)映體對(duì)形成存在。每個(gè)非對(duì)映體以一對(duì)對(duì)映體形式存在。因此，該產(chǎn)品為四個(gè)對(duì)映體的混合物。
人們常常發(fā)現(xiàn)用人工生產(chǎn)的既在C1’位又在C4’位立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的核苷其活性低于天然方法得到的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)相同的核苷。例如，Carter等人報(bào)導(dǎo)的在細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的(-)-Car-bovir對(duì)映體(2’，3’-二脫氫-2’，3’-二脫氧鳥苷)減少逆轉(zhuǎn)錄酶活性50％的濃度(EC50)是0.8μm，而Carbovir(+)對(duì)映體的EC50大于60μm。Antimic robial Agents andChemotherapy，346，1297-1300(1990，6)。
PCT國(guó)際公開No WO91/11186公開了制備1，3-氧硫雜茂烷核苷可以用高含量非對(duì)映體選擇性(從C1’-碳到雜環(huán)堿具有β構(gòu)型鍵的高百分比的核苷)通過小心選擇路易斯酸用縮合方法進(jìn)行。人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氯化錫用作縮合催化劑時(shí)，1，3-氧硫雜茂烷核苷與堿縮合產(chǎn)生幾乎全部是β-立體定向結(jié)構(gòu)。其它路易斯酸提供低的(或不)C1’-β選擇性或簡(jiǎn)直不催化反應(yīng)。
根據(jù)以上事實(shí)，獲得性免疫缺乏綜合癥，AIDS-相關(guān)綜合癥，及肝炎B病毒已經(jīng)達(dá)到流行全世界的程度，而且在感染病人方面已經(jīng)具有嚴(yán)重的結(jié)果，因此，強(qiáng)烈需要提供一種新的有效的藥學(xué)試劑來治療這些病人，而且對(duì)宿主是低毒性的。
還需提供一種低成本、商品化制備藥學(xué)上重要核苷的方法，特別是通過糖類似部分與堿縮合得到在合成核苷的C4’位上的β-立體定向。
因此，本發(fā)明目的是提供一種治療感染HIV病人的方法和組合物。
本發(fā)明另一目的是提供一種治療感染HBV病人或其它宿主動(dòng)物的方法和組合物。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供對(duì)映體富集的1，3-氧硫雜茂烷核苷。
本發(fā)明還有一個(gè)目的就是提供1，3-氧硫雜茂烷核苷C4’-對(duì)映體的拆分方法。
治療感染HBV和HIV的病人或其它宿主動(dòng)物的方法和組合物是施用在藥學(xué)上可接受載體中的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，其藥學(xué)上可接受的衍生物，包括5’或N4烷基化或酰化衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)顯示出抗人類免疫缺乏病毒有意想不到的高活性。而且對(duì)于宿主細(xì)胞具有非常低的毒性。人們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FTC顯示出抗HBV有非常高的活性。因此它可以用于治療患有與HBV感染有關(guān)的各種疾病的病人。
毒性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)FTC的用途，即作為藥物施用的抗病毒劑。FTC和它的對(duì)映體對(duì)于人骨髓外周細(xì)胞濃度高達(dá)50μm和其它細(xì)胞系濃度高達(dá)200μm時(shí)是沒有毒性的。FTC-TP主要是PBMC和HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物。用一個(gè)多(I)低聚(dC)模板—引物FTC-TP較強(qiáng)地抑制具有0.2μMK1的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。用序列分析，當(dāng)用HIV-RT(C-終端)時(shí)可以說明FTC-TP是一個(gè)蛋白質(zhì)DNA鏈未端。
用FTC進(jìn)行慢性治療對(duì)于嚙齒動(dòng)物是沒有毒性的，甚至每天口服劑量為85mg/kg至少兩個(gè)月。對(duì)于獼猴FTC的藥物代謝動(dòng)力學(xué)顯示出高的口服生物藥效率(約73±6％)和血漿末端半衰期約為1.34±0.18(口服和I.V.給藥的平均值)。
本發(fā)明也公開了核苷對(duì)映體的外消旋混合物，包括FTC的外消旋混合物的拆分方法，包括把外消旋混合物暴露在酶中的步驟，該酶優(yōu)選催化對(duì)映體之一的反應(yīng)。該方法可以用于拆分許多核苷，包括在糖部分或堿部分任意被取代的嘧啶和嘌呤核苷。該方法也可以用于拆分在糖部分含有附加雜原子的核苷衍生物，例如，(±)-FTC和(±)-BCH-189。核苷的拆分可以以中等成本大規(guī)模地進(jìn)行。
用這里描述的方法，可以將FTC拆分成它的(+)-β-D和(-)-β-L對(duì)映體。對(duì)于抗HIV，HBV，和SIV，(-)-(β)-L-對(duì)映體似乎比(+)-(β)-D-對(duì)映體更有效。對(duì)于抗HIV，HBV和SIV，F(xiàn)TC的(+)-對(duì)映體也是活性的。


圖1是2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
圖2是制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-硫雜茂烷的方法流程圖。
圖3是FTC的(+)和(-)的對(duì)映體的堿性磷酸酯酶和蛇毒磷酸二酯酶的特性流程圖。
圖4是說明用酶AmanoPS-800(空白方塊)和PLE(空白圖圈加點(diǎn)描繪的)，F(xiàn)TC5’-丁酯的酯酶-催化水解進(jìn)程與時(shí)間的關(guān)系5是外消旋的和對(duì)映體富集FTC(其制備用實(shí)施例4的方法)濃度(μm)效果與感染HIV-1人的PBM細(xì)胞抑制百分率的關(guān)系曲線圖。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(-)-FTC)，(黑方塊，(+)FTC)。
圖6是外消旋和對(duì)映體富集FTC(用實(shí)施例3方法制備)的濃度(μm)效果與感染HIV-1人的PBM細(xì)胞的抑制百分率的關(guān)系圖。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(-)-FTC)，(黑方塊，(+)-FTC)。
圖7是在人PBM細(xì)胞中氚代的(±)-FTC吸收(2個(gè)測(cè)定的平均值)的時(shí)間(小時(shí))與Pmol/(106細(xì)胞)的關(guān)系圖。
圖8是測(cè)定從人PBM細(xì)胞中釋出的有放射性標(biāo)記的(±)-FTC的時(shí)間與Pmol/(106細(xì)胞)的關(guān)系圖。
圖9說明在含有10μM[3H]-(±)-FTC介質(zhì)中培育的人HepG-2細(xì)胞中(兩個(gè)測(cè)定值的平均值)的[3H]-(±)-FTC和它的磷酸衍生物的存在，以時(shí)間對(duì)Pmol/(106細(xì)胞)測(cè)出。
圖10是當(dāng)用10μM[3H]-(±)-FTC(700DPM/Pmol)脈沖細(xì)胞24小時(shí)后，并在將其除去后，將化合物定濃24小時(shí)，在人HepG-2細(xì)胞中[3H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的衰減時(shí)間與Pmol/(106細(xì)胞)關(guān)系圖。
圖11是當(dāng)用10μM[3H]-(±)-FTC(700DPM/Pmole)培育24小時(shí)后，人HepG2細(xì)胞中的[3H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的混合濃度的減少的時(shí)間與Pmol/(106細(xì)胞)的關(guān)系圖。
圖12是FTC對(duì)映體對(duì)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的群體形成的作用圖，測(cè)量百分存活率與濃度(μM)的關(guān)系((-)FTC，空白圈；(+)-FTC，黑圈；AZT，黑方塊)。
在這里，術(shù)語“對(duì)映體富集核苷”是涉及至少含有95％核苷的單個(gè)對(duì)映體的核苷組合物。
在這里，術(shù)語FTC為2-羥甲基-5-(5氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(外消旋形式或?qū)τ丑w)，也稱為2’-脫氧-5-氟-3’-硫雜胞苷。
在這里，術(shù)語(±)FTC為(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3氧硫雜茂烷。
在這里，術(shù)語(-)-FTC為(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術(shù)語(+)-FTC為(+)-β-D-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術(shù)語FTC-MP，F(xiàn)TC-DP，和FTC-TP分別為FTC的單磷酸酯，二磷酸酯，和三磷酸酯。
在這里，術(shù)語BcH-189為2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術(shù)語“優(yōu)選酶催化”是指通過一種酶進(jìn)行催化，該酶有利于一個(gè)被酶作用物而不利于另一個(gè)。
在這里，離去基團(tuán)意思是這樣的一個(gè)官能團(tuán)，即當(dāng)它從連接的分子上離開時(shí)形成起始的碳化作用的官能團(tuán)。
在這里本發(fā)明公開了治療人和其它宿主動(dòng)物HIV和HBV感染及以類似方式復(fù)制的其它病毒的方法和組合物，包括施用有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(±)-β-D，L，(-)-β-L或(+)-β-D對(duì)映體，藥學(xué)上(生理學(xué)上)可接受的衍生物，包括5’或N4烷基化或酰化衍生物，或其藥學(xué)上(生理學(xué)上)可接受的鹽，它們?cè)谒帉W(xué)上可接受的載體中。如下所述，本發(fā)明化合物既具有抗還原病毒活性，如抗-HIV-1，抗-HIV-2，和抗猴的免疫缺乏病毒(抗-SIV)活性，其本身也代謝為顯示抗還原病毒活性的化合物。
FTC和其藥物學(xué)上可接受的衍生物或含有這些化合物的藥學(xué)上可接受的制劑用于預(yù)防和治療HIV感染和其它相關(guān)疾病如AIDS-相關(guān)綜合癥(ARC)，持續(xù)性擴(kuò)散淋巴結(jié)造影術(shù)(PGL)，AIDS-相關(guān)神經(jīng)病學(xué)疾病，抗-HIV抗體陽性，和HIV-陽性疾病，Kaposi’s肉瘤，血小板減少性紫癜和機(jī)會(huì)致病菌感染。另外，這些化合物或制劑可以用于預(yù)防或延遲某些抗-HIV抗體或HIV-抗原陽性或已受到HIV感染的人的臨床疾病的發(fā)展。
FTC和其藥學(xué)上可接受的衍生物或其鹽或含有這些化合物的其藥學(xué)上可接受的制劑也用于預(yù)防和治療HBV感染和其它相關(guān)疾病如抗-HBV抗體陽性和HBV-陽性疾病，由HBV引起的慢性肝炎，肝硬變，急性肝炎，突發(fā)性肝炎，慢性持續(xù)性肝炎及疲勞。這些化合物或制劑也可以用于預(yù)防或延遲某些抗-HBV抗體或HBV-抗原陽性或已受到HIV感染的人的臨床疾病的發(fā)展。
總之，本發(fā)明包括下列方面(a)(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學(xué)上可接受的衍生物及其鹽；(b)(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學(xué)可接受的衍生物及其鹽；(c)(+)-β-D-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學(xué)上可接受的衍生物及其鹽；(d)用于醫(yī)療例如治療和預(yù)防HIV和HBV感染的(±)-β-D ，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對(duì)映體，及其藥學(xué)上可接受的衍生物和鹽；(e)用(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對(duì)映體，及其藥學(xué)上可接受的衍生物和鹽于治療HIV或HBV感染的藥物的生產(chǎn)；(f)含有(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對(duì)映體，或其藥學(xué)上可接受的衍生物或其鹽和一種藥物上可接受的載體的藥學(xué)制劑；(g)制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的方法，該方法包括(i)任意保護(hù)的5-氟胞嘧啶與式A的1，3-氧硫雜茂烷反應(yīng)，和任意除去任何羥基保護(hù)基；
其中R1a是氫或羥基保護(hù)基，包括一個(gè)?；?，及L是一個(gè)離去基團(tuán)；(ii)式B化合物(其中R1a如上定義，和R1b是一個(gè)氨基保護(hù)基)與一個(gè)用來在胞嘧啶環(huán)的5-位引入一個(gè)氟原子的氟化劑反應(yīng)； (iii)式C化合物 (其中R1a如上定義)與一個(gè)用來將在尿嘧啶環(huán)的4-位氧基轉(zhuǎn)化為氨基的試劑反應(yīng)；除去任何保留的保護(hù)基以產(chǎn)生所需產(chǎn)品。
(h)制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的(-)或(+)對(duì)映體的方法包括使(-)和(+)對(duì)映體混合物形式的該化合物或其衍生物(例如5’-酯)經(jīng)過一定條件或與用來分離對(duì)映體的試劑反應(yīng)，如果需要將所得衍生物轉(zhuǎn)化為母體化合物。
關(guān)于方法(e)(i)羥基保護(hù)基包括如下詳細(xì)描述的保護(hù)基，包括?；?例如乙?；?，芳酰基(例如苯甲?；蛉〈郊柞；?，三苯甲基，或單甲氧基三苯甲基，芐基或取代芐基，三取代甲硅烷基，包括三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。5-氟胞嘧啶化合物可以任意被三取代甲硅烷基所保護(hù)?？梢杂贸Ｒ?guī)方法除去保護(hù)基。離去基團(tuán)L是在核苷化學(xué)領(lǐng)域中已知的那些典型的離去基團(tuán)，例如鹵素如氯或溴，烷氧基如甲氧基或乙氧基，或?；缫阴；虮郊柞；?。
方法(e)(i)中的反應(yīng)可以在有機(jī)溶劑(例如1，2-二氯乙烷或乙腈)中，在路易斯酸優(yōu)選氯化錫，或三甲基甲硅烷基triflate的存在下進(jìn)行。
式A化合物(其中L代表一個(gè)酰基，例如乙?；?可以通過如下方法得到，使式D化合物 (其中R1a如上定義)與一個(gè)還原劑如氫化鋁鋰反應(yīng)，接著為了所需中間體用一個(gè)適當(dāng)?shù)脑噭┨幚?，例如為了?；靡粋€(gè)羧酸酐如乙酸酐，為了鹵化用氯化或溴化試劑，或用烷基化試劑。
式D化合物可以通過式E化合物 與HSCH2CO2H在升溫條件下來制備。
式E化合物可以通過具有式CH2＝CH-CH2-OR烯丙醚或烯丙酯或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯的臭氧分解來制備，其中R為一個(gè)保護(hù)基，如烷基，甲硅烷基或?；?。
關(guān)于方法e)(ii)，5-氟取代可以用本領(lǐng)域已知方法引入(M.J Robins，等人，在Nucleic Acid Chemistry中，Part 2，L.B.Townsend和R.S.Tipson，編輯，J.Wiley and Sons，New York，895-900(19/8)在此作為參考；R.Duschinsky在Nucleic AcidChemistry中，Part 1，L.B.Townsend和R.S.Tipson，編輯，J.Wiley and Sons，New York 43-46(1978)在此作為參考)。氟化試劑可以是，例如氟代三氯甲烷中的三甲基次氟酸。
關(guān)于方法e)(iii)式C化合物可以用1，2，4-三唑，及4-氯苯基二氯磷酸酯處理，以形成相應(yīng)的4-(1，2，4-三唑基)化合物，然后通過與如甲醇反應(yīng)將該化合物轉(zhuǎn)化為所需4-氨基(胞嘧啶)化合物。
式B和C的起始原料可以如通過適當(dāng)?shù)?任意保護(hù)的)堿與式A化合物用類似方法e)(i)中描述的方法制備。5-氟尿嘧啶和5-氟胞嘧啶可以從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI53233，USA.買到。
(±)對(duì)映體的拆分可以按照下面第III節(jié)中的詳細(xì)說明進(jìn)行。
FTC可以通過與適當(dāng)?shù)孽セ瘎?，例如?；u或酐反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的酯。FTC或其藥學(xué)上可接受的衍生物可以用常規(guī)方法例如，用適當(dāng)?shù)膲A處理轉(zhuǎn)化為其藥學(xué)上可接受的鹽。FTC的酯或鹽可以轉(zhuǎn)化為FTC，例如用水解。
這里公開的抗病毒活性化合物是2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(見圖1)，它以外消旋或分離的對(duì)映體形式存在。
對(duì)于受者，活性化合物的施用可以任何衍生物形式，它可以直接或間接提供母體FTC化合物，或顯示其本身活性。非限制性的例子是藥學(xué)上可接受的鹽(或稱為“生理學(xué)上可接受的鹽”)，活性化合物的5和N4酰化或烷基化衍生物(或稱為“生理學(xué)活性衍生物”)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，?；囚人狨ィ渲絮セ姆囚驶糠诌x自直鏈的，支鏈的，或環(huán)的烷基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括芐基，芳氧基烷基如苯氧基甲基，芳基包括任意被鹵素，C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的苯基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺?；谆酋；?，單，二或三磷酸酯，三苯甲基或單甲氧基三苯甲基，取代芐基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。在酯中的芳基最優(yōu)為苯基。烷基可以是直鏈的，支鏈的，或環(huán)的，C1-C18的基團(tuán)最佳。
FTC的藥學(xué)上可接受的衍生物具體例子包括，但不僅限于
其中R1和R2分別選自烷基和?；?，特別是包括，但不僅限于甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲丁基，叔丁基，異戊基，正戊基，叔戊基，3-甲基丁酰基，氫琥珀酰基，3-氯苯甲酸酯，環(huán)戊基，環(huán)己基，苯甲?；阴；挛祯?，甲磺?；?，丙?；?，丁?；祯；?，己、辛、癸酸的，月掛酸的肉豆寇酸的，棕櫚酸的，硬脂酸的，油酸的?；被岚?，但不僅限于丙氨?；?，纈氨?；?，亮氨酰基，異亮氨?；滨；奖滨；滨；琢虬滨；?，甘氨酰基，絲氨?；?，蘇氨?；腚装滨?，酪氨酰基，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺酰基，天冬氨?；?，谷氨酰基，賴氨酰基，精氨酰基和組氨?；渲蠷1和R2之一可以是H。
FTC或其衍生物可以以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式提供。正如這里用的，術(shù)語藥學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合物涉及保留所需母體化合物生物活性的及顯示最小的，不期望的毒性效果的FTC的鹽和絡(luò)合物。這些鹽的非限制性例子有(a)由無機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等等，形成的酸加成鹽和由有機(jī)酸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，蘋果酸，抗壞血酸，苯甲酸，單寧酸，棕櫚酸，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，萘二磺酸和聚半乳糖醛酸形成的鹽；(b)由多價(jià)金屬陽離子如鋅，鈣，鉍，鋇，鎂，鋁，銅，鈷，鎳，鎘，鈉，鉀等等形成的堿加成鹽，或與有機(jī)陽離子N，N-二芐基亞乙基-二胺，銨，或1，2-乙二胺形成的堿加成鹽；或(c)，(a)和(b)結(jié)合的鹽，例如單寧酸鋅鹽等等。
改良的活性化合物，特別是在N4和5’-0位的改變，可以影響這些活性物質(zhì)的代謝生物利用率和代謝率，因此控制了這些活性物質(zhì)的傳遞。進(jìn)一步地，這種改良可以影響化合物的抗病毒活性，在某些情況下，增加了母體化合物的活性。這很容易用這里描述的方法或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過制備衍生物和測(cè)試其抗病毒活性來評(píng)價(jià)。
FTC的外消旋混合物可以根據(jù)在PCT國(guó)際公開No WO91/11186，
公開日1991年8月8日，及申請(qǐng)人Emory University公開的詳細(xì)方法或在實(shí)施例1中公開的方法制備?？傊?，該方法包括將具有式CH2＝CH-CH2-OR的烯丙醚或酯，或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯進(jìn)行臭氧化以形成具有OHC-CH2-OR式的乙醇醛，其中R是保護(hù)基，如烷基，甲硅烷基或?；?；將巰基乙酸加到乙醇醛中以形成具有式2-(R-氧基)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷的內(nèi)酯；還原內(nèi)酯得到在氧硫雜茂烷環(huán)5-位含有離去基團(tuán)的各種化合物；將這些化合物在SnCl4存在下與甲硅烷化的5-氟胞嘧啶偶合，形成FTC β-異構(gòu)體；并且任意地除去保護(hù)基。
實(shí)施例1 (±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的制備FTC外消旋混合物的制備方法已在圖2中示出，下面詳細(xì)描述。
2-丁烯-1，4-二醇的保護(hù)在一個(gè)干燥的，2L，三頸燒瓶中，在惰性氣體中，將100g(93.5ml＝1.135mol＝1.00eq)的2-丁烯-1，4-二醇和15g(約0.1eq.)的DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在800ml無水吡啶電攪拌同時(shí)冷卻到0℃。然后將丁酰氯(260ml＝2.2eq)慢慢加入，防止過熱，使其攪拌1小時(shí)。用少量冰水驟冷反應(yīng)液。將液體從鹽中傾析，并真空蒸發(fā)。將余下的鹽溶解在水中，并用乙酸乙酯萃取水溶液兩次。合并其它幾層用飽和CuSO4洗滌一次，用含有Norit的飽和NaHCO3洗滌兩次，然后用硅藻土插塞真空過濾。
將濃的反應(yīng)混合物溶解在乙醚中，接著用同上述洗滌鹽溶液的相同方法洗滌。
合并有機(jī)層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后在真空下放置。這個(gè)反應(yīng)是一般非常接近于定量的反應(yīng)。根據(jù)需要，可以很容易地增加規(guī)模。產(chǎn)品，1，4-二丁?；?2-丁烯-1，4-二醇是一種無色到淡黃色透明液體。
被保護(hù)的二醇的臭氧分解在一個(gè)裝有一個(gè)大干燥管和一個(gè)為引入氣體的開口管的，干燥的，5L三頸瓶中將1，4-二丁?；?2-丁烯-1，4-二醇(1.365mol)溶解在4L無水CH2Cl2中。該管最好不是燒結(jié)玻璃的，否則氣泡管將塞阻暴露出濃溶液。將該溶液攪拌并冷卻至-78℃，同時(shí)將隋性氣體鼓泡通過該溶液。當(dāng)溶液已經(jīng)足夠冷時(shí)立刻關(guān)閉進(jìn)氣口，并將燒瓶和攪拌器移至臭氧發(fā)生器。將氧氣鼓泡通過攪拌著的溶液至少20分鐘，同時(shí)保持冰浴。對(duì)于這個(gè)長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，低溫冷卻利于保持低的溫度。然后在8-8。5psi引入臭氧。完成之后，關(guān)閉臭氧。在加入3當(dāng)量Me2S之前將氧氣鼓泡通過溶液約半小時(shí)。從冷卻浴中移出燒瓶，轉(zhuǎn)移到通風(fēng)櫥中攪拌約2天，以使其完全還原。蒸發(fā)溶液并在真空中放置幾小時(shí)。
這個(gè)反應(yīng)一般產(chǎn)生約95％的被保護(hù)的醛(2-丁酰氧乙醛)，無色到黃色的透明液體。
用巰基乙酸將乙醛環(huán)化在裝有一個(gè)Dean Stark-型汽水閥的燒瓶中，將乙醛(1.0當(dāng)量)溶解在甲苯中，以提供0.80-0.85M的溶液。加入巰基乙酸(1.1當(dāng)量)，并將混合物加熱到回流。將水共沸地經(jīng)過汽水閥除去。反應(yīng)在3小時(shí)后完成，并使其冷卻到室溫。用等體積的飽和NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)溶液兩次，再用水洗一次。用MgSO4和Norit干燥，在真空蒸發(fā)之前用硅藻土真空過濾。反回來再用乙醚萃取第一次NaHCO3洗液；用水洗醚液一次，用MgSO4和Norit干燥，用硅藻土真空過濾與從甲苯溶液中蒸出另一個(gè)有機(jī)物質(zhì)一起蒸發(fā)合并上述物質(zhì)，真空放置過夜。
這個(gè)反應(yīng)一般提供產(chǎn)率90％的2-(丁酰氧)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷。
內(nèi)酯的還原和乙酸酯的轉(zhuǎn)化在一個(gè)裝有機(jī)械攪拌和保持惰性氣體氣氛的干燥的三頸燒瓶中，將2-丁酰氧-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷(1.00當(dāng)量)溶解在無水THF中，以得到0.23M溶液。在經(jīng)過套管加入1.1當(dāng)量的1.0MLi(叔-BuO)3AlH的THF之前，攪拌溶液并冷卻至0℃。用2∶1乙醚/己烷溶劑系統(tǒng)和茴香醛著色劑通過TLC表明還原約3小時(shí)完成。
然后加入約10當(dāng)量新蒸餾的Ac2O，并使其攪拌2天，得到乙?；a(chǎn)品。通過加入飽和NaHCO3使反應(yīng)驟冷，攪拌過夜。然后蒸發(fā)并加另外NaHCO3一起攪拌該溶液過夜。該溶液用乙醚萃取，用飽和NaHCO3洗滌(小心地)兩次，用水洗滌一次，用MgSO4和Norit干燥，用硅藻土真空過濾并蒸發(fā)。產(chǎn)品為暗黃色的透明液體。氣相色譜(Init.T-80℃；Init.時(shí)間＝5分鐘升溫率-10°/分鐘；最終T＝240℃)表明其純度一般約為70％。
5-氟胞嘧啶的甲硅烷基化將5-氟胞嘧啶(1.05當(dāng)量，依據(jù)在前面步驟中用GC顯示的純度，基于所獲得的乙?；徫涣u基內(nèi)醚的量)通過在至少10當(dāng)量含有催化量的純硫酸銨(0.05-0.10當(dāng)量)的六甲基二硅氮烷中回流，在溶液變透明后2小時(shí)進(jìn)行甲硅烷基化。然后密封燒瓶用帶有輔助阱的真空泵除去溶劑。產(chǎn)品為白色固體，在真空下放置過夜直至準(zhǔn)備用于以下偶合反應(yīng)。
用乙?；徫涣u基內(nèi)醚偶合甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶在氮?dú)夥障?，在SnCl4溶液(135.6ml，1molCH2Cl2的溶液)中加入甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶(33.86g，0.124mol)在室溫下將溶液攪拌15分鐘。在氮?dú)夥障?，?0分鐘內(nèi)，將上述溶液經(jīng)插管加到乙酸乳酯(38g，0.113mol)的二氯甲烷(400ml)中。將反應(yīng)溶液攪拌2小時(shí)，通過TLC確定反應(yīng)完成的時(shí)刻用二氯甲烷(500ml)稀釋反應(yīng)溶液并用氫氧化銨溶液使其驟冷。慢慢加入氫氧化銨溶液(100ml)使反應(yīng)溫度保持在30℃以下，結(jié)果生成一種白色沉淀。
將混合物再攪拌30分鐘，然后通過硅膠填充柱(直徑7英寸高5英寸)，依次用二氯甲烷(2L)，乙酸乙酯(2L)和乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)(4L)洗脫。在乙酸乙酯和乙酸乙酯∶乙醇洗脫液中含有所需產(chǎn)品。合并這些溶液后減壓蒸發(fā)。然后用無水乙醚(200ml)洗滌剩余粘稠固體，得到一種白色固體(25.35g；71％)，F(xiàn)TC-5’-丁酸酯。
將FTC-5’-丁酸酯(8.74g，0.026mol)溶解在250ml甲醇中。在室溫加入甲醇鈉(2.85g，0.052mol)。將反應(yīng)液攪拌1小時(shí)，通過TLC確定反應(yīng)完成時(shí)刻。加入NH4Cl溶液(10ml)以使反應(yīng)驟冷，然后減壓除去溶劑。在硅膠(5g)上吸收殘余物，并通過一個(gè)小柱子，用乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)作為洗脫劑。合并含有產(chǎn)品的分離液，并蒸發(fā)得到粘稠固體，用無水乙醚洗滌得到白色固體FTC(6.00g，88％)。
(1HNMR(DMSO-d6)8.18(1H，d，H6，J＝8.4Hz)，7.81&7.57(2H，寬，NH2)，6.12(1H，dd，H1′，J＝5.7&4.2Hz)，5.40(1H，t，OH，J＝5.7Hz)，5.17(1H，t，1H4，J＝3-6Hz)，3.74(2H，m，2H5，)，3.41(1H，dd，1H2，J＝5.7&11.7H2，3.11(1H，dd，1H2′，J＝4.2&11.7Hz)；13CNMR(DMSO-d6)157.85(d，J＝13.4Hz)，153.28，136.12(d，J＝241Hz)，126.01(d，J＝32.6Hz)，86.90，86.84，62.48，37.07；mp195-196℃。
這里提供了一種拆分核苷對(duì)映體外消旋混合物的方法，該混合物包括但并不限于FTC的(+)和(-)對(duì)映體。該方法也能夠用于拆分糖類或類糖部分的外消旋混合物，如1，3-氧硫雜茂烷和1，3-二氧代茂烷的衍生物。該方法涉及使用一種能較好地催化外消旋混合物中一種對(duì)映體進(jìn)行反應(yīng)的酶。根據(jù)其物理結(jié)構(gòu)方面新的差異，該反應(yīng)對(duì)映體可以從未反應(yīng)對(duì)映體中分離。如這里所公開的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠選擇一種對(duì)所選擇的核苷對(duì)映體具有選擇性的酶(或?qū)Σ恍枰膶?duì)映體具有選擇性，作為去除它的方法)，該酶可以選自下面討論的一種酶或系統(tǒng)評(píng)價(jià)的其它已知酶。如這里所公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將知道如何改進(jìn)被酶作用物，以達(dá)到希望的拆分目的。通過使用手性NMR位移試劑，旋光測(cè)定或手性HPLC，能夠測(cè)定回收到的酯的旋光富集。
下面實(shí)施例進(jìn)一步說明了在拆分對(duì)映體外消旋混合物中酶的用途。其它已知的外消旋混合物的拆分方法可以和這里公開的拆分方法聯(lián)合使用。所有這些改進(jìn)均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在具體實(shí)施方案中，該方法包括將核苷外消旋體混合物的C5′-羥基與?；衔锓磻?yīng)得到其中核苷在酯的甲醇端的C5′-酯。然后，在給定的時(shí)間內(nèi)，用一種能優(yōu)先分裂或水解一種異構(gòu)體而對(duì)另一異構(gòu)體不發(fā)生作用的酶處理核苷C5′-酯的外消旋混合物。
該方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它能夠用于拆分許多核苷，包括在糖部分或堿基部分被任意取代的嘧啶和嘌呤核苷。該方法也能用于拆分在糖部分含有附加的雜原子的核苷衍生物，例如FTC和BCH-189。該方法廣泛的應(yīng)用性取決于這一事實(shí)，即雖然酯的甲醇部分在酶區(qū)別異構(gòu)體的作用中起著一定作用，但這些酶主要的識(shí)別位置是在酯的羧酸部分。進(jìn)一步說，人們能夠很好地從一種酶/被酶作用物研究的結(jié)果推斷另一種看起來相異的系統(tǒng)，只要兩種被酶作用物的羧酸部分相同或基本相似。
該方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于它具有區(qū)域選擇性。典型用于水解酯的酶并不催化分子其它部分的其它反應(yīng)。例如，脂肪酶催化2-羥基甲基-5-氧-1，3-氧硫雜茂烷酯的水解，但并不水解內(nèi)酯。這與一般的酯水解化學(xué)方法形成鮮明的對(duì)比。
該方法進(jìn)一步的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于將未水解對(duì)映體和已水解對(duì)映體從反應(yīng)混合物中分離出來非常簡(jiǎn)單。未水解對(duì)映體比已水解對(duì)映體具有較好的親脂性，因此可以通過用眾多非極性有機(jī)溶劑中的一種或其混合物進(jìn)行簡(jiǎn)單的萃取將其有效地回收，非極性有機(jī)溶劑包括已烷和己烷/乙醚。親脂性較差，極性較強(qiáng)的水解了的對(duì)映體可以通過用一種極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯進(jìn)行萃取或冷凍干燥，然后用乙醇或甲醇萃取而得到。在水解過程中應(yīng)避免使用醇，因?yàn)樗茉谀撤N條件下使酶變性。
在酶和被酶作用物的適當(dāng)配合下，可以建立分離核苷對(duì)映體的條件?？梢酝ㄟ^用一種能夠水解所需對(duì)映體的酶處理外消旋混合物(然后用一種極性溶劑萃取極性水解物)或用一種能夠水解不需要的對(duì)映體的酶處理外消旋混合物(然后用一種非極性溶劑將不需要的對(duì)映體除去)的方法分離得到所需要的對(duì)映體。
催化酯水解的酶包括酯酶如豬肝酯酶，脂肪酶包括豬胰脂肪酶和Amano PS-800脂肪酶，枯草桿菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶。
圖3是堿性磷酸酯酶和蛇毒液磷酸二酯酶對(duì)FTC的(+)和(-)對(duì)映體特性流程圖。如表所示，堿性磷酸酯酶將兩個(gè)對(duì)映體的三磷酸酯水解成FTC，因此它不是一種有效的分離方法。磷酸二酯酶I優(yōu)先將FTC的(+)-異構(gòu)體水解為其單酯，然后該單酯與5′-核苷酸酶接觸得到(+)-FTC。
用于酯化核苷C5′-位的最有效的?；恍柰ㄟ^用所選擇的酶體系對(duì)一系列同系物進(jìn)行評(píng)價(jià)這些不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)就能確定。例如，當(dāng)用丁酸酯化1，3-氧硫雜茂烷核苷時(shí)，用豬肝酯酶和Amano PS-800進(jìn)行的拆分可利用其高對(duì)映選擇性(S4-100％對(duì)映體過量)和相對(duì)選擇性進(jìn)行。豬肝酯酶優(yōu)先水解FTC的(+)-對(duì)映體，Amano PS-800優(yōu)先水解FTC的(-)-對(duì)映體。表1中報(bào)導(dǎo)的對(duì)映體過量百分比是留在處理混合物的酶中的純化丁酸酯的量(即在PLE中的(-)-FTC丁酸酯和在Amano PS-800中的(+)-FTC丁酸酯)。
用特殊的核苷對(duì)映體混合物和特殊的酶能夠評(píng)價(jià)的?；姆窍薅ㄐ缘睦影ㄍ榛人岷腿〈榛然?，它們可以是乙酸，丙酸，丁酸和戊酸。對(duì)于某些酶，優(yōu)選使用一種具有強(qiáng)吸電子性的酰基化合物以通過減弱酯鍵使水解方便地進(jìn)行。吸電性酰基的例子包括α-鹵代酯，如2-氯丙酸，2-氯丁酸和2-氯戊酸。α-鹵代酯是極好的脂肪酶被酶作用物。
通?？捎么呋康拿冈趐H值接近于該酶最適宜的pH的緩沖水溶液中完成該酶催化水解。隨著該反應(yīng)的進(jìn)行，由于釋放出羧酸，pH值有所降低，應(yīng)該加堿水溶液以保持pH接近酶所需的最適值。該反應(yīng)的進(jìn)程可以很容易地通過檢查pH的變化和保持pH所需的堿量來確定。疏水酯(未水解對(duì)映體)和較高極性的醇(水解對(duì)映體)能夠連續(xù)并有選擇性地被審慎選擇的有機(jī)溶劑從溶液中萃取出來?；蛘?，可將要拆分的物質(zhì)通過一根酶被固定在固體支持物上的柱子。
在多相條件下進(jìn)行的酶催水解具有很差的可重復(fù)性。因此，優(yōu)選在均相條件下進(jìn)行水解。醇溶劑不是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡苁姑甘Щ?。通過使用非離子表面活性劑如Triton x-100能夠得到均相。然而，這些表面活性劑的加入不僅有助于溶解起始物質(zhì)，還可以提高產(chǎn)品的水溶解性。因此，雖然酶反應(yīng)在加入非離子表面活性劑時(shí)比在多相條件下能更有效地進(jìn)行，但卻使回收的起始物質(zhì)和產(chǎn)品的分離更加困難。產(chǎn)品可以用合適的層析和化學(xué)(如有選擇的鹽的形式)技術(shù)分離。二?；塑湛梢允褂茫鼈兂３＞哂泻芎玫挠H脂性而很難溶于所用介質(zhì)中。
實(shí)施例2FTC酯的對(duì)映選擇性脂肪酶催化水解許多FTC 5′-O-?；苌锸峭ㄟ^±)-FTC N-鹽酸鹽的選擇性O(shè)-?；频玫?見表1和圖4)。在此已經(jīng)檢查了脂肪酶對(duì)這些衍生物水解的效應(yīng)。如表1所示，豬肝酯酶(PLE)對(duì)FTC(+)-對(duì)映體酯的水解顯示了高水平的選擇性，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(-)-FTC丁酸酯。相反，PS-800優(yōu)先水解FTC(-)-對(duì)映體的酯，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(+)-FTC丁酸酯。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)水解的速度取決于?；男再|(zhì)；乙?；苌锩黠@慢于丁?；苌铩，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FTC丙酸酯的水解速度甚至快于丁酸酯衍生物。回收百分?jǐn)?shù)和對(duì)映體過量百分?jǐn)?shù)都可用HPLC確定。盡管當(dāng)使用PLE時(shí)對(duì)映選擇性非常好(一般為97％e.e.或更高)，但進(jìn)一步的富集仍能通過連續(xù)酶催水解反應(yīng)完成，在酶催水解反應(yīng)中從PLE-催化水解中得到的對(duì)映體富集丁酸酯用PS-800進(jìn)行酶催水解。
表1酯進(jìn)行酶水解的效果對(duì)比
實(shí)施例3通過FTC丁酸酯的對(duì)映選擇性脂肪酶催化水解制備(+)和(-)FTC的方法將(±)-FTC的5′-O-丁酸酯(0.47mmol，149mg)溶解在16ml pH為8的緩沖液CH3CN為4∶1的溶液中。將澄清溶液攪拌并用26mg豬肝酯酶(PLE-A)處理。反應(yīng)進(jìn)程由HPLC監(jiān)測(cè)(圖4)。20小時(shí)后(52％轉(zhuǎn)化)，用2×80mlCHCl3和80ml乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物。將有機(jī)層萃取液合并，用無水MgSO4干燥，過濾并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將所得的殘余物在2×1000m PTLC盤上用乙酸乙酯洗脫(二次洗脫)，分離后得到53mg(以原料為基，36％)FTC丁酸酯，經(jīng)HPLC分析確定該丁酸酯具有98％對(duì)映體過量(e.e.)。然后將對(duì)映體富集丁酸酯依次用1.6ml甲醇和0.38mmol(20mg)甲醇鈉處理。將所得混合物在室溫下攪拌，并用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。在30分鐘內(nèi)反應(yīng)完全。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑除去得到白色固體的粗品(76mg)，將其在1000m PTLC上用5∶1的乙酸乙酯∶乙醇洗脫。分離得到(-)-FTC白色固體(33mg，產(chǎn)率82％)。FTC5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析顯示97％e.e.；[α](20，D)-120.5°(C＝0.88，無水乙醇)。
通過向完成的反應(yīng)混合物中加HCCl3(它也可使酶變性)，在真空下汽提溶劑然后用HCCl3萃取來避免在操作過程中出現(xiàn)乳濁液。
類似地，將1.2mmol(375mg)的(±)-FTC5′-O-丁酸酯溶解在40ml 4∶1pH8緩沖溶液-CH3CN中。將澄清溶液攪拌并用58mg豬肝酯酶(PLE-A)處理。反應(yīng)過程由HPLC監(jiān)測(cè)。90分鐘后(38％轉(zhuǎn)化)，將反應(yīng)混合物加入150mlCHCl3中。將層分開并將水溶液層冷凍干燥以除去溶劑。將冷凍干燥后得到的白色殘余物用3×10ml無水乙醇萃取。將萃取液過濾，合并并真空濃縮得到的179mg油狀物粗品。將粗品在45×30mm的硅膠柱上先后用3×75ml乙酸乙酯和5∶1的乙酸乙酯-乙醇洗脫。分離得到(+)-FTC白色固體(109mg，根據(jù)起始丁酸酯計(jì)算產(chǎn)率為37％)。(+)-FTC的5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析顯示97.4％e.e.；[α](20，D)+113.4°(C＝2.53；無水乙醇)。
用0.12mmol(37mg)FTC5′-O-丁酸酯和7mg在4.0ml4∶1pH為8的緩沖液CH3CN中的PS-800可以進(jìn)行類似的反應(yīng)。該反應(yīng)顯著地比用PLE-A要慢，需要74小時(shí)，59％轉(zhuǎn)化?；厥盏亩∷狨?11.4mg，起始量的31％)通過HPLC顯示94％e.e.。
在另一種實(shí)施方案中，胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶可用于拆分2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其衍生物包括2-羥甲基-5-(5-氟-胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的外消旋混合物。該酶催化胞嘧啶部分去氨基到尿嘧啶?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，1，3-氧硫雜核苷的一個(gè)對(duì)映體是胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶的較好底物。那個(gè)未轉(zhuǎn)化成尿嘧啶衍生物的對(duì)映體(并因此仍然是堿性)被一種酸性溶液從溶液中萃取出來。必須很小心以避免強(qiáng)酸溶液(pH低于3.0)因它可使氧硫雜茂烷環(huán)裂開。
胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶可以從鼠肝或人肝中分離出來，或從原核生物系統(tǒng)如E.CoLi.的重組體序列表達(dá)出來。
用胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶拆分胞苷核苷對(duì)映體的方法能作為單獨(dú)的拆分方法或與其它方法聯(lián)合使用，其它的方法包括如上面所述的用酶催水解拆分5′-O-核苷酯。
上面所述用于拆分核苷對(duì)映體外消旋混合物的方法可以與其它常規(guī)的對(duì)映體拆分方法聯(lián)合使用。以提高最終產(chǎn)品的旋光純度。
常規(guī)的拆分方法包括許多物理和化學(xué)技術(shù)。通常最簡(jiǎn)單及最有效的技術(shù)是重結(jié)晶，它基于這樣一條原則即外消旋體比相應(yīng)的單個(gè)對(duì)映體更好溶解。重結(jié)晶可以在任何步驟包括在酰化化合物或最終對(duì)映體階段進(jìn)行。如果成功，這種簡(jiǎn)單的方法可以代表選擇方法。
當(dāng)重結(jié)晶不能得到可接受的旋光純物質(zhì)時(shí)，可以用其它方法。如果核苷是堿性的(例如胞苷)，可以用能形成非對(duì)映體混合物的手性酸，此非對(duì)映混合物具有明顯不同的溶解性。手性酸的非限定性例子包括蘋果酸，扁桃酸，二苯甲酰基酒石酸，3-溴樟腦-8-磺酸，10-樟腦磺酸及二-對(duì)甲苯?；剖?。類似地，用手性酸衍生物進(jìn)行的游離羥基的?；部蓪?dǎo)致形成物理性質(zhì)差別很大因而可以分離開的非對(duì)映體混合物。
小量的對(duì)映體富集核苷可通過將外消旋混合物通過一根為手性分離設(shè)計(jì)的HPLC柱而得到或純化，該柱包括由Rainin公司銷售的環(huán)糊精鍵合柱。
實(shí)施例4由HPLC分離核苷外消旋混合物(±)-FTC C4′-對(duì)映體的拆分可以用一根從Rainin公司(Woburn，Ma)得到的手性環(huán)糊精鍵合(環(huán)鍵合AC-I)柱來進(jìn)行。條件如下Isocratic 0.5％甲醇水溶液流速1ml/min.，在262nm UV檢測(cè)。從J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)得到HPLC級(jí)甲醇。將外消旋混合物注射進(jìn)去并收集餾分。集中含單一對(duì)映體的餾分，冷凍然后冷凍干燥?；衔锿ㄟ^UV光譜及其HPLC保留時(shí)間來鑒定。通常，(-)-對(duì)映體比(+)-對(duì)映體具有較短的保留時(shí)間(參見J.Liquid Chromatography7353-376，1984)。化合物的濃度由UV光譜測(cè)定，用已知濃度(15μM)的標(biāo)準(zhǔn)水溶液進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。每種對(duì)映體的保留時(shí)間列于表2。
表2
實(shí)施例5 用手性柱分離FTC對(duì)映體的另一種方法用一根環(huán)鍵合I-AC柱(5μm，25cm×4.6mm，Rainin公司，Woburn，MA，類號(hào)AST-41049)，流速為0.6ml/min的0.5％恒溶劑成分的甲醇(Fisher Scientific，Inc.HPLC級(jí)，類號(hào)A-452-4，在水中)，在262nm處進(jìn)行UV檢測(cè)，F(xiàn)TC對(duì)映體的保留時(shí)間分別是12.68分鐘((-)-FTC)和13.20分鐘((+)-FTC)。
用一根Chiralpak AS柱(10μm，25cm×4.6cm，J.T.Baker，Inc.Philli sburg，NJ，類號(hào)7406-00，序號(hào)09-29-10320)，流速為0.8ml/min的異丙醇(HPLC級(jí)，fisher Scientific，Inc.，類號(hào)A-451-4)，在262nm處進(jìn)行UV檢測(cè)，F(xiàn)TC對(duì)映體的保留時(shí)間分別是5.9分鐘((-)-FTC)和9.8分鐘((+)-FTC)。
通常，理想的情況是第一步先篩選大量核苷外消旋混合物以確定哪一個(gè)可進(jìn)一步拆分成對(duì)映體富集組分并進(jìn)行進(jìn)一步的抗病毒活性評(píng)價(jià)。核苷抑制HIV的能力可通過許多試驗(yàn)技術(shù)來測(cè)定。這里所用的技術(shù)(下面詳細(xì)加以描述)能測(cè)定對(duì)植物血球凝集素(PHA)中病毒復(fù)制的抑制作用，其中植物血球凝集素能刺激感染HIV-1(LAV鏈)的人體外周血液?jiǎn)魏?PBM)細(xì)胞。產(chǎn)生的病毒量能通過測(cè)量病毒編碼逆轉(zhuǎn)錄酶素確定。所產(chǎn)生的酶的量與產(chǎn)生的病毒量成比例。表3提供了許多(±)-1，3-氧硫雜茂烷和核苷的EC50值(抑制PBM細(xì)胞中50％病毒復(fù)制的核苷的濃度，估計(jì)10％誤差率)和IC50值(抑制促細(xì)胞分裂劑刺激的未感染人體PBM細(xì)胞中的50％生長(zhǎng)的核苷濃度)。
實(shí)施例6 (±)-1，3-氧硫雜茂烷核苷的抗HIV活性A、將從肝炎B和HVI-1血清陰性健康供體得到的三天齡植物血球凝集素刺激的PBM細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)感染濃度約為每ml 50％組織培養(yǎng)感染劑量(TICD50)100倍的HIV-1(LAV鏈)，并將其在有或沒有各種濃度的抗病毒化合物存在的情況下培養(yǎng)。
B、大約感染1小時(shí)后，將介質(zhì)在有受試化合物(在介質(zhì)中二倍于最終濃度)或沒有的情況下加入燒瓶中(5ml，最終體積10ml)AZT用作陽性對(duì)照。
C、將細(xì)胞與病毒(約2×105dpm/ml，用逆轉(zhuǎn)錄酶分析加以確定)接觸并置于CO2恒溫箱中。從Atlanta，Georgia的疾病控制中心得到HIV-1(LAV鏈)。用于培養(yǎng)PBM細(xì)胞，獲得病毒和測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法如McDougal等人(J.Immun.Meth.76，171-183，1985)和Spira等人(J.Clin.Meth.25，97-99，1987)所描述，只是兩性霉素B不包括在介質(zhì)中(參見Schinazi等人著Antimicrob.Agents Chemother.32，1784-1787(1988)；Id.，341061-1067(1990))。
D、第6天，將細(xì)胞和上清液轉(zhuǎn)移到15ml試管中并在約900g下離心10分鐘。除去5ml上清液并將病毒在40000rpm下離心30分鐘(Beckman70.1 Ti旋度)而濃縮。將增溶了的病毒丸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶水平的測(cè)定。結(jié)果用dpm/ml樣品上清液表示。來自較小體積上清液(1ml)的病毒在增溶和確定逆轉(zhuǎn)錄酶水平前可以離心濃縮。
半數(shù)有效(EC50)濃度可用半數(shù)有效方法(Antimicrob.AgentsChemother.30，491-498(1986))來確定。簡(jiǎn)單地說，病毒抑制的百分?jǐn)?shù)(由逆轉(zhuǎn)錄酶的測(cè)定方法來確定)是相對(duì)于化合物，微摩爾濃度測(cè)定的。EC50是化合物抑制50％的病毒生長(zhǎng)的濃度。
E、將促細(xì)胞分裂劑刺激的未感染人體PBM細(xì)胞(3.8×105個(gè)細(xì)胞/ml)在有和無藥物存在下，在類似于上面描述的用于抗病毒分析的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。6天后，用血球計(jì)數(shù)器和錐蟲藍(lán)排除法計(jì)算細(xì)胞，如Schinazi等人著Antimicrobial Agents andChemotherapy，22(3)，499(1982)所描述。IC50是抑制50％的正常細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物濃度。
表3人體PBM細(xì)胞中1，3-氧硫雜茂烷核苷的各種類似物的EC50和IC50
如表3所示，通常，取代的胞嘧啶1，3-氧硫雜茂烷核苷比相應(yīng)的尿嘧啶核苷具有更高的活性。在EC50和IC50的測(cè)定中誤差約為±10％。
(±)-FTC中的一個(gè)化合物(指“DLS-022”，化合物8)不僅具有優(yōu)越的活性(PBM細(xì)胞中約10nm)而且具有相當(dāng)?shù)偷亩拘?＞100μM，在PBM，Vero和CEM細(xì)胞中)。進(jìn)一步說，F(xiàn)TC的(-)-對(duì)映體(DLS-058)比外消旋混合物具有明顯強(qiáng)的活性。
(±)-FTC的IC50大于100μM，它表明該化合物在未感染PBM細(xì)胞中濃度達(dá)到100μM仍不具有毒性。
實(shí)施例7 由HPLC拆分的FTC對(duì)映體的抗病毒活性用實(shí)施例4的方法將FTC對(duì)映體分離，并用實(shí)施例6的方法評(píng)價(jià)抗病毒活性。結(jié)果列于表4中，并在圖5中加以說明。
表4FTC(+)和(-)對(duì)映體的抗病毒活性
如表4所示，在該試驗(yàn)中FTC(-)-對(duì)映體比(+)-FTC對(duì)映體強(qiáng)約一個(gè)數(shù)量級(jí)，與外消旋混合物具有幾乎相同的抗-HIV活性。無論是對(duì)映體還是外消旋混合物，在人體PBM細(xì)胞中如錐蟲藍(lán)排除法所測(cè)定的那樣直到100μM才具有毒性。
實(shí)施例8 由實(shí)施例3的方法拆分的FTC對(duì)映體的抗病毒活性(±)-FTC的對(duì)映體可由實(shí)施例3的方法進(jìn)行拆分，其抗病毒活性由實(shí)施例6的方法評(píng)價(jià)。結(jié)果在圖6中說明。如圖6所示，F(xiàn)TC外消旋混合物的EC50為0.017μM，(-)-FTC的EC50為0.0077μM，(+)-FTC的EC50為0.84μM。
實(shí)施例9 人體PBM細(xì)胞對(duì)(±)-FTC的吸收用放射標(biāo)記的FTC進(jìn)行該研究以追蹤細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的母體藥和代謝物的細(xì)胞內(nèi)模型。所有的研究均以兩份進(jìn)行。將人體外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBM細(xì)胞)懸浮在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI1640介質(zhì)中(2×106細(xì)胞/ml)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10ml，并加入10μMFTC進(jìn)行培養(yǎng)(特殊活性約700dpm/pmol)。細(xì)胞與藥物接觸2，6，12及24小時(shí)。在這些時(shí)間點(diǎn)，除去介質(zhì)并用冷的Hank平衡鹽溶液洗滌兩次。加入0.2ml 60％冷甲醇/水進(jìn)行萃取并在-70℃儲(chǔ)存過夜。第二天早晨，將懸浮液在-70℃，0.5小時(shí)內(nèi)離心并萃取二次。將所有上清液(0.6ml)冷凍干燥至干。將殘余物再次懸浮在250μl水中并將50和100μl之間的等分試樣進(jìn)行HPLC分析。由HPLC對(duì)細(xì)胞內(nèi)母體藥和代謝衍生物定量。由于某些化合物的潛在的酸不穩(wěn)定性，需使用一種接近于生理pH的緩沖系統(tǒng)以分離代謝物。
圖7是在人體PBM細(xì)胞中氚化(±)-FTC(兩種測(cè)定的平均)出現(xiàn)(吸收)的時(shí)間(小時(shí))與pmol/106細(xì)胞的關(guān)系圖。吸收情況的研究表明放射標(biāo)記的FTC很容易被人體淋巴細(xì)胞吸收，它可以產(chǎn)生很大量的FTC5′-三磷酸酯衍生物。
實(shí)施例10 在各種細(xì)胞系中FTC的抗逆病毒活性用與實(shí)施例6中相似但并不相同的方法來測(cè)定在一系列細(xì)胞系中FTC的抗逆病毒活性。細(xì)胞系從人供體，AIDS Research和Reference Reagent Program，NIH，Rockville，Maryland，ATCC或紅十字得到。CEM胸苷激酶缺乏的細(xì)胞可以在5-溴-2′-脫氧尿嘧啶的存在下，由CEM細(xì)胞的連續(xù)病原體的培育得到。結(jié)果列于表5中。
表5在不同的細(xì)胞系統(tǒng)中FTC抗逆病毒活性
實(shí)施例11來自人體PBM細(xì)胞的(±)-FTC在介質(zhì)中與藥物培養(yǎng)24小時(shí)后，用放射標(biāo)記的FTC進(jìn)行該研究以追蹤細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的母體藥和代謝物的細(xì)胞內(nèi)模型，然后除去藥物。該研究測(cè)定了使細(xì)胞內(nèi)三磷酸酯水平降低所需的時(shí)間。該研究重復(fù)進(jìn)行。將未感染的細(xì)胞(2×105ml)懸浮在用血清補(bǔ)充(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10ml)的介質(zhì)中并在37℃下于5％CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。放射標(biāo)記的FTC的濃度是10μM。將細(xì)胞用標(biāo)記化合物脈沖24小時(shí)后，將細(xì)胞充分洗滌，然后用新鮮介質(zhì)在無抗病毒藥的存在下填充(0小時(shí))。在0，2，4，6，12，24和48小時(shí)(第二次培養(yǎng)時(shí)間)時(shí)，除去細(xì)胞，并立刻用60％冷甲醇/水萃取。離心得到萃取液并除去細(xì)胞丸。將萃取液冷凍干燥然后在-70℃下儲(chǔ)存。分析前，將物質(zhì)再次懸浮在250微升HPLC緩沖液中并立即分析。通過HPLC，用粉粒學(xué)或HewlettPackard模型1090PHLC系統(tǒng)與一根陰離子交換Partisil 10 SAX柱(Whatman公司)，在1ml/min的流速，1Kpsi壓力下，在262nm進(jìn)行UV檢測(cè)的情況下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)母體藥和代謝衍生物的定量。流動(dòng)相包括去離子化水(A)，2mM NaH2PO4/16mM NaOAc(pH＝6.6)(B)，15mM NaH2PO4/120.2mM NaOAc(pH＝6.6)(C)和100mM NaH2PO4/800mM NaOAc(pH＝6.6)(D)。
分離方法用A isocratic5分鐘，再進(jìn)行15分鐘線性梯度變化到100％B，接著進(jìn)行20分鐘線性梯度變化到100％C，接著進(jìn)行10分鐘線性梯度變化到100％D，然后用100％D進(jìn)行30分鐘isocratic。
在人體細(xì)胞中的保留時(shí)間(分鐘)
圖8是藥物除去數(shù)小時(shí)后測(cè)得的從人體PBM細(xì)胞得到的放射標(biāo)記的(±)-FTC與濃度(Pmol/106細(xì)胞)的關(guān)系圖。如圖中所示，F(xiàn)TC-三磷酸酯的細(xì)胞內(nèi)半衰期約為12小時(shí)，它們可以在1-5μM濃度下在細(xì)胞外藥物除去48小時(shí)后很容易地在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到，對(duì)化合物來說這遠(yuǎn)高于EC50。進(jìn)一步說，使用HIVRT，(±)-FTC三磷酸酯的親和力(K4)為0.2μM，它低于48小時(shí)濃度水平。
實(shí)施例12 藥物上可接受的(±)-FTC衍生物的抗-HIV活性。
a、使用與實(shí)施6中描述的相似方法，可以對(duì)由5’和N4位衍生制的許多藥物上可以接受的(±)-FTC衍生物進(jìn)行PBM細(xì)胞抗-HIV活性的評(píng)價(jià)，結(jié)果如下。(±)-FTC 5’-O-丁酸酯的EC50為0.0017。(±)-FTC N4-乙酰基衍生物的EC50為0.0028。(±)-FTC5’-O-丁酸酯，N4酯的EC50為0.0058。
b、在MT4系統(tǒng)中(±)-FTC5’-O-丁酸酯的抗-HIV活性(EC50)為0.04μM。在同樣的分析中，未?；?±)-FTC的IC50為0.52μM。在該系統(tǒng)中AZT的IC50為0.09μM。
實(shí)施例13 在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)FTC的(+)和(一)對(duì)映體活性的評(píng)價(jià)對(duì)FTC對(duì)映體在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)(由肝炎病毒粒子轉(zhuǎn)化成HepG2細(xì)胞)中抑制病毒生長(zhǎng)的能力在下面詳細(xì)加以描述。
在該培養(yǎng)體系中對(duì)抗病毒效果分析的總結(jié)和描述以及對(duì)HBV DNA的分析已經(jīng)有所描述(korba和Milman，1991，AntiviralRes.15217)?？共《镜脑u(píng)價(jià)在細(xì)胞的兩個(gè)不同病原體培養(yǎng)物中進(jìn)行。在所有盤上的所有阱中以相同密度同時(shí)接種。
由于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的HBV DNA水平固有的不同，只有比未處理細(xì)胞中HBV DNA體的平均水平降低3.5倍(對(duì)HBV病毒粒子DNA)或3倍(對(duì)HBV DNA復(fù)制中間體)以上才被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P＜0.05]。在每個(gè)細(xì)胞DNA制備中整合進(jìn)去的HBV DNA的水平(在這些試驗(yàn)中在每個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上它保持不變)用于計(jì)算細(xì)胞內(nèi)HBV DNA體的水平，以保證在每個(gè)樣品之間進(jìn)行等量細(xì)胞DNA的比較。
在未處理細(xì)胞中外HBV病毒粒子DNA的值在50到150pg/ml培養(yǎng)介質(zhì)之間(平均值約為76pg/ml)。在未處理細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制中間體在50到100pg/μg細(xì)胞DNA之間(平均值約為74pg/μg細(xì)胞DNA)?？偟膩碚f，由于用抗病毒化合物處理引起的細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平的下降比HBV病毒粒子DNA水平的下降更不明顯且更慢發(fā)生(korha和Milman，1991，Antiviral Res.，15217)。
這些試驗(yàn)的雜化分析顯示每個(gè)細(xì)胞約1.0pg細(xì)胞內(nèi)HBVDNA等價(jià)于2-3個(gè)染色體復(fù)制品，1.0pg/ml細(xì)胞外HBV DNA等價(jià)于3×105病毒粒子/ml。
進(jìn)行一些毒性分析以評(píng)價(jià)是否任何可以觀察到的抗病毒效果都是由影響細(xì)胞的生活力引起的。這里所用的方法是中性紅色染料吸收法，它是一種標(biāo)準(zhǔn)且廣泛用于分析各種病毒宿主系統(tǒng)包括HSV和HIV中細(xì)胞生活力的方法。毒性分析是在96阱平底組織培養(yǎng)盤中進(jìn)行。將用于毒性分析的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并用與下面抗病毒評(píng)價(jià)中所述的相同的程序用參試化合物進(jìn)行處理。每種化合物在4種濃度下進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)都在三重培養(yǎng)基中(“A”，“B”和“C”阱)。通過中性紅色染料的吸收來確定毒性的相對(duì)水平。用內(nèi)在染料在510nm處的吸收(Asin)作定量分析。用未處理細(xì)胞的9個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)基中的Asin均值的百分?jǐn)?shù)來表示該值，這些未處理細(xì)胞同受試化合物一樣保持在同一個(gè)96阱盤上。5號(hào)盤上9個(gè)對(duì)照培養(yǎng)基中染料吸收的范圍是91.6％到110.4％，6號(hào)盤是96.6％到109％。結(jié)果列于表6中。
表6在2.2.15細(xì)胞中受試化合物的毒性分析
*對(duì)DMSO，濃度用原料溶液的百分?jǐn)?shù)表示。
如表6所示，在用于抗病毒評(píng)價(jià)的濃度下沒有觀察到受試化合物具有明顯的毒性(在未處理細(xì)胞中觀察到的染料吸收水平降低了50％以上)。受試化合物(-)-FTC和(+)-FTC在用于毒性試驗(yàn)的最高濃度下(330μM)都顯示出毒性。
在正常變化范圍內(nèi)，未處理細(xì)胞中HBV病毒粒子DNA和細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體[HBV RI]的水平在攻擊期間保持不變。在1％濃度下，DMSO不影響2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中HBV的復(fù)制水平。
如表7所示，(-)-FTC和(+)-FTC在試驗(yàn)水平上都能明顯地抑制HBV的復(fù)制，如表8所示，(-)-FTC在4，1和0.25μM酌濃度下還能明顯地抑制HBV病毒粒子DNA和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的合成。
表7在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中試驗(yàn)化合物對(duì)HBV生成的影響
*對(duì)HBV病毒粒子DNA敏感性中止點(diǎn)是0.1pg/ml。
@將細(xì)胞內(nèi)HBV DNA在處理的第9天進(jìn)行24小時(shí)分析。在每個(gè)細(xì)胞DNA的制備中整合HBV DNA的水平用于計(jì)算游離基因的3.2Kb HBV染色體(MONO.)水平和HBV DNA復(fù)制中間體(RI)的水平。
表8在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中試驗(yàn)化合物對(duì)HBV生成的影響
*對(duì)HBV病毒粒子DNA敏感性中止點(diǎn)是0.1pg/ml。
+將細(xì)胞內(nèi)HBV DNA在處理的第9天進(jìn)行24小時(shí)分析。在每個(gè)細(xì)胞DNA的制備中整合HBV DNA的水平用于計(jì)算游離基因的3.2Kb HBV染色體(MONO.)和HBV DNA復(fù)制中間體(RI)的水平。
實(shí)施例14 人體肝細(xì)胞對(duì)(±)-FTC的吸收，F(xiàn)TC的HVB活性用人體肝細(xì)胞(HePG2細(xì)胞，從ATcc得到)重復(fù)實(shí)施例9的方法以確定FTC在這些細(xì)胞中的吸收和代謝。如圖9所示，(±)-FTC被HePG2細(xì)胞大量吸收。這些人體肝細(xì)胞將大部分(±)-FTC代謝成(±)-FTC三磷酸酯。
這個(gè)數(shù)據(jù)與這里提供的其它數(shù)據(jù)結(jié)合在一起表明(±)-FTC及其(-)，(+)對(duì)映體在肝細(xì)胞中被磷酸化。這些細(xì)胞可以被肝炎B病毒轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例15在人體HepG2細(xì)胞中FTC的存在圖10說明了細(xì)胞用10μM[3H]-(±)FTC(700DPM/Pmol)脈沖24小時(shí)后，[3H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物在人體HepG2中的存在情況，用Pmol/106細(xì)胞對(duì)時(shí)間表示，并評(píng)價(jià)了除去后24小時(shí)內(nèi)化合物的濃度。
表11說明了用10μM[3H]-(±)-FTC(700DPM/Pmol)培養(yǎng)24小時(shí)后，來自人體HePG2細(xì)胞中的[3H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物混合濃度的降低情況，用Pmol/106細(xì)胞對(duì)時(shí)間的關(guān)系表示。
如表中說明的那樣，甚至在48小時(shí)時(shí)細(xì)胞中仍存在1μM以上的活性化合物(對(duì)化合物而言這明顯高于EC50)。
實(shí)施例16 FTC對(duì)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞群體形成的影響圖12是FTC(-)和(+)對(duì)映體對(duì)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞群體形成的影響圖，用存活百分?jǐn)?shù)對(duì)濃度μM來測(cè)定，(-)-FTC為空心圈；(+)-FTC為實(shí)心圈；AZT為實(shí)心方塊。如圖所示，在該細(xì)胞系中，F(xiàn)TC(-)對(duì)映體比(+)-對(duì)映體或AZT均具有較小的毒性，即具有較高的IC50。
實(shí)施例17 給大鼠服用后FTC的代謝物在10，50和100mg/kg的劑量下給大鼠靜脈施用(±)-FTC，并評(píng)價(jià)血漿藥物濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積(AUC)，總清除率(CLT)，穩(wěn)態(tài)分布體積(Vss)，平均保留時(shí)間(MRT)和半衰期(t1/2)。結(jié)果列于表9中。
表9紿大鼠靜脈注射10，50，100mg/kg FTC后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)★
★AUC＝血漿藥物濃度對(duì)時(shí)間曲線下的面積；CL＝總清除率；Vss＝穩(wěn)態(tài)分布體積MRT＝平均保留時(shí)間t1/2＝半衰期實(shí)施例18 靜脈和口服FTC后FTC的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)紿獼猴施用(靜脈(I. V.)和口服(P.O))33.3mg/kg(±)-FTC得到模型獨(dú)立的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果列于表10中。值得注意的是，猴子對(duì)化合物的平均生物利用率為73％(±6％)。
表10給獼猴靜脈(I.V.)或口服(P.O.)33.3mg/kgFTC后得到的模型獨(dú)立的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)★
★AUC＝血漿藥物濃度對(duì)時(shí)間曲線下面的面積；CL＝總清除率；Vss＝穩(wěn)態(tài)分布體積；MRT＝平均保留時(shí)間；t1/2＝半衰期；F＝生物利用率；K4＝第一吸收速度常數(shù)。
表11處理1小時(shí)后FTC及其去氨基代謝物的CSF/血清比率
實(shí)施例19 獼猴中FTC及其代謝物的CSF/血清比率通過給獼猴服用33.3mg/kg活性化合物并在服藥后1小時(shí)內(nèi)測(cè)量大腦脊髓液(CSF)和血清中(±)-FTC的量來評(píng)價(jià)(±)-FTC穿過血腦屏障的能力。結(jié)果列于表11中。數(shù)字表明在該哺乳動(dòng)物中大量活性化合物穿過血腦屏障。
患有HIV或HBV感染性疾病的患者可通過服用有效量的(±)-FTC，其(-)或(+)對(duì)映體或藥物上可接受的衍生物或其鹽在有藥物上可接受的載體或稀釋劑存在下進(jìn)行治療。活性物質(zhì)可通過任何合適的途徑以液體或固體的形式施用，例如口服，非腸道，靜脈，肌肉，皮下或局部施用。
活性化合物包括藥物上可接受的載體或稀釋劑，以治療有效量的化合物提供給患者以抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制，特別是HIV和HBV的復(fù)制，同時(shí)對(duì)服藥患者不引起嚴(yán)重的毒性作用?！耙种屏俊笔侵赴l(fā)揮抑制作用足夠的活性成份的量，該抑制作用例如由這里描述的一種方法來測(cè)定。
對(duì)上面提到的所有情況，(-)，(+)或(±)-FTC的優(yōu)選劑量為每天約1到50mg/kg，優(yōu)選1到20mg/kg體重，更為常用的是每天每千克體重要0.1到約100mg。藥物上可接受衍生物的有效劑量范圍根據(jù)釋放出母體核苷的重量來計(jì)算。如果衍生物本身具有活性，有效劑量則可用衍生物的重量如上所述那樣來估計(jì)，或用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法來估計(jì)。
該化合物可以以任何合適的劑型單位方便地施用，包括但并不限于每單位劑型合7到3000mg，優(yōu)選70到1400mg活性組分。50-1000mg的口服劑量是合適的。
理想的情況是，施用的活性組分能達(dá)到活性化合物的血漿峰濃度，即從約0.2到70μM，優(yōu)選約1.0到10μM。這是可以達(dá)到的，如通過靜脈注射0.1到5％的活性化合物或任意鹽溶液，或服用活性組份的大丸藥。
藥物組合物中活性化合物的濃度依賴于藥物的吸收，去活性和排泄速度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。需要注意的是劑量值也隨著需緩解狀況的嚴(yán)重程度而有所變化。需要進(jìn)一步理解的是對(duì)于特殊的情況，特殊的劑量規(guī)定應(yīng)該按照個(gè)人的需要和施用或監(jiān)督服用該組合物的人的專門判斷，通過一定的時(shí)間加以調(diào)整，并且這里提出的濃度范圍僅作示范并不限制權(quán)利要求組合物的范圍或?qū)嵤??；钚越M分可以一次服用，或分成許多較小的劑量在不同的時(shí)間間隔內(nèi)服用。
活性化合物優(yōu)選的施用方式是口服?？诜M合物通常包括一種惰性稀釋劑或可食用的載體?？梢詫⑺鼈兎忾]在膠囊中或壓成片劑。為了治療上口服的目的，活性化合物可以和賦形劑結(jié)合并以片劑，錠劑或膠囊的形式液用。藥學(xué)上可容的凝固劑和/或輔助物質(zhì)也作為組合物的組成部分。
片劑，丸劑，膠囊，錠劑等等包含下面任何組份或具有相似性質(zhì)的化合物凝固劑如微結(jié)晶纖維素，黃蓍樹膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸，Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；滑劑如膠體二氧化硅，加甜劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷，水楊酸甲酯或桔味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，它除了包含上面各類物質(zhì)外還包含液體載體如脂肪油。此外，單位劑型可以包含改良單位劑型物理形狀的其它物質(zhì)如糖衣，紫膠片或其它腸劑。
(±)-FTC，其(-)或(+)對(duì)映體或其藥物上可接受的鹽可作為酏劑，懸浮液，糖漿，糯米紙囊劑，口香膠囊等的組份服用。糖漿除了包含活性化合物外還包含蔗糖作為加甜劑和某些防腐劑，染料和著色劑及調(diào)味劑。
(±)-FTC，其(-)或(+)對(duì)映體或其藥物上可接受的衍生物或鹽也可以和其它不削弱所需作用的活性物質(zhì)混合，或與具有增補(bǔ)所需作用的物質(zhì)混合，如抗生素，抗真菌劑，消炎劑或其它抗病毒劑，包括其它核苷抗HIV化合物。
用于非腸道，肌內(nèi)，皮下或局部施用的溶液或懸浮液包括下列成份用于注射的無菌稀釋劑如水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如芐基醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)強(qiáng)度的試劑如氯化鈉或右旋糖。非腸道制劑可以密封在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量管瓶中。
如果是靜脈給藥，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水液(PBS)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將活性化合物與載體一起制備，這將保護(hù)該化合物免于從身體內(nèi)快速消除，作為可控釋放劑型它包括移植物和微囊包封系統(tǒng)?？梢允褂蒙锝到猓锵嗳芫酆衔锶缫蚁┮宜嵋蚁?，聚酐，聚甘醇酸，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乙酸。這些劑型的制備方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是顯而易見的。在商業(yè)上這些物質(zhì)也可以從Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.得到。
脂質(zhì)體懸浮液(包括脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體帶有相對(duì)于病毒抗原的單克隆抗體以對(duì)準(zhǔn)感染細(xì)胞)也是優(yōu)選的藥物學(xué)上可接受的載體。它們可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備，例如美國(guó)專利4522811中所描述的方法(這里，該專利作為參考，全文加以收編)。例如，脂質(zhì)體劑型可制備如下將合適的脂(類)(例如硬脂?；字Ｒ掖及罚仓；字Ｄ憠A，arachadoyl磷脂酰膽堿和膽甾醇)溶解在無機(jī)溶劑中，然后將其蒸發(fā)，在容器的表面蓋一薄層干脂。然后將活性化合物或其單磷酸酯，二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液引入容器中。然后用手使容器旋轉(zhuǎn)直至脂從容器側(cè)面游離且脂聚集體分散為止，這樣就形成了脂質(zhì)體懸浮液。
FTC的單，雙及三磷酸酯可按如下所述方法制備。
單磷酸酯可按Imai等人著J.Org.Chem.，34(6)，1547-1550(1969年6月)的方法制備。例如，在約0℃并攪拌的情況下，將約100mg FTC和約280μl的磷酰氯在約8ml無水乙酸乙酯中反應(yīng)約4小時(shí)。將反應(yīng)物用冰驟冷。水相在一根活性碳柱上純化，用在1∶1乙醇和水的混合物中的5％氫氧化銨洗脫。蒸發(fā)洗脫劑得到FTC-5′-單磷酸銨。
二磷酸酯可按Davisson等人著J.Org.Chem.，52(9)，1794-1801(1987)的方法制備。FTC二磷酸酯可由相應(yīng)的甲苯磺酸酯制得，相應(yīng)的甲苯磺酸酯可將核苷與甲苯磺酰氯在吡啶中于室溫下反應(yīng)約24小時(shí)制得，按常規(guī)方法處理產(chǎn)品(即將其洗滌，干燥并結(jié)晶)。
三磷酸酯可按Hoard等人著J.Am.chemSoc.，87(8)，1785-1788(1965)的方法制備。將FTC活化(制成咪唑烷，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法)并用在DMF中的三丁基焦磷酸銨處理。該反應(yīng)主要得到核苷的三磷酸酯，還有一些未反應(yīng)的單磷酸酯和二磷酸酯。用DEAE柱的陰離子交換層析將其純化，然后分離出三磷酸酯，例如四鈉鹽。
本發(fā)明已對(duì)其優(yōu)選的具體實(shí)施方案做了詳述。從本發(fā)明前面的詳細(xì)描述中本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很明顯地看到本發(fā)明的各種變化和改良。所有這些變化和改良都包括在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.核苷對(duì)映體的外消旋混合物的拆分方法，該方法包括將外消旋混合物暴露在一種酶中，該酶優(yōu)選催化對(duì)映體之一的一個(gè)反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中酶選自酯酶，脂酶，枯草桿菌蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，和胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中酯酶是豬肝酯酶。
4.權(quán)利要求2的方法，其中脂酶選自豬胰脂肪酶和Amano PS-800脂酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中核苷對(duì)映體是在C5′-羥基位?；?。
6.權(quán)利要求5的方法，其中對(duì)映體在拆分之前是用選自烷基羧酸和取代烷基羧酸?；?。
7.權(quán)利要求6的方法，其中烷基羧酸選自乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，2-氯丙酸，2-氯丁酸，2-氯戊酸。
8.權(quán)利要求1的方法，其中將核苷對(duì)映體通過一個(gè)包括將酶固定在載體上的柱。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將對(duì)映體與酶的溶液混合。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括酶催化的反應(yīng)是在非離子表面活性劑的存在下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求10的方法，其中非離子表面活性劑是TritonX-100。
12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將拆分產(chǎn)物暴露在第二種酶中，以增高拆分。
13.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將拆分產(chǎn)物重結(jié)晶。
14.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用一種手性酸處理拆分產(chǎn)物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中手性酸選自蘋果酸，扁桃酸，二苯甲?；剖?，3-溴樟腦-8-磺酸，10-樟腦磺酸，和二-對(duì)-甲苯酰酒石酸。
16.權(quán)利要求1的方法，其中外消旋混合物是(±)-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
17.權(quán)利要求1的方法，其中外消旋混合物是(±)-2-羥基甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
全文摘要
本發(fā)明公開了核苷對(duì)映體的外消旋混合物的拆分方法，包括將外消旋混合物暴露在一種酶中的步驟，該酶優(yōu)選催化對(duì)映體之一的一個(gè)反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12P19/38GK1920050SQ20061009345
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期1992年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1991年2月22日
發(fā)明者D·C·廖塔, R·F·施基納齊, W·-B·崔 申請(qǐng)人:埃莫里大學(xué)