專利名稱：帶有標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法及應(yīng)用的制作方法
帶有標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種分別帶有eGFP和DsRed標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法，及其在制備EV71病毒的能力及藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)屬于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為7. 5kb,編碼約2200個氨基酸?；蚪M編碼的多聚蛋白可切割成3個前體蛋白(P1、P2、P3)。其中，Pl前體蛋白可切割4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前體蛋白可切割為7個非結(jié)構(gòu)蛋白 (2A、2B、2C、3A、;3B、3C、3D) ；P3區(qū)在進化過程中高度保守。ORF的兩側(cè)分別為5，和3，非編碼區(qū)，另外在3’非編碼區(qū)末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸(polyA)。
EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴重時可危及生命。其傳播途徑主要經(jīng)由胃腸道或呼吸道傳播，也可經(jīng)由接觸病人皮膚水泡的皰疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次報道以來，已在馬來西亞、澳大利亞、新加坡、日本，中國臺灣和中國大陸等國家和地區(qū)爆發(fā)和流行。在我國，很多地區(qū)都曾有散發(fā)病例的報道，直到2008年EV71的爆發(fā)流行(手足口病病例488955例，死亡1 例)，才引起了整個社會的關(guān)注。因此，2008年4月，國家衛(wèi)生部頒發(fā)了《腸道病毒(EV71)感染診療指南(2008版)》和《手足口病預(yù)防控制指南(2008版)》， 并在同年5月將手足口病納入丙類法定傳染病管理。2009年，我國部分地區(qū)手足口病病例呈現(xiàn)增多的趨勢。針對嚴峻的現(xiàn)狀，廣大的科學(xué)工作者以EV71為對象，從病毒的生物學(xué)特性、致病機理、診斷試劑和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治療手段。因此，繼續(xù)深入的開展相關(guān)的研究，如病毒的分子生物學(xué)特性、復(fù)制機制、致病機理等，將有利于人類更加全面透徹的了解EV71，從而為設(shè)計有效的藥物、準確的診斷方法和試劑以及良好的疫苗提供理論依據(jù)。
隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，科學(xué)家已經(jīng)能夠通過反向遺傳學(xué)的手段來定向改造病毒，為深入開展相關(guān)的病毒學(xué)研究提供了良好的工具。目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了許多不同的病毒研究中，如西尼羅病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹瀉病毒等，建立了相應(yīng)病毒的反向遺傳學(xué)平臺(全長感染性克隆)，以這些平臺為基礎(chǔ)開展了關(guān)于病毒的復(fù)制機制、 致病機理和疫苗的相關(guān)研究，并取得了突破性的進展。同時，相關(guān)的科學(xué)工作者在構(gòu)建的全長感染性克隆的基礎(chǔ)上進一步的設(shè)計了帶有不同標簽的全長感染性克隆。這一新的反向遺傳學(xué)平臺為開展相關(guān)的科學(xué)研究提供了相比于不帶標簽的病毒全長感染性克隆更便捷的優(yōu)勢。
因此，本發(fā)明分別獲得了帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆，為深入開展EV71的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供了有效的平臺。本發(fā)明具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實意義，同時具有廣泛的應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種分別帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的 EV71型全長感染性克隆構(gòu)建方法，首先建立EV71全長感染性克隆(pACYC-EV71-FL)，然后采用雙酶切的方法分別將eGFP基因和DsRed基因插入于低拷貝載體pACYC_EV71_FL中，從而分別獲得帶有eGFP標簽的EV71全長感染性克隆和帶有DsRed標簽的EV71全長感染性克隆。將獲得的EV71全長感染性克隆體外轉(zhuǎn)錄為RNA，并將其轉(zhuǎn)染Vero細胞，并通過細胞病變的觀察、eGFP的檢測、DsRed的檢測、病毒特定基因的檢測和病毒蝕斑等方法證明了分別eGFP基因和DsRed基因的EV71全長感染性克隆具有穩(wěn)定產(chǎn)生EV71的能力，產(chǎn)生的EV71 的生物學(xué)特性與親代病毒相似。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種分別帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆在制備病毒的能力和藥物篩選中的應(yīng)用。EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴重時可危及生命。實驗證明以構(gòu)建的帶有綠色熒光蛋白(eGFP)標簽的EV71全長感染性克隆和帶有紅色熒光蛋白(DsRed)標簽的EV71全長感染性克隆為平臺，使用已知對EV71具有抑制作用的鹽酸胍測試本發(fā)明所構(gòu)建的平臺在抗病毒藥物篩選中的有效性， 結(jié)果表明本發(fā)明能夠很好的應(yīng)用抗病毒的藥物篩選。另外，本發(fā)明也在研究EV71的動物模型、病毒的復(fù)制機制與致病機理、疫苗和診斷試劑的研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種分別帶有綠色熒光蛋白(eGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed)標簽的EV71型全長感染性克隆的制備方法，其步驟是
1.總RNA的提取
￠( 140ul 的 EV71 ^(Yong Zhang, Jitao Wang, Wanshen Guo, Haiyan Wang, Shuangli Zhu, Dongyan Wang, Ruyin Bai, Xingle Li, Dongmei Yan, Huiling Wang, Yan Zhang, Zhen Zhu, Xiaojuan Tan, Hongqiu An, Aiqiang Xu, and Wenbo Xu. Emergence and Transmission Pathways of Rapidly Evolving Evolutionary BranchC4a Strains of Human Enterovirus 71 in the Central Plain of China. PLoS One. 2011 ；6 (11) e27895.)，按照QIAamp Viral RNA (購自Qiagen公司)試劑盒說明書的要求抽提EV71的總 RNA，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (購自 Thermo 公司)測定 RNA 的濃度，并使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2. EV71 的 RT-PCR 擴增
將EV71的全基因組分成四個部分設(shè)計引物(這四個片段分別命名為F1、F2、F3和 F4)。以上述步驟1中的EV71的總RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒(購自Takara公司) 分別獲得DNA片段Fl、F2、F3和F4。片段的序列為SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4所示。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO 10, DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11禾口 SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7RNA聚合酶啟動子序列SEQ ID NO :13ο
SEQ ID NO 5
5’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’
SEQ ID NO 6
5’ -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，
SEQ ID NO 7
5’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，
SEQ ID NO 8
5’ -CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3‘
SEQ ID NO 9
5’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’
SEQ ID NO: 10
5， -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3，
SEQ ID NO: 11
5’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’
SEQ ID NO :12
5， -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，。
SEQ ID NO :13
TAATACGACTCACTATAGG
RT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript IStep Enzyme Mix :2μ 1, 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 為3μ 1，無 RNase 水18μ 1。擴增條件為50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28個循環(huán)。
3. EV71亞克隆的構(gòu)建
將上述步驟2中獲得的DNA片段Fl、F2、F3、F4和載體pUC19 (購自美國ftOgema 公司)分別用)(bal (購自美國NEB公司)和HindIII (購自美國NEB公司)酶切。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切的產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，并電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(購自美國^ffiB公司)分別連接經(jīng)過酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (購自美國Progenia公司)， 挑取克隆并進行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為10Xbuffer :2 μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物: 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴增條件為:94°C 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min,72°C 10min,16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為pUC19-Fl、pUC19-F2、pUC19-F3 和 pUC19-F4。
鑒定pUC19-Fl所用的引物為片段Fl的引物為SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；6
鑒定pUC19-F2所用的引物為片段F2的引物為SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；
鑒定pUC19-F3所用的引物為片段F3的引物為SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;
鑒定PUC19-F4所用的引物為片段F4的引物為SEQ ID NO 11和SEQ IDNO :12。
4.含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建
EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (購自美國NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步驟3中得到的pUC19-Fl和pUC19-F2，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定，PCR的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5'-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。擴增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2。
EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (購自美國NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步驟3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2μ1，Taq 酶0. 2μ 1，水16. 8μ 1。擴增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C 10min,16°C循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4。
EV71全長基因(Fl、F2、F3、F4)的拼接用AatII (購自美國NEB公司)和 HindiII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2和pUC19_F3_F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR 鑒定。PCR 的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴增條件為=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2-F3-F4。
拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(購自美國NEB公司)，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收經(jīng)過酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接經(jīng)過酶切的產(chǎn)物， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定PCR的反應(yīng)體系均為10Xbuffer :2μ 1，dNTP :0.4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴增條件為-MV 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL。5.分別帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆的構(gòu)建
以帶有eGFP和DsRed基因的質(zhì)粒(購自Clontech公司)為模版，使用I^rimeSTAR HS酶(購自Takara公司)，分別使用特異引物擴增eGFP和DsRed基因片段，兩種熒光標簽序列為 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 所示，擴增 eGFP 的引物為 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO: 17，擴增DsRed的引物為SEQ ID NO 18, SEQ ID NO :19。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度， 使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> SEQ ID N0:16
5 ‘ -ACATGCATGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3‘
SEQ ID N0:17
5 ‘ -CGACGCGTCTTGTACAGCTCGTCCATG-3‘
SEQ ID N0:18
5' -ACATGCATGCATGGACAACACCGAGGACGTCATC-3'
SEQ ID NO :19
5 ‘ -CGACGCGTCTGGGAGCCGGAGTGGCGGG-3‘
PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用的引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系均為5XPS buffer :10 μ 1，dNTP :4 μ 1，引物 0. 5μ 1，引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。擴增條件為 980C 30s，94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 個循環(huán)。
將獲得的eGFP基因片段、DsRed基因片段和pACYC177_EV71_FL分別為用SphI 和MluI酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過酶切的eGFP基因片段、DsRed基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量， 然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的產(chǎn)DNA片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101， 將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序。測序正確的克隆命名為 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC 177-EV71-DsRed_FL。
一種帶有eGFP和DsRed熒光標簽的EV71全長感染性克隆在制備EV71病毒的能力中的應(yīng)用
1.帶有eGFP和DsRed熒光標簽的EV71全長感染性克隆制備病毒的能力
(1)用 XbaI 分別酶切 pACYC177_EV71-eGFP_FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 并分別體外轉(zhuǎn)錄酶切后的 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 成為 RNA，并轉(zhuǎn)染細胞，37°C,5% (v/v)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染RNA的細胞對照組，顯微鏡下每天觀察實驗組和對照組的細胞狀態(tài)。
(2)將體外轉(zhuǎn)錄的 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的 RNA 轉(zhuǎn)染細胞，37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24h和48h，使用熒光顯微鏡觀察。
2.帶有eGFP和DsRed熒光標簽的EV71全長感染性克隆產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶熒光標簽基因的EV71的能力
(1)將體外轉(zhuǎn)錄的 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的 RNA 轉(zhuǎn)染細胞，37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48h，分別收集病毒(P0代)于-80°C保存；然后將PO代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(Pl代)，于-80°C保存；將Pl代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(P2代)，于_80°C保存；將 P2代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(P3代)，于_80°C保存；將P3代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(P4代)，于_80°C保存；將P4代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h分別收集部分病毒(P5代)，于-80°C保存，使用熒光顯微鏡觀察(即觀察P5代病毒的情況)eGFP和DsRed的表達情況。
(2)分別以 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 拯救的 Pl 代， P3代和P5代病毒以及pACYC-EV71-FL的PO代病毒(實驗室制備與保存)為對象，分別取病毒140 μ 1并抽提病毒的RNA，采用RT-PCR的方法檢測病毒的特定基因。
3. 一種分別帶有綠色熒光蛋白(eGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed)標簽的腸道病毒 EV71型全長感染性克隆制備的病毒與親代病毒的生物學(xué)特性
在6孔細胞培養(yǎng)板的各孔中分別接種3X IO5個Vero細胞，待細胞覆蓋孔底 80-90%時，吸棄孔中的培養(yǎng)基，接入DMEM培養(yǎng)基10倍比稀釋的轉(zhuǎn)染后48h的病毒100 μ 1， 37°C吸附lh。吸附完畢后將各個孔的病毒液吸棄，加入新鮮的37°C預(yù)熱的覆蓋物，于37°C、 5% (v/v)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；待噬斑形成后用含有(w/v)結(jié)晶紫和3. 7% (v/v) 甲醛的染色液染色，室溫，30min。取出孔中的覆蓋物，并用流水沖洗孔底，500C，5min后觀察斑點。
一種分別帶有綠色熒光蛋白(eGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed)標簽的腸道病毒 EV71型全長感染性克隆在制備病毒藥物篩選中的應(yīng)用
1.鹽酸胍對Vero細胞的毒性分析在96孔細胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細胞， 在37°C，5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達到90%;吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0、0. 0625， 0. 125、0. 25、0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的鹽酸胍，對照孔加 ΙΟΟμΙ 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48小時后，使用MTT檢測試劑盒檢測鹽酸胍對Vero的細胞毒性。
2.鹽酸胍分別對攜帶eGFP和DsRed基因的EV71的抑制作用在96孔細胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細胞，在37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達到90%時，分別向每孔加入 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 轉(zhuǎn)染 Vero 后 60h 收集并保存于_80°C的病毒液，感染復(fù)數(shù)為1，37°C吸附Ih ；吸附完畢后將各個孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的鹽酸胍(已經(jīng)報道對EV71 具有抑制作用)(GuHCL)IOOy 1，于37°C，5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使用熒光顯微鏡觀察。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果
1.該全長感染性克隆是以低拷貝的載體pACYC177為對象，將EV71的全基因組插入到pACYC177中，同時在與病毒5’端非編碼區(qū)上游的連接區(qū)域引入T7RNA聚合酶的啟動子序列，并且在5’端非編碼區(qū)和VP4基因之間分別插入eGFP和DsRed基因片段。一方面， 這些特點使得能夠在體外高效的獲得EV71的RNA ；另一方面，能夠采用電轉(zhuǎn)或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將RNA轉(zhuǎn)進細胞，并有效的產(chǎn)生EV71病毒，另外，能夠通過熒光顯微鏡的觀察eGFP 和DsRed的表達情況即可指示病毒的產(chǎn)生情況。
2.本發(fā)明結(jié)合了細胞病變、熒光檢測、基因檢測、病毒蝕斑和藥物抑制等實驗證明了本發(fā)明所構(gòu)建的EV71全長感染性克隆具有很強的產(chǎn)生EV71病毒的能力，并且也證明了本發(fā)明所建立的EV71全長感染性克隆所產(chǎn)生的EV71病毒與親代病毒具有相似的生物學(xué)特性。本發(fā)明所建立的EV71全長感染性克隆可以用來開展EV71的相關(guān)研究，具有廣泛的應(yīng)用價值。
3.以本發(fā)明為基礎(chǔ)，將為深入開展EV71的動物模型、病毒的復(fù)制機制與致病機理，抗病毒藥物篩選和藥物的作用機制、疫苗和診斷試劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價值，因此具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實意義。


圖1為一種分別帶有eGFP和DsRed標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的構(gòu)建示意圖
圖2為一種重組的EV71病毒產(chǎn)生的細胞病變示意圖
A 未轉(zhuǎn)染RNA的Vero細胞；
B 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-eGFP-FL 的 RNA 的 Vero 細胞；
C 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的 RNA 的 Vero 細胞；
圖3為一種熒光顯微鏡檢測重組的EV71病毒示意圖
A 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-eGFP-FL 的 RNA 后 24h 觀察的結(jié)果；
B 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-eGFP-FL 的 RNA 后 48h 觀察的結(jié)果；
C 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-DsRed-FL 的 RNA 后 24h 觀察的結(jié)果；
D 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-DsRed-FL 的 RNA 后 48h 觀察的結(jié)果；
圖4為一種熒光顯微鏡檢測重組的EV71病毒的穩(wěn)定性示意圖
A :pACYC177-EV71-eGFP-FL的P5代病毒感染Vero細胞后4 觀察的結(jié)果；
B :pACYC177-EV71-DsRed-FL的P5代病毒感染Vero細胞后4 觀察的結(jié)果；
圖5為一種特定基因的擴增檢測重組的EV71病毒的穩(wěn)定性示意圖
A 分別檢測pACYC177-EV71-eGFP-FL的P1、P3和P5代病毒的特定基因。泳道1 PACYC177-EV71-FL病毒PO代；泳道2 =Pl代病毒；泳道3 :P3代病毒；泳道4 :P5代病毒；泳道5:陰性對照；
B 分別檢測pACYC177-EV71-DsRed_FL的PI、P3和P5代病毒的特定基因。泳道 1 :pACYC177-EV71-FL病毒PO代；泳道2 =Pl代病毒；泳道3 :P3代病毒；泳道4 :P5代病毒； 泳道5:陰性對照
圖6為一種重組的EV71病毒與親代EV71病毒產(chǎn)生空斑的形態(tài)示意圖
A :pACYC177-EV71-FL病毒產(chǎn)生的空斑形態(tài)；
B :pACYC177-EV71-eGFP-FL 病毒產(chǎn)生的空斑形態(tài)；
C :pACYC177-EV71-DsRed-FL 病毒產(chǎn)生的空斑形態(tài)；
圖7為一種鹽酸胍對Vero細胞的毒性分析示意圖
使用MTT試劑盒檢測不同濃度的鹽酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1、2、4、8、 16,32和64mM)對Vero細胞的毒性；
圖8為一種鹽酸胍對EV71病毒的抑制作用示意圖
A 分別使用不同濃度的鹽酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25，0· 5和ImM)檢測其對帶有 pACYC177-EV71-eGFP-FL 的抑制作用；
B 分別使用不同濃度的鹽酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25，0· 5和ImM)檢測其對帶有 pACYC177-EV71-DsRed-FL 的抑制作用。
具體實施方式
實施例1 含有EV71全長基因的重組克隆的構(gòu)建，其步驟是
1.總RNA的提取
取140ul的EV71病毒液(前面已述)，按照QIAamp Viral RNA (購自Qiagen公司)試劑盒說明書的要求抽提EV71的總RNA，使用Hiermo Scientific NanoDrop 2000 (購自Thermo公司)測定RNA的濃度，并使用濃度為1 % (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2. EV71 的 RT-PCR 擴增
將EV71的全基因組分成四個部分設(shè)計引物(這四個片段分別命名為F1、F2、F3和 F4)。以上述步驟1中的EV71的總RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒(購自Takara公司)分別獲得DNA片段Fl、F2、F3和F4。片段Fl F4序列如SEQID NO :1 4所示。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C 保存?zhèn)溆谩?br> PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQID NO 9 和 SEQ ID NO :10，DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7RNA聚合酶啟動子序列SEQ ID NO :13ο
SEQ ID NO 5
5’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’
SEQ ID NO 6
5， -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，
SEQ ID NO 7
5’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，
SEQ ID NO 8
5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，
SEQ ID NO 9
5 ’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’
SEQ ID NO: 10
5 ’ -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3’
SEQ ID NO 11
5 ’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’
SEQ ID NO: 12
5 ’ -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
SEQ ID NO: 13
TAATACGACTCACTATAGG
RT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript IStep Enzyme Mix :2μ 1, 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 為3μ 1，無 RNase 水18μ 1。擴增條件為50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28個循環(huán)。
3. EV71亞克隆的構(gòu)建
將上述步驟2中獲得的0嫩片段？1、？2、？3、？4和載體？肌19(購自美國Progema 公司)分別用)(bal (購自美國NEB公司)和HindIII (購自美國NEB公司)酶切。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切的產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，并電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(購自美國^ffiB公司)分別連接經(jīng)過酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (購自美國Progenia公司)， 挑取克隆并進行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為10Xbuffer :2 μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物: 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴增條件為:94°C 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1、pUC19-F2、pUC19_F3 和 pUC19-F4。
鑒定pUC19-Fl所用的引物為片段Fl的引物為SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；
鑒定PUC19-F2所用的引物為片段F2的引物為SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；
鑒定pUC19-F3所用的引物為片段F3的引物為SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;
鑒定pUC19-F4所用的引物為片段F4的引物為SEQ ID NO 11和SEQ IDNO :12。
4、含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建
EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (購自美國NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步驟3中得到的pUC19-Fl和pUC19-F2，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101 (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定，PCR的反應(yīng)體系均12為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ IJaq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。擴增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2。
EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (購自美國NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步驟3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4。
EV71全長基因(F1-F2-F3-F4)的拼接用AatII (購自美國NEB公司)和 HindiII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2和pUC19_F3_F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR 鑒定。PCR 的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴增條件為=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2-F3-F4。
拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(購自美國NEB公司)，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收經(jīng)過酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接經(jīng)過酶切的產(chǎn)物， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進行PCR鑒定PCR的反應(yīng)體系均為10Xbuffer :2μ 1，dNTP :0.4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴增條件為-MV 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL。
5.分別帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆的構(gòu)建
以帶有eGFP和DsRed基因的質(zhì)粒(購自Clontech公司)為模版，使用I^rimeSTAR HS酶(購自Takara公司)，分別使用特異引物擴增eGFP和DsRed基因片段，兩種熒光標簽序列如SEQ ID NO :14-15所示，擴增eGFP的引物為SEQID NO 16-17，擴增DsRed的引物為SEQ ID NO: 18-19。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1 % (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> SEQ ID NO: 16
5' -ACATGCATGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'
SEQ ID NO :17
5' -CGACGCGTCTTGTACAGCTCGTCCATG-3‘
SEQ ID NO: 18
5 ‘ -ACATGCATGCATGGACAACACCGAGGACGTCATC-3‘
SEQ ID NO: 19
5 ‘ -CGACGCGTCTGGGAGCCGGAGTGGCGGG-3‘
PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系均為5XPS buffer :10μ l，dNTP :4μ 1，引物0. 5μ 1， 引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。擴增條件為:98°C 30s， 94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 個循環(huán)。
將獲得的eGFP基因片段、DsRed基因片段和pACYC177_EV71_FL分別為用SphI 和MluI酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過酶切的eGFP基因片段、DsRed基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量， 然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的產(chǎn)DNA片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101， 將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為 pACYC177-EV71-eGFP-FL和 pACYC177-EV71-DsRed_FL(圖 1)。
實施例2 帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆在制備EV71病毒的能力中的應(yīng)用，其步驟是
1.質(zhì)粒的線性化取 IOyg 質(zhì)粒 pACYC177-EV71-eGFP_FL 和 pACYC177-EV71-DsRed-FL，用XbaI (前面已述)酶切，然后向酶切產(chǎn)物中加入100 μ 1飽和酚(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)，混勻，17000g離心5min，吸取上層液體于新的離心管中， 并向原離心管中加入100 μ 1無菌水混勻，17000g離心5min ；吸取上層液體與上一步所得液體合并(總體積約200 μ 1)，加入200 μ 1氯仿(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)混勻，17000g 離心5min ；吸取上層液體于無菌進口離心管管中(約100μ 1)，加入10 μ 1的pH5. 2，3mol/ 1醋酸鈉(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)和250 μ 1體積無水乙醇(購自國藥集團化學(xué)試劑公司)混勻，-20°C放置30min，17000g離心5min ；吸棄上清，加入Iml 70% (ν/ν)乙醇洗滌，17000g離心5min，吸棄上清；室溫放置5min，最后加入11 μ 1無RNAase的水溶解，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度的1 % (w/ ν)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2. RNA 的體外轉(zhuǎn)錄取 2 μ g 經(jīng)過)(bal 酶切的 pACYC177-EV71_eGFP_FL 和pACYC177-EV71-DsRed-FL，按照 mMACHINE T7 Kit (購自美國 Ambion 公司)說明書的要求將其體外轉(zhuǎn)錄為RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測定RNA的濃度，使用濃度的(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，于-20°C保存?zhèn)溆谩?.轉(zhuǎn)染Vero細胞在6孔細胞培養(yǎng)板中接種3X IO5Vero細胞，待匯合度達到60-70 %時分別使用DMRIE-C試劑將體外轉(zhuǎn)錄的pACYC177-EV71_eGFP_FL和 pACYC177-EV71-DsRed-FL 的 1 μ g RNA轉(zhuǎn)染 Vero 細胞，37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該實驗含有未轉(zhuǎn)染RNA的細胞對照組。顯微鏡下每天觀察實驗組和對照組的細胞狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后48h，實驗組的細胞出現(xiàn)明顯的病變，而此時對照組的細胞沒有觀察到細胞病變(圖 2)，表明帶有標簽的EV71全長感染性克隆具有拯救病毒的能力。4.在6孔細胞培養(yǎng)板中接種3X IO5Vero細胞，待匯合度達到60-70%時分別使用 DMRIE-C 試劑將體外轉(zhuǎn)錄的 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的RNA，轉(zhuǎn)染后24h和48h，使用熒光顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)pACYC177-EV71-eGFP_FL和 pACYCl77-EV71-DsRed-FL的RNA轉(zhuǎn)染Vero細胞后24h可見陽性細胞，S卩分別可見綠色熒光和紅色熒光，隨著培養(yǎng)時間的延長，陽性細胞的數(shù)目增多，在轉(zhuǎn)染后48h，陽性細胞明顯增多 (圖3)。表明帶有eGFP標簽的EV71全長感染性克隆和帶有DsRed標簽的EV71全長感染性克隆具有拯救病毒的能力。實施例3 帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆具有分別產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶eGFP和DsRed基因的EV71的能力，其步驟是1.在6孔細胞培養(yǎng)板中接種3 X IO5Vero細胞，待匯合度達到60-70%時分別使用 DMRIE-C 試劑將體外轉(zhuǎn)錄的 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的 RNA， 轉(zhuǎn)染后48h，分別收集病毒(PO代)于_80°C保存；然后將PO代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(Pl代)，于_80°C保存；將Pl代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(P2代)，于_80°C保存；將P2代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h 收集病毒(P3代)，于_80°C保存；將P3代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h收集病毒(P4代)，于_80°C保存；將P4代病毒分別感染Vero細胞，并于感染后60h分別收集部分病毒(P5代)，于_80°C保存，使用熒光顯微鏡觀察(即觀察P5代病毒的情況)eGFP和DsRed 的表達情況。實驗表明pACYC177-EV71-eGFP-FL和pACYC177-EV71-DsRed_FL拯救的病毒具有穩(wěn)定攜帶報告基因的能力(圖4)。2.分另Ij 以 pACYC177-EV71-eGFP-FL 禾Π pACYC177-EV71-DsRed_FL 拯救的 Pl 代，P3代和P5代病毒以及pACYC-EV71-FL的PO代病毒(實驗室制備與保存)為對象，分別取病毒140 μ 1，使用QIAamp Viral RNA試劑盒抽提病毒的RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000測定抽提的EV71的RNA的濃度，并電泳檢測RNA 的質(zhì)量。使用弓丨物 Pl-i^orward :CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTG CACCCACT 和 P2-Reverse :CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT 采用 RT-PCR 試劑盒檢測病毒基因組的特定區(qū)域。RT-PCR的反應(yīng)條件50 0C 30min, 94 °C 2min, 94 °C 30sec, 55 "C 30sec，72 "C 2. 5min，72 "C IOmin, 16 "C IOmin 循環(huán)數(shù)為 28。將 RT-PCR 的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn) pACYC 177-EV71 -eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 拯救的病毒和PACYC177-EV71-FL病毒均能擴增出相應(yīng)的基因片段，分別為 1.4kb (pACYC-EV71-FL)、2·Ikb(pACYC177-EV71-eGFP-FL)禾口 1.4kb (pACYC-EV71-FL)、2. Ikb (pACYC177-EV71-DsRed-FL)。由于帶有標簽的EV71病毒在基因組中分別含有eGFP 和DsRed基因，因此RT-PCR的產(chǎn)物比不帶標簽的病毒的RT-PCR產(chǎn)物大(圖5)，表明構(gòu)建的帶有標簽 EV71 全長感染性克隆(pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed-FL)具有產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶報告基因的EV71的能力。實施例4 一種分別帶有eGFP和DsRed標簽的腸道病毒EV71型全長感染性克隆在制備的病毒與親代病毒的生物學(xué)特性，其步驟是在6孔細胞培養(yǎng)板中接種4X IO5Vero細胞，待匯合度達到80-90 %，吸棄孔中的培養(yǎng)基，接入用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的轉(zhuǎn)染后48h的病毒100 μ 1 [分別包括pACYC-EV71-FL的PO代病毒(實驗室制備與保存)、 pACYC 177-EV71 -eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 的 PO 代病毒]，37 "C 吸附 Ih ；吸附完畢后將各個孔的病毒液吸棄，加入新鮮的37°C預(yù)熱的覆蓋物，其成份為2% (v/v)FBS, IXDMEM培養(yǎng)基，2% (w/v)的甲基纖維素。于37°C、5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；待噬斑形成后用含有(w/v)結(jié)晶紫和3.7% (ν/ν)甲醛的染色液染色，室溫，30min后取出孔中覆蓋物，并用流水沖洗孔底，于50°C，5min，可見空斑(圖6)。結(jié)果顯示拯救的病毒與父代病毒在Vero細胞上產(chǎn)生空斑的形態(tài)相似，實驗初步表明pACYC177-EV71-eGFP-FL和 pACYC177-EV71-DsRed-FL拯救的PO代病毒與pACYC_EV71_FL拯救的PO代病毒具有相似的生物學(xué)特性。實施例5 帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆在制備EV71藥物篩選中的應(yīng)用，其步驟是1.鹽酸胍對Vero細胞的毒性分析在96孔細胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細胞， 在37°C，5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達到90%;吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0、0. 0625， 0. 125、0. 25、0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的鹽酸胍，對照孔加 ΙΟΟμΙ 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液10 μ 1，在37°C ,5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4h，然后加入i^rmazan溶解液，在37°C ,5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4h， 直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)i^rmazan全部溶解；在570nm測定吸光值(圖7)，計算細胞存活率達到90%以上時的鹽酸胍的最大使用濃度，以該最大濃度作為鹽酸胍對EV71 的抑制實驗中的最大使用濃度。實驗結(jié)果表明當鹽酸胍的濃度不大于2mM時，Vero細胞的存活率不低于90%，因此，后續(xù)的實驗中，鹽酸胍的使用濃度為0、0. 0625,0. 125,0. 25、 0. 5、1 和 2mM ；2.鹽酸胍分別對攜帶eGFP和DsRed基因的EV71的抑制作用在96孔細胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細胞，在37 °C，5 % (v/v) CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達到90 %時，分別向每孔加入 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL 轉(zhuǎn)染 Vero 后 60h 收集并保存于-80°C的病毒液，感染復(fù)數(shù)為1，37°C吸附Ih ；吸附完畢后將各個孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的鹽酸胍(已經(jīng)報道對 EV71具有抑制作用)(GuHCL)IOOy 1，于37°C，5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使用熒光顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)隨著GuHCL濃度的增加，其抑制eGFP和DsRed表達的能力逐漸增強。表明GuHCL與EV71的抑制關(guān)系呈現(xiàn)濃度依賴性。當GuHCL的濃度為ImM時，其能完全抑制 eGFP和DsRed的表達(圖8)。本實驗表明本發(fā)明所有構(gòu)建的pACYC177_EV71-eGFP_FL和
16pACYC177-EV71-DsRed-FL能夠用于抗EV71的藥物篩選研究。 最后，還需要注意的是，上述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法， 并且以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 一種帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆構(gòu)建方法， 其步驟是(1)總RNA的提取取140ul的EV71病毒液，按照QIAamp Viral RNA試劑盒說明書的要求抽提EV71的RNA ；(2)EV71的 RT-PCR 擴增根據(jù)EV71基因的特性，將該基因分為了四個部分，分別命名為F1、F2、F3和F4，以步驟 ⑴中的總RNA為模版，采用RT-PCR分別獲得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列為SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 所示，DNA 片段 Fl 的引物SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO :6, DNA 片段 F2 的引物SEQID NO :7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物 SEQ ID NO :9 禾口 SEQID NO : 10，DNA 片段 F4 的引物SEQ ID NO :11 禾口 SEQ ID NO: 12，另外 SEQ ID NO 5含有T7RNA聚合酶啟動子序列SEQ ID NO :13 ；RT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript IStep Enzyme Mix :2 μ 1，2X ISt印 Buffer 25 μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板RNA為3μ 1，無RNase水18μ 1 ；擴增條件為 500C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C 10min，28 個循環(huán)；(3)EV71亞克隆的構(gòu)建將步驟O)中獲得的片段F1、F2、F3、F4分別和載體pUC19連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為 pUC19-Fl、pUC19-F2、pUC19-F3 和 pUC19_F4 ；(4)含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建用BsiwI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19_Fl和pUC19_F2，回收pUC19_Fl的大片段和PUC19-F2的小片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2 ；用SpeI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19_F3和pUC19_F4，回收pUC19_F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4 ；用 AatII 和 HindIII 酶切 pUC19_Fl_F2 和 pUC19_F3_F4，回收 pUC19_Fl_F2 的大片段和PUC19-F3-F4的大片段的大片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為 PUC19-F1-F2-F3-F4 ；用^CbaI和HindIII酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過酶切的pACYC177，使用濃度為1 % (w/v) 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL ；(5)分別帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆的構(gòu)建以帶有eGFP和DsRed基因的質(zhì)粒為模版，使用I^rimeSTAR HS酶，分別使用特異引物擴增eGFP和DsRed基因片段，兩種熒光標簽序列為SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15所示，擴增 eGFP 的引物為 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17，擴增 DsRed 的引物為 SEQ ID NO 18, SEQ ID N0:19，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000測定DNA的濃度，使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆?；PCR 的反應(yīng)體系均為 5XPS buffer :10 μ 1，dNTP :4 μ 1，引物0. 5 μ 1，引物0. 5 μ 1， 模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水；34 μ 1。擴增條件為98 °C 30s, 94 °C 10s, 55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 個循環(huán)；將獲得的eGFP基因片段和DsRed基因片段和步驟⑷中的pACYC177_EV71_FL分別為用SphI和MluI酶切，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過酶切的eGFP基因片段、 DsRed基因片段和pACYC177-EV71-FL，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過回收的產(chǎn)DNA片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序，測序正確的克隆命名為 pACYC177-EV71-eGFP-FL 和 pACYC177-EV71-DsRed_FL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆構(gòu)建方法，其特征在于所述的EV71病毒5’端非編碼區(qū)上游插入了 T7 RNA聚合酶的啟動子序列，啟動子序列如SEQ ID N0:13所示。
3.權(quán)利要求1所述的一種帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆在制備病毒的能力中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆在篩選抗EV71病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種帶有標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法及應(yīng)用，其步驟是(1)總RNA的提??；(2)EV71的RT-PCR擴增；(3)EV71亞克隆的構(gòu)建；(4)含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建；(5)帶有eGFP和DsRed的EV71全長感染性克隆的構(gòu)建。通過細胞病變、熒光檢測、基因檢測、病毒蝕斑和藥物抑制等實驗證明成功獲得帶有標簽的EV71全長感染性克隆。本發(fā)明在動物模型、病毒復(fù)制與致病機理、藥物篩選和藥物作用機制、疫苗和診斷試劑的研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/41GK102517317SQ20111044437
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者史佩勇, 商寶娣, 張波, 袁志明, 許文波, 賈凡, 鄧成林 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所