專利名稱：帶有熒光素酶標(biāo)簽的ev71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種帶有IUuc標(biāo)簽的腸道病毒71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法，同時(shí)還涉及一種帶有mUC標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒的能力及藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)屬于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)，其基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為7. 5kb,編碼約2200個(gè)氨基酸?；蚪M編碼的多聚蛋白可切割成3個(gè)前體蛋白(P1、P2、P3)。其中，Pl前體蛋白可切割4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前體蛋白可切割為7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (2A、2B、2C、3A、;3B、3C、3D) ；P3區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。ORF的兩側(cè)分別為5，和3，非編碼區(qū)，另外在3’非編碼區(qū)末端含有一個(gè)長(zhǎng)度可變的多聚腺苷酸(polyA)。EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無(wú)菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。其傳播途徑主要經(jīng)由胃腸道或呼吸道傳播，也可經(jīng)由接觸病人皮膚水泡的皰疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次報(bào)道以來(lái)，已在馬來(lái)西亞、澳大利亞、新加坡、日本，中國(guó)臺(tái)灣和中國(guó)大陸等國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)和流行。在我國(guó)，很多地區(qū)都曾有散發(fā)病例的報(bào)道，直到2008年EV71的爆發(fā)流行(手足口病病例488955例，死亡1 例)，才引起了整個(gè)社會(huì)的關(guān)注。因此，2008年4月，國(guó)家衛(wèi)生部頒發(fā)了《腸道病毒(EV71)感染診療指南(2008版)》和《手足口病預(yù)防控制指南(2008版)》， 并在同年5月將手足口病納入丙類法定傳染病管理。2009年，我國(guó)部分地區(qū)手足口病病例呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)。針對(duì)嚴(yán)峻的現(xiàn)狀，廣大的科學(xué)工作者以EV71為對(duì)象，從病毒的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、診斷試劑和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治療手段。因此，繼續(xù)深入的開(kāi)展相關(guān)的研究，如病毒的分子生物學(xué)特性、復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)理等，將有利于人類更加全面透徹的了解EV71，從而為設(shè)計(jì)有效的藥物、準(zhǔn)確的診斷方法和試劑以及良好的疫苗提供理論依據(jù)。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，科學(xué)家已經(jīng)能夠通過(guò)反向遺傳學(xué)的手段來(lái)定向改造病毒，為深入開(kāi)展相關(guān)的病毒學(xué)研究提供了良好的工具。目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了許多不同的病毒研究中，如西尼羅病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹瀉病毒等，建立了相應(yīng)病毒的反向遺傳學(xué)平臺(tái)(全長(zhǎng)感染性克隆)，以這些平臺(tái)為基礎(chǔ)開(kāi)展了關(guān)于病毒的復(fù)制機(jī)制、 致病機(jī)理和疫苗的相關(guān)研究，并取得了突破性的進(jìn)展。同時(shí)，相關(guān)的科學(xué)工作者在構(gòu)建的全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)一步的設(shè)計(jì)了帶有不同標(biāo)簽的全長(zhǎng)感染性克隆。這一新的反向遺傳學(xué)平臺(tái)為開(kāi)展相關(guān)的科學(xué)研究提供了相比于不帶標(biāo)簽的病毒全長(zhǎng)感染性克隆更便捷的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明提供了一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆，為深入開(kāi)展EV71 的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供了有效的平臺(tái)。本發(fā)明具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法。通過(guò)該方法，可獲得帶有mUC標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆。將獲得的EV71全長(zhǎng)感染性克隆體外轉(zhuǎn)錄為RNA，并將其轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞病變的觀察、Rluc活性的檢測(cè)和病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)證明了帶有IUuc基因的EV71全長(zhǎng)感染性克隆具有穩(wěn)定產(chǎn)生EV71的能力，并且產(chǎn)生的EV71的生物學(xué)特性與親代病毒相似。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒的能力和藥物篩選中的應(yīng)用，EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、 無(wú)菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。實(shí)驗(yàn)證明，以構(gòu)建的帶有mUC標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆為平臺(tái)，使用已知對(duì)EV71具有抑制作用的鹽酸胍測(cè)試本發(fā)明所構(gòu)建的平臺(tái)在抗病毒藥物篩選中的有效性，結(jié)果表明本發(fā)明能夠很好的應(yīng)用抗病毒的藥物篩選。另外，本發(fā)明也在研究EV71的動(dòng)物模型、病毒的復(fù)制機(jī)制與致病機(jī)理、藥物的作用機(jī)制、疫苗和診斷試劑的研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法，其步驟是1.總RNA的提取取 140ul 的 EV71 ^(Yong Zhang, Jitao Wang, Wanshen Guo, Haiyan Wang, Shuangli Zhu, Dongyan Wang, Ruyin Bai, Xingle Li, Dongmei Yan, Huiling Wang, Yan Zhang, Zhen Zhu, Xiaojuan Tan, Hongqiu An, Aiqiang Xu, and Wenbo Xu. Emergence and Transmission Pathways of Rapidly Evolving Evolutionary BranchC4a Strains of Human Enterovirus 71in the Central Plain of China. PLoS One. 2011 ；6 (11) e27895.)，按照QIAamp Viral RNA (購(gòu)自Qiagen公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求抽提EV71的總 RNA，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (購(gòu)自 Thermo 公司)測(cè)定 RNA 的濃度，并使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，于-80°C保存?zhèn)溆谩?. EV71 的 RT-PCR 擴(kuò)增將EV71的全基因組分成四個(gè)部分設(shè)計(jì)引物(這四個(gè)片段分別命名為F1、F2、F3和 F4)。以上述步驟1中的EV71的總RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒(購(gòu)自Takara公司)分別獲得 DNA 片段 F1、F2、F3 和 F4。片段 Fl、F2、F3 和 F4 序列如 SEQ ID NO =USEQ ID N0: 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR 產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo ScientificNanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用濃度為1 % (w/v) 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，并于_20°C保存?zhèn)溆?。PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQID NO 9 和 SEQ ID NO :10，DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列SEQ ID NO :13ο
SEQ ID NO 55’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’SEQ ID NO 65’ -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，SEQ ID NO 75’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，SEQ ID NO 85’ -CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3‘SEQ ID NO 95’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’SEQ ID NO: 105， -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3，SEQ ID NO: 115’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’SEQ ID NO :125， -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，SEQ ID NO :13TAATACGACTCACTATAGGRT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2 μ 1， 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 為3μ 1，無(wú) RNase 水18μ 1。擴(kuò)增條件為50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28個(gè)循環(huán)。3. EV71亞克隆的構(gòu)建將上述步驟2中獲得的DNA片段Fl、F2、F3、F4和載體pUC19 (購(gòu)自美國(guó)ftOgema 公司)分別用)(bal (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)酶切。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切的產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測(cè)定DNA的濃度，并電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)^ffiB公司)分別連接經(jīng)過(guò)酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (購(gòu)自美國(guó)Progenia公司)， 挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為=IOXbuffer :2μ 1, dNTP :0. 4 μ 1，引物 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴(kuò)增條件為:94°C 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1、pUC19-F2、pUC19_F3 和 pUC19-F4。鑒定pUC19-Fl所用的引物為片段Fl的引物為SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；鑒定pUC19-F2所用的引物為片段F2的引物為SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；鑒定pUC19-F3所用的引物為片段F3的引物為SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;鑒定PUC19-F4所用的引物為片段F4的引物為SEQ ID NO 11和SEQ IDNO :12。4.含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建
EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步驟3中得到的pUC19-Fl和pUC19-F2，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4 DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定，PCR的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ IJaq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。擴(kuò)增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2。EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步驟3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴(kuò)增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C 10min,16°C循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4。EV71全長(zhǎng)基因(F1-F2-F3-F4)的拼接用AatII (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和 HindIII (前面已述)酶切PUC19-F1-F2和pUC19_F3_F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR 鑒定。PCR 的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴(kuò)增條件為=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2-F3-F4。拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(購(gòu)自美國(guó)NEB公司)，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收經(jīng)過(guò)酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過(guò)酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接經(jīng)過(guò)酶切的產(chǎn)物， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101 (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定PCR的反應(yīng)體系
7均為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2 μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴(kuò)增條件為-MV 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL。5.帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建以帶有Rluc基因的質(zhì)粒(購(gòu)自Promega公司)為模版，使用I^rimeSTAR HS酶 (購(gòu)自Takara公司)，使用特異引物擴(kuò)增IUuc基因片段，序列如SEQ ID N0:14所示，擴(kuò)增 Rluc的引物為SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16。使用濃度為1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)分別回收DNA 片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用濃度為 1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆谩EQ ID NO: 155 ‘ -ACATGCATGCATGGCTTCCAAGGTGTACGACC-3‘SEQ ID NO: 165 ‘ -CGACGCGTCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC-3‘PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系均為5XPS buffer :10μ l，dNTP :4μ 1，引物0. 5μ 1， 引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。擴(kuò)增條件為:98°C 30s， 94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 個(gè)循環(huán)。將獲得的Rluc基因片段和pACYC177-EV71-FL分別為用SphI和MluI酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過(guò)酶切的mUC基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用濃度為 1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的產(chǎn)DNA 片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pACYC177-EV71-Rluc-FL。一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備EV71病毒的能力的中應(yīng)用其步驟是1.帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆制備病毒的能力①用)(bal酶切 pACYC177-EV71-Rluc-FL 并體外轉(zhuǎn)錄為 RNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37°C，5 % (v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染RNA的細(xì)胞對(duì)照組，顯微鏡下每天觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞狀態(tài)。②體外轉(zhuǎn)錄的pACYC177-EV71-IUuc-FL的RNA采用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞，然后接種3 X IO5轉(zhuǎn)染了 RNA的Vero細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在轉(zhuǎn)染后2、6、14、16、18、 20,22,24,48和60h使用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，同時(shí)設(shè)置一組轉(zhuǎn)染時(shí)不含RNA的對(duì)照組。③體外轉(zhuǎn)錄的pACYC177-EV71-IUuc-FL的RNA采用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞，然后接種3 X IO5轉(zhuǎn)染了 RNA的Vero細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別在轉(zhuǎn)染后2、6、14、16、 18、20、22、24和4 收集孔中培養(yǎng)基(即PO代不同時(shí)間點(diǎn)的病毒液)，并于_80°C保存，每次收集上清完畢后分別向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ 1細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，分別混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System說(shuō)明書(shū)的要求使用多功能讀板儀檢測(cè)IUuc的活性。2.帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶IUuc基因的EV71的能力轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的pACYC177-EV71-Rluc-FL的RNA進(jìn)入Vero細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后2、6、 14、16、18、20、22和24h的PO代病毒感染Vero細(xì)胞，37°C、5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ 1細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System說(shuō)明書(shū)的要求使用多功能讀板儀檢測(cè)IUuc的活性。3.帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆制備的病毒與親代病毒的生物學(xué)特性在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中分別接種3X IO5個(gè)Vero細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋孔底 80-90%時(shí)，吸棄孔中的培養(yǎng)基，接入DMEM培養(yǎng)基10倍比稀釋的轉(zhuǎn)染后60h的病毒100 μ 1， 37°C吸附lh。吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄，加入新鮮的37°C預(yù)熱的覆蓋物，于37°C、 5% (v/v)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；待噬斑形成后用含有(w/v)結(jié)晶紫和3. 7% (ν/ν) 甲醛的染色液染色，室溫，30min。取出孔中的覆蓋物，并用流水沖洗孔底，500C，5min后觀察斑點(diǎn)。一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒藥物篩選中的應(yīng)用1.鹽酸胍對(duì)Vero細(xì)胞的毒性分析在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細(xì)胞， 在37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到90%;吸棄每個(gè)孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0、0. 0625， 0. 125、0. 25、0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的鹽酸胍，對(duì)照孔加 ΙΟΟμΙ 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48小時(shí)后，使用MTT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鹽酸胍對(duì)Vero的細(xì)胞毒性。2.鹽酸胍對(duì)攜帶IUuc基因的EV71的抑制作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種 2 X IO4Vero細(xì)胞，在37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到90%時(shí)，分別向每孔加入pACYC177-EV71-IUuC-FL轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后60h收集并保存于_80°C的病毒液，感染復(fù)數(shù)為1，37°C吸附Ih;吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的鹽酸胍(濃度分別為0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM) (已經(jīng)報(bào)道對(duì)EV71具有抑制作用)，于37°C，5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ 1細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照 Luciferase Assay System說(shuō)明書(shū)的要求使用多功能讀板儀檢測(cè)Rluc的活性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.該全長(zhǎng)感染性克隆是以低拷貝的載體pACYC177為對(duì)象，將EV71的全基因組插入到pACYC177中，同時(shí)在與病毒5’端非編碼區(qū)上游的連接區(qū)域引入T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，并且在5’端非編碼區(qū)和VP4基因之間插入IUuc基因片段。一方面，這些特點(diǎn)使得能夠在體外高效的獲得EV71的RNA ；另一方面，能夠采用電轉(zhuǎn)或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將RNA 轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，并有效的產(chǎn)生EV71病毒，另外，能夠通過(guò)檢測(cè)IUuc的表達(dá)情況即可指示病毒的產(chǎn)生情況。2.本發(fā)明結(jié)合了細(xì)胞病變、熒光素酶的檢測(cè)、病毒蝕斑和藥物抑制等實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明所構(gòu)建的EV71全長(zhǎng)感染性克隆具有很強(qiáng)的產(chǎn)生EV71病毒的能力，并且也證明了本發(fā)明所建立的EV71全長(zhǎng)感染性克隆所產(chǎn)生的EV71病毒與親代病毒具有相似的生物學(xué)特性。本發(fā)明所建立的EV71全長(zhǎng)感染性克隆可以用來(lái)開(kāi)展EV71的相關(guān)研究，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。3.以本發(fā)明為基礎(chǔ)，將為深入開(kāi)展EV71的動(dòng)物模型、病毒的復(fù)制機(jī)制與致病機(jī)理，抗病毒藥物篩選和藥物的作用機(jī)制、疫苗和診斷試劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建示意2為一種重組病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變示意圖A 未轉(zhuǎn)染RNA的Vero細(xì)胞；B 轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-Rluc_FL 的 RNA 的 Vero 細(xì)胞；圖3為一種重組病毒與親代病毒產(chǎn)生空斑的形態(tài)比較示意圖A :pACYC177-EV71-Rluc-FL 病毒產(chǎn)生的空斑形態(tài)；B :pACYC177-EV71-FL病毒產(chǎn)生的空斑形態(tài)；圖4為一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆產(chǎn)生病毒的能力示意圖在RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后2、6、14、16、18、20、22和24h分別收集樣品，然后按照 Luciferase Assay System試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IUuc活性。圖5為一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆穩(wěn)定產(chǎn)生的病毒能力的分析示意圖將？40丫(1774￥71-1 111(；呼1^轉(zhuǎn)染￥61~0后2、6、14、16、18、20、22和24h 收集且保存于_80°C的病毒感染Vero細(xì)胞，并分別在感染后24h使用Luciferase Assay System試劑盒檢測(cè)IUuc的活性。圖6為一種鹽酸胍對(duì)Vero細(xì)胞的毒性分析示意圖使用MTT試劑盒檢測(cè)不同濃度的鹽酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1、2、4、8、 16,32和64mM)對(duì)Vero細(xì)胞的毒性。圖7為一種鹽酸胍對(duì)EV71的抑制作用示意圖分別使用不同濃度的鹽酸胍(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM)作用于含有 pACYC177-EV71-Rluc-FL病毒的Vero細(xì)胞，感染后24h檢測(cè)Rluc的活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種帶有IUuc標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法，其步驟是(1)總 RNA 的提取取140ul的EV71病毒液(前面已述)，按照QIAamp Viral RNA (購(gòu)自Qiagen公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求抽提EV71的總RNA，使用Hiermo Scientific NanoDrop 2000(購(gòu)自Thermo公司)測(cè)定RNA的濃度，并使用濃度為1 % (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，于-80°C保存?zhèn)溆谩?2) EV71 的 RT-PCR 擴(kuò)增將EV71的全基因組分成四個(gè)部分設(shè)計(jì)引物(這四個(gè)片段分別命名為F1、F2、F3和F4)。以上述步驟(1)中的EV71的總RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒(購(gòu)自Takara公司) 分別獲得DNA片段Fl、F2、F3和F4。片段Fl F4序列如SEQ ID NO :1 4所示。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用濃度為(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆?。PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。DNA片段Fl的引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，DNA片段F2的引物SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物SEQID NO 9 和 SEQ ID NO :10，DNA 片段F4的引物SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。另外SEQ ID NO :5含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列SEQ ID NO :13οSEQ ID NO 55 ’ -CTAGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCCACT-3’SEQ ID NO 65’ -CTAGAAGCTTCCTCAAATTAATCCACTGGT-3，SEQ ID NO 75’ -CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，SEQ ID NO 85’ -CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3‘SEQ ID NO 95’ -CTAGTCTAGACTCAGAACCTGGTGATTGC-3’SEQ ID NO: 105， -CTAG AAGCTTAATTTTATCAATCGAGCGCAG-3，SEQ ID NO :115’ -CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3’SEQ ID NO :125， -CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，。SEQ ID NO :13TAATACGACTCACTATAGGRT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2 μ 1， 2 X IStepBuffer :25μ 1，引物1μ 1，引物1μ 1，模板 RNA 為3μ 1，無(wú) RNase 水18μ 1。擴(kuò)增條件為50°C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C IOmin, 28個(gè)循環(huán)。(3)EV71亞克隆的構(gòu)建將上述步驟(2)中獲得的DNA片段F1、F2、F3、F4和載體pUC19(購(gòu)自美國(guó)ftOgema 公司)分別用)(bal (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)酶切。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切的產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測(cè)定DNA的濃度，并電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)^ffiB公司)分別連接經(jīng)過(guò)酶切的F1、F2、F3、F4和pUC19，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (購(gòu)自美國(guó)Progenia公司)， 挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為10Xbuffer :2 μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物: 0. 2μ 1，引物0. 2 μ 1，模板0. 2μ l，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴(kuò)增條件為-MV 2min， 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽(yáng)性的克
隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1、pUC19-F2、pUC19_F3 和 pUC19-F4。鑒定PUC19-F1所用的引物為片段Fl的引物為SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6 ；鑒定pUC19-F2所用的引物為片段F2的引物為SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8 ；鑒定pUC19-F3所用的引物為片段F3的引物為SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10;鑒定pUC19-F4所用的引物為片段F4的引物為SEQ ID N0:11和SEQ IDNO :12。(4)含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建EV71部分基因(F1-F2)的拼接用BsiwI (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII酶切 (前面已述)上述步驟(3)中得到的PUC19-F1和pUC19-F2，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-Fl的大片段和pUC19_F2的小片段， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定，PCR的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGTCATTGGGACAGTAGCAGGC-3，) 0· 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTCTGCGTCAGTGAAGCCTGTT-3，):0. 2 μ 1，模板:0. 2 μ IJaq 酶: 0. 2μ 1，水:16. 8μ 1。擴(kuò)增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72 °C 3min，72°C IOmin, 16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2。EV71部分基因(F3-F4)的拼接用SpeI (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和HindIII (前面已述)酶切上述步驟3中得到的pUC19-F3和pUC19-F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19-F3的大片段和pUC19_F4的小片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101 (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系均為 IOXbuffer :2μ 1，dNTP 0. 4μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTT ΤΤ-3，) 0. 2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板0. 2μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴(kuò)增條件為94 °C 2min，94°C 30s, 55 °C 40s, 72°C 3min,72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4。EV71全長(zhǎng)基因(F1-F2-F3-F4)的拼接用AatII (購(gòu)自美國(guó)NEB公司)和 HindiII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2和pUC19_F3_F4，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收PUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000(前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接pUC19_Fl_F2的大片段和 PUC19-F3-F4的大片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR10/12 頁(yè)
鑒定。PCR 的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ l，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATG GCAGACAAGGTTTT-3，)0. 2 μ 1，引物(5，-CTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，Taq 酶0. 2 μ 1，水16. 8μ 1。擴(kuò)增條件為=94 °C 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C循環(huán)。將 PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培
養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2-F3-F4。拼接的全基因插入pACYC177 用)(bal (前面已述)和HindIII (前面已述)酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177(購(gòu)自美國(guó)NEB公司)，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收經(jīng)過(guò)酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過(guò)酶切的pACYC177，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后使用T4DNA連接酶(前面已述)連接經(jīng)過(guò)酶切的產(chǎn)物， 并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取克隆并進(jìn)行PCR鑒定PCR的反應(yīng)體系均為10 Xbuffer :2μ 1，dNTP :0. 4 μ 1，引物(5，-CTAGTCTAGAGCAATGGCAGACAAGGTTTT-3， ):0.2 μ 1，引物(5，-CTAG AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，) 0.2μ 1，Taq 酶 0. 2μ 1，模板:0. 2 μ 1，水16. 8 μ 1。擴(kuò)增條件為-MV 2min，94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 3min, 72°C 10min,16°C IOminJSf循環(huán)。將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL。(5)帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建為了獲得IUuc基因片段，使用I^rimeSTAR HS酶(購(gòu)自Takara公司)，使用引物特異引物擴(kuò)增Rluc基因片段，序列如SEQ ID NO 14所示，擴(kuò)增Rluc的引物為SEQ ID NO 15-16。使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片斷，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定DNA的濃度，使用濃度為1 % (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆?。SEQ ID NO: 155' -ACATGCATGCATGGCTTCCAAGGTGTACGACC-3'SEQ ID NO :165' -CGACGCGTCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC-3'PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系均為5XPS buffer :10μ l，dNTP :4μ 1，引物0. 5μ 1， 引物0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶0. 5 μ 1，水34 μ 1。擴(kuò)增條件為:98°C 30s， 94°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，72°C IOmin, 16°C 10min，30 個(gè)循環(huán)。將獲得的Rluc基因片段和pACYC177-EV71-FL分別為用SphI和MluI酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過(guò)酶切的mUC基因片段和PACYC177-EV71-FL，使用濃度為 1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的產(chǎn)DNA 片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pACYC177-EV71-Rluc-FL。實(shí)施例2 帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆制備EV71病毒的能力，其步驟是(1)質(zhì)粒的線性化取10μ g質(zhì)粒pACYC177-EV71-Rluc_FL，用XbaI(前面已述)酶切，然后向酶切產(chǎn)物中加入100 μ 1飽和酚(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，混勻，17000g離心5min，吸取上層液體于新的離心管中，并向原離心管中加入100 μ 1無(wú)菌水混勻，17000g 離心5min ；吸取上層液體與上一步所得液體合并(總體積約200 μ 1)，加入200 μ 1氯仿(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)混勻，17000g離心5min ；吸取上層液體于無(wú)菌進(jìn)口離心管管中 (約100μ 1)，加入10μ 1的pH5.2，3mol/l醋酸鈉(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)和250 μ 1 體積無(wú)水乙醇(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)混勻，-20°C放置30min，17000g離心5min ； 吸棄上清，加入Iml 70% (ν/ν)乙醇洗滌，17000g離心5min，吸棄上清；室溫放置5min，最后加入11 μ 1無(wú)RNAase的水溶解，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述) 測(cè)定DNA的濃度，使用1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，于_20°C保存?zhèn)溆谩?2) RNA 的體外轉(zhuǎn)錄取 2 μ g 經(jīng)過(guò) XbaI 酶切的 pACYC177-EV71-Rluc_FL，按照 mMACHINE T7 Kit (購(gòu)自美國(guó)Ambion公司)說(shuō)明書(shū)的要求將其體外轉(zhuǎn)錄為RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 (前面已述)測(cè)定RNA的濃度，使用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，于_20°C保存?zhèn)溆谩?3)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞將5 μ g體外轉(zhuǎn)錄的pACYC177-EV71-Rluc_FL的RNA采用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞，然后接種3 X IO5轉(zhuǎn)染了 RNA的Vero細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在轉(zhuǎn)染后2、6、14、16、18、20、22、24、48和60h使用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)，同時(shí)設(shè)置一組轉(zhuǎn)染時(shí)不含RNA的對(duì)照組。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后60h，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，而此時(shí)對(duì)照組的細(xì)胞沒(méi)有觀察到細(xì)胞病變(圖2)，表明帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆具有拯救病毒的能力。同時(shí)分別在轉(zhuǎn)染后2、6、14、16、18、20、22、對(duì)和4811收集孔中培養(yǎng)基(即PO代不同時(shí)間點(diǎn)的病毒液)，并于_80°C保存，每次收集病毒完畢后分別向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ 1細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ 1 于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求使用多功能讀板儀(購(gòu)自德國(guó)Thermo)檢測(cè)IUuc的活性(圖3)。IUuc的活性表明了帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆已經(jīng)產(chǎn)生了病毒。實(shí)施例3 帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆具有產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶IUuc基因的 EV71的能力，其步驟是在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種1. 5 X IO5Vero細(xì)胞，待匯合度達(dá)到60-70%時(shí)分別用轉(zhuǎn)染 pACYC177-EV71-Rluc-FL 的 RNA 進(jìn)入 Vero 細(xì)胞后于 2、6、14、16、18、20、22 和 24h 的 PO 代病毒感染Vero細(xì)胞，37°C、5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，然后分別向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ 1細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，分別混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ 1于白色96孔板中，并加入100 μ 1的底物，按照Luciferase Assay System說(shuō)明書(shū)的要求使用多功能讀板儀檢測(cè)IUuc的活性(圖4)。IUuc的活性表明帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆產(chǎn)生的PO代病毒具有感染Vero細(xì)胞的能力，同時(shí)也表明帶有IUuc 標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆產(chǎn)生的病毒具有穩(wěn)定攜帶IUuc基因的能力。因此，本發(fā)明構(gòu)建的帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆具有產(chǎn)生穩(wěn)定攜帶IUuc基因的EV71的能力。實(shí)施例4 帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆制備的病毒與親代病毒的生物學(xué)特性，其步驟是在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種4X IO5Vero細(xì)胞，待匯合度達(dá)到80-90 %，吸棄孔中的培養(yǎng)基，接入用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的轉(zhuǎn)染
14后60h的病毒100 μ 1 (包括pACYC-EV71-FL的PO代病毒(實(shí)驗(yàn)室制備與保存)和 pACYC177-EV71-Rluc-FL的PO代病毒)，37°C吸附Ih ；吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄， 加入新鮮的37°C預(yù)熱的覆蓋物，其成份為2% (v/v)FBS，IXDMEM培養(yǎng)基，2% (w/v)的甲基纖維素。于37°C、5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；待噬斑形成后用含有(w/v)結(jié)晶紫和結(jié)晶紫和3. 7% (ν/ν)甲醛的染色液染色，室溫，30min后；將孔中的瓊脂取出，并用流水沖洗孔底，于50°C，5min，可見(jiàn)空斑(圖5)。結(jié)果顯示拯救的病毒與pACYC_EV71_FL產(chǎn)生的病毒在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生的空斑形態(tài)相似。實(shí)驗(yàn)初步表明pACYC177-EV71-IUuC-FL拯救的PO代病毒與pACYC-EV71-FL拯救的PO代病毒具有相似的生物學(xué)特性。實(shí)施例5 帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒藥物篩選中的應(yīng)用(1)鹽酸胍對(duì)Vero細(xì)胞的毒性分析，其步驟是在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種 2X IO4Vero細(xì)胞，在37°C，5% (v/v) CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到90% ；吸棄每個(gè)孔中的 DMEM培養(yǎng)基，向各個(gè)孔中加入100 μ 1用含2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1、2、4、8、16、32 和 64mM)的鹽酸胍，對(duì)照孔加 100 μ 1 含 2% (ν/ν)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加MTT溶液10 μ 1，在37°C，5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4h，然后加入溶解液，在37°C，5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4h，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)i^rmazan全部溶解；在570nm測(cè)定吸光值(圖 6)，計(jì)算細(xì)胞存活率達(dá)到90 %以上時(shí)的鹽酸胍的最大使用濃度，以該最大濃度作為鹽酸胍對(duì)EV71的抑制實(shí)驗(yàn)中的最大使用濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)鹽酸胍的濃度不大于2mM時(shí)，Vero 細(xì)胞的存活率不低于90%，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，鹽酸胍的使用濃度為0、0. 0625,0. 125、 0.25,0. 5、1 和 2mM ；(2)帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒藥物篩選中的應(yīng)用鹽酸胍對(duì)攜帶IUuc基因的EV71的抑制作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4Vero細(xì)胞，在37°C， 5% (v/v)CO2培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到90%時(shí)，分別向每孔加入pACYC177-EV71-Rluc-FL 轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后60h收集并保存于_80°C的病毒液，感染復(fù)數(shù)為1，37°C吸附Ih ；吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的鹽酸胍(濃度分別為0,0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1和2mM) 100 μ 1 (已經(jīng)報(bào)道對(duì)EV71具有抑制作用)，于37°C，5% (v/v) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。通過(guò)對(duì)IUuc的活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著GuHCL濃度的增加，Rluc的活性逐漸減弱，表明GuHCL與EV71的抑制關(guān)系呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)GuHCL的濃度為ImM時(shí)，能完全抑制IUuc的活性(圖7)。本實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所有構(gòu)建的pACYC177-EV71-IUuc-FL能夠用于抗EV71的藥物篩選研究。最后，還需要注意的是，上述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法， 并且以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法，其步驟是(1)總RNA的提取取140ul的EV71病毒液，按照QIAamp Viral RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求抽提EV71的RNA ；(2)EV71的 RT-PCR 擴(kuò)增根據(jù)EV71基因的特性，將該基因分為了四個(gè)部分，分別命名為F1、F2、F3和F4，以步驟 ⑴中的總RNA為模版，采用RT-PCR分別獲得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列為SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 所示，DNA 片段 Fl 的引物SEQ ID NO: 5 禾口 SEQ ID NO :6，DNA 片段 F2 的引物SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8，DNA 片段 F3 的引物 SEQ IDNO :9 禾口 SEQ ID NO : 10，DNA 片段 F4 的引物SEQ ID NO :11 禾口 SEQ ID NO :12。另外 SEQ ID NO 5含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列SEQ ID NO :13 ；RT-PCR 的反應(yīng)體系均為PrimeScript 1 Step Enzyme Mix :2μ 1, 2 X IStepBuffer 25 μ 1，引物1 μ 1，引物1μ 1，模板RNA為3μ 1，無(wú)RNase水18μ 1 ；擴(kuò)增條件為 500C 30min，94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，72°C IOmin, 16°C 10min，28 個(gè)循環(huán)；(3)EV71亞克隆的構(gòu)建將步驟O)中獲得的片段F1、F2、F3、F4分別和載體pUC19連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為 pUC19-Fl、pUC19-F2、pUC19-F3 和 pUC19_F4 ；(4)含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建用BsiwI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19_Fl和pUC19_F2，回收pUC19_Fl的大片段和PUC19-F2的小片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F1-F2 ；用SpeI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19_F3和pUC19_F4，回收pUC19_F3的大片段和PUC19-F4的小片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PUC19-F3-F4 ；用 AatII 和 HindIII 酶切 pUC19_Fl_F2 和 pUC19_F3_F4，回收 pUC19_Fl_F2 的大片段和PUC19-F3-F4的大片段的大片段，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為 PUC19-F1-F2-F3-F4 ；用^CbaI和HindIII酶切pUC19-Fl-F2-F3-F4和pACYC177，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過(guò)酶切的PUC19-F1-F2-F3-F4和經(jīng)過(guò)酶切的pACYC177，使用濃度為1 % (w/v) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的DNA，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為PACYC-EV71-FL ；(5)帶有IUuc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建為了獲得IUuc基因片段，基因序列為SEQ ID NO 14所示，設(shè)計(jì)引物SEQ IDNO=I5,SEQID NO 16擴(kuò)增Rluc基因片段；將獲得的IUuc基因片段和步驟(4)中的pACYC177-EV71-FL分別為用SphI和MluI酶切，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經(jīng)過(guò)酶切的mUC基因片段和pACYC177-EV71-FL，使用濃度為(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后使用T4DNA連接酶連接經(jīng)過(guò)回收的產(chǎn)DNA片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101，將PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pACYC177-EV71-muc-FL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法，其特征在于所述的EV71病毒5’端非編碼區(qū)上游區(qū)域插入了 T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列為SEQ ID NO 13所示。
3.權(quán)利要求1所述的一種帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆在制備病毒的能力中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71型全長(zhǎng)感染性克隆在篩選抗EV71 病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的制備方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其步驟是(1)總RNA的提取；(2)EV71的RT-PCR擴(kuò)增；(3)EV71亞克隆的構(gòu)建；(4)含有EV71基因的重組克隆的構(gòu)建(5)帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建。通過(guò)細(xì)胞病變、Rluc活性的檢測(cè)、病毒蝕斑和藥物抑制等實(shí)驗(yàn)證明成功獲得帶有標(biāo)簽的EV71全長(zhǎng)感染性克隆。本發(fā)明在動(dòng)物模型、病毒復(fù)制與致病機(jī)理、藥物篩選和藥物作用機(jī)制、疫苗和診斷試劑的研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102559754SQ20111044437
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者史佩勇, 商寶娣, 張波, 袁志明, 許文波, 賈凡, 鄧成林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所