專利名稱：一種具有自生固氮能力的不動桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有自生固氮能力的不動桿菌，該不動桿菌用紫外線-等離子體復(fù)合誘變獲得，具有抗重金屬生長的能力，可用于土壤重金屬污染環(huán)境治理，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
重金屬污染是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染，主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉等人為因素所致。近年來，隨著人口的增長、工業(yè)的快速發(fā)展、化肥與農(nóng)藥等的大量使用，使得土壤重金屬污染日益加劇。Cd是一種毒性很大的重金屬，震驚世界的日本“痛痛病”就是因鎘污染而致。鎘會取代骨中的鈣，使骨骼軟化，骨頭寸斷；鎘還會引起胃腸功能失調(diào)，干擾人體和生物體內(nèi)鋅的酶系統(tǒng)，導(dǎo)致高血壓。鎘對人體組織和器官的毒害是多方面的，且治療極為困難。因此，各國對工業(yè)排放“三廢”中的鎘都作了極嚴(yán)格的規(guī)定。日本規(guī)定大米含鎘超過I毫克/公斤即為“鎘米”，禁止食用。日本環(huán)境廳規(guī)定0.3ppm為大米中鎘濃度的最高正常含量。目前，用于土壤重金屬污染修復(fù)的技術(shù)主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)法。物理修復(fù)法處理效果較好，但是工程量大，成本高?；瘜W(xué)修復(fù)法主要包括化學(xué)改良、表面活性劑清洗和有機質(zhì)改良等方法。其優(yōu)點是操作簡單，成本較低，缺點是沒有從根本上除掉重金屬，而且加入的改良劑具有二次污染的風(fēng)險。生物修復(fù)包括動物修復(fù)、植物修復(fù)、微生物修復(fù)和微生物與植物聯(lián)合修復(fù)等。植物提取是目前研究最多的修復(fù)方法，該法是利用超累積重金屬的植物吸收土壤中的重金屬離子，將重金屬離子大量富集在植物的地上部分，通過收割或拔除植物的地上部分減少和去除土壤重金屬。已報導(dǎo)的超累積植物有遏藍(lán)菜屬、燕麥草、印度芥菜、油菜、紫花苜蓿、紫穗槐等，目前主要用于去除污染土壤中的Pb、cd等。該法的優(yōu)點是修復(fù)徹底，沒有二次污染，缺點是大部分超累積植物存在生長緩慢、生物量小、重金屬累積量不高，修復(fù)時間較長等缺點。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)法是近幾年來國內(nèi)外研究較多的一種新的修復(fù)方法，該方法是利用微生物強化超累積植物修復(fù)的效率，徹底去除污染土壤中的重金屬。在土壤-微生物-植物共生環(huán)境中，微生物能夠?qū)⑼寥乐杏袡C質(zhì)和植物根系的分泌物轉(zhuǎn)化為小分子供自身利用，同時，微生物在自身代謝過程中產(chǎn)生的鐵載體、n引哚乙酸(IAA)、草酸等有機酸能夠活化土壤中的重金屬，使重金屬的有效態(tài)增加，而且微生物還有很強的氧化還原能力，可對鐵、錳氧化物進行還原，釋放出重金屬，從而提高超累積植物對重金屬的富集和轉(zhuǎn)運。除此之外，微生物還可合成IAA、鐵載體，ACC脫氨酶以及固氮、解磷和解鉀等作用促進植物生長，增加植物生長量，從而加速重金屬的去除。如Whiting等人將表面消毒的遏蘭菜種子接入滅菌的含重金屬Zn的土壤中，再接入具有Zn抗性的細(xì)菌，結(jié)果接入細(xì)菌的植物地上部分累積重金屬Zn的量是不接細(xì)菌的植物的2倍，地上部分和根中累積的總的Zn量，接入細(xì)菌的為不接入細(xì)菌植物累積量的4倍。氮素是作物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一，對作物最終產(chǎn)量的貢獻(xiàn)為40%-50%。高濃度的重金屬可使植物喪失根瘤結(jié)節(jié)能力，從而完全抑制土壤中的共生固氮過程，易造成植物缺氮。如果單純依靠施氮肥，不僅不經(jīng)濟，而且容易造成土壤板結(jié)，氮肥的過量施用會造成地下水亞硝酸鹽的污染和江河湖泊的富營養(yǎng)化。自生固氮菌劑可以固定空氣中的氮氣，將氮氣轉(zhuǎn)變成銨態(tài)氮，與根瘤菌相比使用范圍較廣，生產(chǎn)和使用都較為方便。但是，大部分野生的固氮菌都存在生長緩慢、抗重金屬生長和固氮能力較低的缺點，不能滿足污染土壤修復(fù)的需要。為此，采用種種方法來打破菌種的正常代謝，使之產(chǎn)生所需要的目標(biāo)代謝產(chǎn)物(如蛋白酶)、提高其抗性能力等，要達(dá)到此目的，主要措施就是需要進行菌種的選育，如進行物理和化學(xué)誘變等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過紫外線-等離子體復(fù)合誘變獲得一株可用于土壤重金屬污染環(huán)境治理的具有自生固氮能力和抗重金屬生長能力的不動桿菌。本發(fā)明的目的之二是提供含有上述不動桿菌的微生物菌劑及其制備方法；
本發(fā)明的目的之三是提供上述不動桿菌在土壤重金屬污染環(huán)境治理和土壤生態(tài)修復(fù)
中的應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)過程如下
一種具有自生固氮能力的不動桿菌，其分類命名為不動桿菌sp.)Ymu7-3,已于2011年6月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.5006。YMU7-3在培養(yǎng)基A上菌落呈黃色，圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，G_，好氧或兼性厭氧，呈長桿狀，其最適的生長溫度28 32°C，最適的pH值為6. (T8.0;其固氮能力在0. 43 0. 68nmol IO7CfiT1 IT1，解無機磷能力分別為236mg/l ;其產(chǎn)卩引哚乙酸(IAA)的能力為33. 25^45. 62 u g/ml ;產(chǎn)鐵載體的能力(A/Ar)為0. 206^0. 63 ;其ACC脫氨酶活性大小為 0. 468 0. 712u mol/ mg/h。所述培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4 7H200. 005-0. Olg, Na2MoO4 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2。本發(fā)明提供的具有自生固氮能力的不動桿菌通過誘變選育方法獲得，包括以下步驟
1)以實驗室從植物根際篩選的自生固氮菌不動桿菌YSGD07作為出發(fā)菌株；
2)誘變選育
(1)制備出發(fā)菌株YS⑶07的單細(xì)胞懸液
將出發(fā)菌株YS⑶07接種于液體培養(yǎng)基A中，28-32。0，120-150卬111培養(yǎng)12-16hrs,離心，用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩，使其分散成單細(xì)胞的菌懸液；
所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，F(xiàn)eSO4 7H200. 005-0. Olg, Na2MoO4 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
(2)紫外線誘變
將步驟(I)所得的菌懸液分別調(diào)節(jié)濃度至105-107CFU/ml，取0. Iml涂布于含400-800mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，進行紫外誘變，紫外誘變的頻率為10-18W，照射距離為25-50cm，照射時間5-10min ;28_32°C靜置培養(yǎng)5-7days，挑選25-30個較大的單菌落，進行搖瓶復(fù)篩，用乙炔還原法測定各菌株的固氮酶活性，選擇5-8株固氮酶活性最高的菌株，再分別作搖瓶復(fù)篩，選出一株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株YSGD07-Z，制成菌懸液用于下一步等離子體的誘變；
所述的無氮固體培養(yǎng)基B組分為葡萄糖10-20g，KH2P04 0. 2g,MgSO4 *7H20 0. 1-0. 2g,NaCl 0. 2g, CaSO4 2H20 0. 2g, CaCO3 5g, CdCl2 0. 080-0. 32g，瓊脂 15_18g，蒸餾水1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
所述的搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的步驟是首先對上述分離得到的25-30個接種到IOOml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)8-12hrs。取5ml菌液接種到裝有IOOml液體培養(yǎng)基C的250ml的錐形瓶中，28°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)48hrs后，將棉塞換成橡膠塞，封口膜滴蠟密封，注射器抽取10-15%的空氣，注入10-15%的乙炔氣體，繼續(xù)反應(yīng)，用乙炔還原法測定固氮酶活性；
所述的液體培養(yǎng)基C組分為葡萄糖10-20 g，KH2PO4 0. 2-0. 41 g, K2HPO4 0.3-0.52g, CaCl2 0. 1-0. 2 g, MgSO4 7H20 0. 1-0. 2 g，F(xiàn)eSO4 7H20 0. 005-0. Olg, Na2MoO4 2H200. 0025-0. 005 g,蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
(3)等離子體誘變
將步驟(2)所得的YS⑶07-Z菌株，制成105-107CFU/ml的菌懸液，取0. 1-0. 2ml均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上電極的位置，使得上下電極之間的距離控制在3-8_左右，調(diào)節(jié)電壓為3-5V，電流為0. 5-0. 8A，使空氣或氬氣放電，得到均勻的空氣或氬氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電時間為2-7min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，涂布于含400-800mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，再進行搖瓶復(fù)篩，挑出一株固氮酶活性最高的一株菌YSGD07-Z3，制成菌懸液用于下一步的誘變；所述的搖瓶復(fù)篩的方法同步驟(2);
(4)將步驟(3)所得的YS⑶07-Z3菌懸液活菌數(shù)調(diào)至105-107CFU/ml，循環(huán)重復(fù)紫外線誘變一等離子體誘變1-2次，最后得到一株耐受重金屬Cd且固氮酶活性最高的菌株Ymu7-3。不動桿菌sp. ) Ymu7_3與不動桿菌具有高度同源性,菌種鑒定的結(jié)果如下
GGGGGGGGGGGGCTTACCATGCAGTCGACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAA
CATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGG
GGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGA
GAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT
GGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGAT
AATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGT
TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAAC
、TGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATT
CGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG
GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCT
AACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC
GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGGAG
ACATTGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGTTTAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCAGCATTTAGTTTGGCACTCTAGGGGACTGCCGTGATAGCCG
GAGAGGAAGGTGGGGATGACGTTCAGTCTCATGGCCTTTACCGGCCTGGGCTACCACGTGCTACAATGGTGGTGAAC
GTGGCAGTAAACAGCGATTGTCAGCTATTCTCAGCATTCAGTCGATGTACTTTGCATCTGAGTGGo本發(fā)明還提供一種高效固氮菌劑，根據(jù)營養(yǎng)物載體不同可以為液體菌劑或固體菌劑。 菌劑的制備包括以下步驟
D菌種發(fā)酵
①一級三角瓶液體培養(yǎng)
將凍存的Ymu7-3在37°C條件下快速解凍，按照0. 5-1%的接種量接入裝有液體培養(yǎng)基A的三角瓶中，28-32°C，振蕩培養(yǎng)15-20hrs ；
所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，F(xiàn)eSO4 7H200. 005-0. Olg, Na2MoO4 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
②二級發(fā)酵罐發(fā)酵
1)將Ymu7-3的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量分別接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基E的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，培養(yǎng)pH7-8，通氣培養(yǎng)20-30 hrs ；
所述的培養(yǎng)基E組成為蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆柏20-30g，KH2PO4 0. 2-0. 41g, K2HPO4 0. 3-0. 52 g, CaCl2 0. 1-0. 2 g, MgSO4 7H20 0. 1-0. 2 g，Na2MoO4 2H20
0.0025-0. 005 g,水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
2)將秸桿粉、草炭土、稻糠用高速粉碎機粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量百分比為50-70:20-30:10-20的比例均勻混合，再加入一定濃度的鑰酸鈉和硫酸亞鐵，其中鑰酸鈉為0. 2 0. 5g/Kg，硫酸亞鐵為0. 05 0. 08g/Kg ；
3)將步驟I)中得到的Ymu7-3發(fā)酵液打入儲液罐即得液態(tài)高效固氮菌劑，將發(fā)酵液按照50-100ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28-32°C發(fā)酵5_7days，即得到固體菌劑。本發(fā)明提供的高效自生固氮菌劑液體菌劑可用于超累積植物浸種、移栽時浸根、育苗期或生長期灌根時按比例加入，在植物浸種時以50-200倍的稀釋液浸泡種子或植物根部2-5hrs，育苗期或生長期灌根采用20-40ml/Kg 土壤的劑量澆灌稀釋液，整個生長期灌根1-3次；固態(tài)菌劑可作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-20g/Kg 土壤，土壤中Cd的去除率比對照組增加了 50. 4-178. 7%。本發(fā)明的優(yōu)點與有益效果
1)采用等離子體誘變和紫外誘變多次循環(huán)處理的方法，保證了突變菌株的穩(wěn)定性；
2)提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能夠抗較高濃度的Cd生長，能夠分泌吲哚乙酸、產(chǎn)生鐵原子，具有ACC脫胺酶活性等，傳代14次遺傳性狀穩(wěn)定。能夠促進超累積植物的生長，提高超累積植物的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)；
3)本發(fā)明的菌劑營養(yǎng)要求簡單、易培養(yǎng)、生長周期短、能夠進行規(guī)?；拇笊a(chǎn)；
4)本發(fā)明的菌劑可以明顯促進超累積植物的生長，增加超累集植物的生物量，極大地提高超累積植物的重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)，又能改善土壤生態(tài)環(huán)境，環(huán)境友好且成本低廉；
5)為開發(fā)利用植物根際促生菌強化土壤中重金屬的快速去除提供了新途徑，對重金屬污染環(huán)境的治理和生態(tài)修復(fù)具有重要的意義。


圖I為Ymu7_3平板照片和掃描電鏡照片；
圖2為Ymu7-3產(chǎn)生鐵離子定性實驗照片；
圖3為Ymu7-3傳代穩(wěn)定性；
圖4為Ymu7-3在含Cd2+液體培養(yǎng)基A中的生長情況； 圖5為印度芥菜在含Cd 土壤中的生物量(干重)；
圖6為印度芥菜地上部分累積Cd的含量；
圖7為印度芥菜對Cd的去除率；
圖8為紫花苜蓿在含Cd 土壤中的生物量；
圖9為紫花苜蓿地上部分累積Cd的含量；
圖10為紫花苜蓿對Cd的去除率；
圖11為油菜在含Cd 土壤中的生物量；
圖12為油菜地上部分累積Cd的含量；
圖13為油菜對Cd的去除率。
具體實施例方式實施例I
按照本發(fā)明提供的固氮菌株的篩選方法，選育能夠耐受重金屬鎘的固氮酶活性高的固氮菌株，制備的步驟如下
1)以實驗室從植物根際篩選的自生固氮菌不動桿菌YSGD07作為出發(fā)菌株；
2)誘變選育
(I)制備出發(fā)菌株YS⑶07的單細(xì)胞懸液
將出發(fā)菌株YS⑶07接種于液體培養(yǎng)基A中，28°C，150rpm培養(yǎng)16hrs，離心，用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩，使其分散成單細(xì)胞的菌懸液；
所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉10g，NaCl 5g，蛋白胨10g，F(xiàn)eSO4 7H20 0. 005g,Na2MoO4 2H20 0. 0025g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2。(2)紫外線誘變
將步驟(I)所得的菌懸液調(diào)節(jié)濃度至105CFU/ml之間，取0. Iml涂布于含600mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，進行紫外誘變，紫外誘變的頻率為18W，照射距離為25cm，照射時間5min;28°C靜置培養(yǎng)5days，挑選25個較大的菌落，進行搖瓶復(fù)篩，用乙炔還原法測定各菌株的固氮酶活性，共選擇出8株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成菌懸液用于下一步等離子體的誘變；
所述的無氮固體培養(yǎng)基B所含組分為葡萄糖20g, KH2PO4 0. 41g，MgSO4 7H20 0. 2g,NaCl 0. 2g, CaSO4 2H20 0. 2g, CaCO3 5g, CdCl2 0.32g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000ml，p H
7.0 7. 2
所述的搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的步驟是首先對上述分離得到的50株自生固氮菌接種到IOOml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)12hrs。各取5ml菌液接種到裝有IOOml液體培養(yǎng)基C的250ml的錐形瓶中，28°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)48hrs后，將棉塞換成橡膠塞，封口膜滴蠟密封，注射器抽取10的空氣，注入10的乙炔氣體，繼續(xù)反應(yīng)，用乙炔還原法測定固氮酶活性；
所述的液體培養(yǎng)基C所含組分為葡萄糖20 g，KH2PO4 0.41 g, K2HPO4 0. 52g, CaCl20.2 g, MgSO4 *7H20 0. I g ,FeSO4 *7H20 0. 005,Na2MoO4 *2H20 0.0025 g,蒸餾水 1000ml，p H 7. 0 7. 2。(3)等離子體誘變
將上述選擇的8株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成105CFU/ml的菌懸液，取0. Iml均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上下電極之間的距離為3mm，電壓為3V，電流為0. 5A，利用空氣放電，得到均勻的空氣介質(zhì)阻擋放電等離子 體，放電時間為3min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，涂布于含600mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，再進行搖瓶復(fù)篩，得到5株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成菌懸液用于下一步的誘變。(4)循環(huán)重復(fù)紫外線誘變和等離子體誘變1-2次，最后得到一株耐受重金屬Cd且固氮酶活性高的菌株YMU7-3。
表I野生自生固氮菌與誘變菌株固氮酶活性
菌株編號菌株來源固氣酶活性(nmol_ I O7CfLr1-Ir1)
YSGD 07野生自生畫氮菌 Q. 3 5±0,07
Ymu7-3YSGD07 的誘變株 0.68±0.05圖I為Ymu7_3平板照片和掃描電鏡照片，圖2為Ymu7_3產(chǎn)生鐵離子定性實驗照片，圖3為Ymu7-3傳代穩(wěn)定性，表I為野生自生固氮菌與誘變菌株固氮酶活性對比。實施例2
按照本發(fā)明提供的制備固氮菌劑的方法，制備能夠耐受重金屬鎘的固氮酶活性高的固氮菌劑，制備的步驟如下
菌劑的制備包括以下步驟
I、菌種發(fā)酵
①一級三角瓶液體培養(yǎng)
將凍存的Ymu7-3在37 °C條件下快速解凍，按照0. 5%的接種量接入裝有液體培養(yǎng)基A的三角瓶中，28°C，150rpm振蕩培養(yǎng)18hrs ；
所述的液體培養(yǎng)基A組成為所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉10g，NaCl 5g，蛋白胨10g, FeSO4 7H20 0. 005g, Na2MoO4 2H20 0. 0025g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2
②二級發(fā)酵罐發(fā)酵
1)將Ymu7-3的一級培養(yǎng)液按照5%的接種量接入裝有液體培養(yǎng)基E的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28°C，培養(yǎng)pH7-8，通氣培養(yǎng)28 hrs ；
所述的液體培養(yǎng)基E組成為蔗糖10g，淀粉3g，豆柏30g，KH2P04 0 . 41 g, K2HPO4 0. 52g, CaCl2 0. 2 g, MgSO4 7H20 0. 2 g，Na2MoO4 2H20 0. 005 g,水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
2)將秸桿粉、草炭土、稻糠用高速粉碎機粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量百分比為5030 20的比例均勻混合，將鑰酸鈉和硫酸亞鐵溶解后按照鑰酸鈉為0. 3g/Kg硫酸亞鐵為0. 05g/Kg的劑量加入并充分混勻；
3)將步驟I)中得到的Ymu7-3發(fā)酵液直接打入儲液罐即得液態(tài)高效固氮菌劑，將得到的發(fā)酵液按照100ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28°C發(fā)酵5days。平板計數(shù)法計數(shù)固態(tài)菌劑中YMU7-3數(shù)量可以達(dá)到6. 2 X IO9-L IX 10nCFU/g。實施例3
使用實施例2菌劑在強化印度芥菜修復(fù)鎘污染土壤，其具體步驟為
盆栽土壤采自陜西省長安縣農(nóng)田土壤，供試土壤總Cd含量為0. 25mg/kg, 土壤設(shè)4個投加Cd2+水平，分別為0，20，40，80mg/kg，把相應(yīng)量的CdCl2配成溶液，使得供試土壤與重金屬反復(fù)混合均勻，靜置平衡30days。實驗分別設(shè)空白對照組、加尿素組和加菌劑組。出苗后，每盆保留3株.，將上述制備的液體菌劑按照I :100的比例稀釋稀釋，采用根灌的方法每盆澆50ml稀釋的菌液，每隔3周澆一次，不加菌的組澆同等劑量的死菌體，加尿素組尿素的濃度是0. 12g/L。植株生長50天后收獲，分別測定地上部干重，HNO3-HClO4消化，原子吸收光譜法測定各樣品中Cd濃度，計算不同處理的地上部吸Cd量和各處理的土壤凈化率。如圖4-7結(jié)果可見，加菌劑和加尿素均能夠促進印度芥菜的生長，加菌劑組印度芥菜的干重比對照組增加了 28. 4-71. 9%，而加尿素組比對照組增加了 2. 99-14. 6% ;加菌劑和加尿素均能夠促進印度芥菜地上部分對Cd2+的富集，加菌劑組印度芥菜累積的Cd2+量比對照組增加了 48. 4-66. 8%，而加尿素組比對照組僅增加了 3. 7-13. 6% ;加菌劑組印度芥菜對土壤中Cd2+的去除率比對照組增加了 98-178. 7%，而加尿素組僅比對照組增加了
8.06-30. 2%。因此，該菌劑能夠明顯的提高印度芥菜的生物量和對Cd2+的富集，加速土壤中Cd2+的去除。實施例4
使用本發(fā)明提供的固體菌劑用于強化紫花苜蓿修復(fù)鎘污染土壤，其具體步驟為
盆栽土壤與實施例3相同，土壤設(shè)3個投加Cd2+水平，分別為0，20，50mg/kg,實驗分別設(shè)空白對照組和加菌劑組。將固體菌劑與土壤按照15g/kg 土壤的用量加入土壤并充分混勻，種植紫花苜蓿，出苗后，每盆保留10株。植株生長45天后收獲，分別測定地上部干重，HNO3-HClO4消化，原子吸收光譜法測定各樣品中Cd濃度，計算不同處理的地上部的吸Cd量和各處理的土壤凈化率。如圖8-10結(jié)果可見，加菌劑能夠促進紫花苜蓿的生長，加菌劑組紫花苜蓿的干重比對照組增加了 24. 4-31. 3% ;菌劑能夠促進印度芥菜地上部分對Cd2+的富集，加菌劑組紫花苜蓿累積的Cd2+量比對照組增加了 49. 2. 4-57. 8% ;加菌劑組紫花苜蓿對土壤中Cd2+的凈化率比對照組增加了 88. 9-107%。實施例5
使用本發(fā)明提供的固體菌劑用于強化油菜修復(fù)鎘污染土壤，其具體步驟為 盆栽土壤與實施例3相同，土壤設(shè)3個投加Cd2+水平，分別為0、20、50mg/kg，實驗分別設(shè)空白對照組和加菌劑組。將油菜先在無Cd土壤中育苗，挑選長勢相同的油菜苗用上述I :50的液體菌劑稀釋液浸根，對照組用相同劑量的死菌液浸根，每盆移植3株。在生長三周后再用I :200的液體菌劑稀釋液灌根，對照組加入同劑量的死菌劑，其余條件與實施例三相同，植株生長45天后收獲，分別測定地上部的干重和各樣品中Cd濃度。
圖11-13結(jié)果可見，加菌劑能夠明顯促進油菜的生長，加菌劑油菜的干重比對照組增加了 15. 1-29. 4% ;加菌劑能夠促進油菜地上部分對Cd2+的富集，加菌劑組油菜累積的 Cd2+量比對照組增加了 27. 5-34. 5% ;加菌劑組油菜對土壤中Cd2+的凈化率比對照組增加了50. 4-72. 8%。
權(quán)利要求
1.一種具有自生固氮能力的不動桿菌，其分類命名為不動桿菌sp.)Ymu7-3,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5006。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有自生固氮能力的不動桿菌，其特征在于該菌株具有以下特性在固體培養(yǎng)基A上菌落呈黃色圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，G-,好氧或兼性厭氧，呈長桿狀，其最適的生長溫度28 32°C，最適的pH值為6. (Γ8. O ;其固氮能力在O. 43 O. 68nmol · IO7CfiT1 · IT1,解無機磷能力為236mg/l,產(chǎn)口引哚乙酸的能力為33. 25 45. 62 μ g/ml，產(chǎn)鐵載體的能力為O. 206 O. 63，ACC脫氨酶活性大小為O.468 O. 712 μ mol/ mg/h, 所述固體培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4 · 7H20O. 005-0. OlgjNa2MoO4 ·2Η20 O. 0025-0. 005 g，瓊脂粉 15_20g，蒸餾水 1000ml，ρ H 7· 0 7· 2。
3.含有權(quán)利要求I所述不動桿菌的微生物菌劑。
4.權(quán)利要求3所述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟 I)菌種發(fā)酵 ①一級三角瓶液體培養(yǎng) 將凍存的Ymu7-3在37°C條件下快速解凍，按照O. 5-1%的接種量接入裝有液體培養(yǎng)基A的三角瓶中，28-32°C，振蕩培養(yǎng)15-20hrs ； 所述的液體培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4 · 7H20O. 005-0. Olg, Na2MoO4 · 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7· 2 ； ②二級發(fā)酵罐發(fā)酵 1)將Ymu7-3的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量分別接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基E的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，pH 7-8，通氣培養(yǎng)20-30 hrs ； 所述的培養(yǎng)基E組成為蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆柏20-30g，KH2PO4 O. 2-0. 41g, K2HPO4 O. 3-0. 52 g, CaCl2 O. 1-0. 2 g, MgSO4 · 7H20 O. 1-0. 2 g，Na2MoO4 · 2H20O. 0025-0. 005 g,水 1000ml, pH 7. 0 7· 2 ； 2)將秸桿粉、草炭土、稻糠粉碎過60目篩，按照質(zhì)量百分比為50-70:20-30:10-20的比例均勻混合，再加入鑰酸鈉和硫酸亞鐵，其中鑰酸鈉為O. 2^0. 5g/Kg，硫酸亞鐵為O. 05 O. 08g/Kg ； 3)將步驟I)中得到的Ymu7-3發(fā)酵液打入儲液罐即得液態(tài)高效固氮菌劑，將發(fā)酵液按照50-100ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28-32°C發(fā)酵5_7天，即得到固體菌劑。
5.權(quán)利要求I所述不動桿菌在土壤重金屬污染環(huán)境治理中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于重金屬為鎘離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于使用方法為在植物浸種時以50-100倍的液體菌劑稀釋液浸泡種子或植物根部2-5hrs，育苗期或生長期灌根采用200-500倍的液體菌劑稀釋液10-40ml/Kg 土壤劑量澆灌稀釋液，整個生長期灌根1-3次；固態(tài)菌劑作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-30g/Kg 土壤。
8.權(quán)利要求I所述不動桿菌在土壤生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有自生固氮能力的不動桿菌，其分類命名為不動桿菌(Acinetobactersp.)Ymu7-3，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5006。本發(fā)明提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能夠抗較高濃度的Cd生長，能夠分泌吲哚乙酸，產(chǎn)生鐵原子；制備得到的微生物菌劑可以明顯促進超累積植物的生長，增加超累集植物的生物量，極大地提高超累積植物的重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)，又能改善土壤生態(tài)環(huán)境，環(huán)境友好且成本低廉。
文檔編號C12R1/01GK102634465SQ201110444519
公開日2012年8月15日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者朱曉麗, 梁麗華, 申燁華, 范代娣, 馬沛 申請人:西北大學(xué)