一種花生慢生根瘤菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種花生慢生根瘤菌YIC61059及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根瘤菌是一類無芽孢、能運(yùn)動、好氧、化能有機(jī)營養(yǎng)型的桿狀革蘭氏陰性細(xì)菌，大 小一般為0·5-0·9μηιΧ 1 ·2-3·0μηι，鞭毛周生、端生或側(cè)生。它廣泛分布于土壤中，可以在土 壤中以營養(yǎng)體形式生存，也可以侵染豆科植物根部或莖部形成根瘤或莖瘤，以類菌體形式 固定空氣中的氮?dú)庑纬砂保┒箍浦参镂绽?，形成共生固氮體系。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，合理 利用這一體系可以促進(jìn)增產(chǎn)，減少施用化肥的對環(huán)境造成的污染，有利于農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境 的發(fā)展。
[0003] 花生，又名落花生、萬壽果、長生果等，屬薔薇目，豆科一年生草本植物?；ㄉ哂?很高的經(jīng)濟(jì)價值，其果實(shí)含豐富的脂肪和蛋白質(zhì)，可直接食用，油一部分可以用于食用，另 外還可以供給工業(yè)和醫(yī)藥，油柏既可以用作飼料也可肥田，莖葉可以當(dāng)作燃料、慪制堆肥或 者充當(dāng)動物飼料。通過選育高效花生根瘤菌和施用根瘤菌劑，可以提高花生產(chǎn)量和品質(zhì)，增 加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入，減少化肥污染，維持生態(tài)平衡和人類可持續(xù)發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種花生慢生根瘤菌YIC61059及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0006] 一種花生慢生根瘤菌，慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp. )￥1061059，該菌株已于 2015年10月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址 為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），其保藏編號為CGMCC No. 11507。
[0007] 所述花生慢生根瘤菌從山東省萊西市花生研究所實(shí)驗基地花生新鮮根瘤中分離 篩選出，通過對其持家基因 recA基因序列與GenBank中的數(shù)據(jù)對比分析發(fā)現(xiàn)其與 Bradyrhizobium liaoningense 性最高，為98 · 3%。從而將分離出來的根瘤 菌YIC61059命名為Bradyrhizobium sp.YIC61059〇
[0008] 該菌的菌落為圓形，菌落濕潤，中間隆起，邊緣整齊，乳白色半透明，不產(chǎn)生芽孢， 能運(yùn)動，胞外多糖含量較高，經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果為陰性。
[0009] 根瘤菌的應(yīng)用，所述根瘤菌在促進(jìn)花生生長中的應(yīng)用。
[0010] 所述根瘤菌在促進(jìn)花生種植中作為產(chǎn)量增產(chǎn)劑的應(yīng)用。其，根瘤菌能提高花生根 瘤的固氮酶活性。
[0011] 具體，將所述慢生根瘤菌于TY液體培養(yǎng)基中28 °C，180rpm搖床震蕩培養(yǎng)2-3天，待 菌液0D600 2 1.0;將所得菌液直接噴灑在花生種子表面，而后將噴灑有菌液的花生種子直 接播種，即可使花生產(chǎn)量得以增長。
[0012] 所述TY液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨酵母提取物培養(yǎng)基），配方為:胰蛋白胨5g/L，酵母提 取物3g/L，無水CaCl2 Ο · 66g/L，加水定容至lOOOmL。
[0013]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0014]本發(fā)明的高效固氮花生根瘤菌YIC61059具有較強(qiáng)的共生固氮能力，能夠顯著促進(jìn) 花生根系生長，增強(qiáng)其光合作用，提高植株重量，增加果實(shí)產(chǎn)量，進(jìn)而提高了花生的產(chǎn)量和 品質(zhì)。實(shí)驗結(jié)果表明，接種本發(fā)明菌株的花生，與不接種任何菌的花生相比，單株花生的地 上部分鮮重、干重分別增加了 18.98%和24.48%。本發(fā)明根瘤菌對花生的生長安全，能夠與 花生建立有效的共生固氮體系，充分體現(xiàn)了生物固氮作用在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，減少了化 肥的施用帶來的土壤和環(huán)境污染。本發(fā)明根瘤菌的推廣和應(yīng)用對保護(hù)生態(tài)環(huán)境和推動綠色 農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的實(shí)踐價值。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例設(shè)計的田間小區(qū)實(shí)驗設(shè)計圖。
[0016] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的接種菌株YIC61059種植花生的田間小區(qū)試驗中促進(jìn)花 生主根和側(cè)根長度效果。
[0017] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的接種菌株YIC61059種植花生的田間小區(qū)試驗中促進(jìn)花 生單株果實(shí)鮮重和干重效果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0019] 本發(fā)明菌株生長速度快，共生固氮能力強(qiáng)，在溫室和大田環(huán)境下能夠顯著促進(jìn)花 生的生長，提高花生的產(chǎn)量;可用于制作高效根瘤菌劑，減少化肥使用造成的環(huán)境污染，實(shí) 現(xiàn)增產(chǎn)、節(jié)氮、生態(tài)的協(xié)調(diào)一致，因此本發(fā)明在花生種植業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景。
[0020] 1.花生根瘤菌的分離、純化和保存。
[0021] 從山東省萊西市花生研究所花生育種實(shí)驗基地選取植株健壯的花生，將大且飽滿 的根瘤摘下洗凈，用95%乙醇浸泡30s以消除表面張力，對根瘤表面進(jìn)行消毒后搗碎，將浸 出液涂布于裝有YMA固體培養(yǎng)基(甘露醇10g/L，酵母提取物3g/L，K 2HP〇4 0.25g/L，KH2P〇4 0.25g/L，MgS〇4 0.2g/L，CaC03 3g/L，NaCl 0.1g/L)的平板中，28°C倒置培養(yǎng)5-7天后挑取有 典型根瘤菌菌落形態(tài)（圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑、較濕潤、稍透明）的 菌落在TY平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次，將純化的單菌落經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，選出革蘭氏染 色陰性、細(xì)胞呈桿狀且形態(tài)一致的細(xì)菌作為純化的根瘤菌菌株。初篩后共分離出112株根瘤 菌。
[0022] 所述菌株短期保藏方式為，將純化的根瘤菌菌株接種至YMA固體斜面，待菌株長好 后保藏于4°C冰箱內(nèi)；長期保藏方式為:將純化的根瘤菌菌株培養(yǎng)至生長期的對數(shù)后期或穩(wěn) 定期，然后加入濃度為20%甘油中混勻，至_80°C冰箱中冷凍長期保存。
[0023]為了進(jìn)一步去除重復(fù)的根瘤菌，首先提取菌株的總DNA，然后使用持家基因 recA的 通用引物recA41F/recA640R對112株根瘤菌的持家基因 recA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析并最終得到12株花生根瘤菌。將獲得的12株菌株在花生上進(jìn)行常規(guī)的回接實(shí) 驗，以確定該菌種是否有結(jié)瘤能力，在實(shí)驗中使用的蛭石、花盆、澆灌用水、花生種子均進(jìn)行 了常規(guī)滅菌處理。
[0024] 經(jīng)過45天的觀察培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中7個菌株能與宿主花生有效結(jié)瘤，而接種其它5個 菌株的花生沒有結(jié)瘤。因此對上述7個菌株作了保藏，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。
[0025] 2高效共生固氮菌株盆栽篩選實(shí)驗
[0026] 將初篩得到的7個菌株進(jìn)行盆栽比較實(shí)驗。
[0027]實(shí)驗方法如下：
[0028]⑴菌種活化:將7株實(shí)驗菌株在斜面培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)48h后，接種到TY液體培養(yǎng) 基中，28°C，150r · mirT1轉(zhuǎn)速的搖床中震蕩培養(yǎng)48h，至0D600 2 1.0,收集菌液保藏至4°C冰 箱待用。
[0029] ⑵選擇顆粒飽滿、種皮完整的花生種子，表面消毒后置于恒溫箱內(nèi)發(fā)芽。待主根長 至Ij2cm左右時，轉(zhuǎn)移栽培到盛滿拌有低氮營養(yǎng)液的滅菌蛭石的花盆中培養(yǎng)。將lml用TY液體 培養(yǎng)基活化好的供試菌菌液(0D600 = 0.8~1.0)接種于幼苗的根部，用滅菌封口膜封住花 盆，僅割開為幼苗生長的縫隙。對照處理僅在幼苗根部噴入lml滅菌的TY液體培養(yǎng)基;每個 處理做5個重復(fù)，共計8組。將所有培育在花盆里