一種球形節(jié)桿菌及其產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種球形節(jié)桿菌A152菌株及其產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶。
【背景技術(shù)】
[0002]
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)，又名玻璃酸，是由重復(fù)單元[(1->3) β-D-N乙酰葡萄糖胺-(GIcNAc)-(1-M) β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA)]交替連接而成的一種鏈狀高分子聚合物，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，廣泛存在于皮膚、軟骨、關(guān)節(jié)、玻璃體等生物組織中，具有重要的生理學(xué)功能。根據(jù)其分子量不同可以分為高分子量透明質(zhì)酸(HMWHA )和低分子量透明質(zhì)酸(LMWHA )，HMWHA能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的迀移，抗血管生成活性，促進(jìn)人體傷口愈合;LMWHA促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化，抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨、內(nèi)皮等細(xì)胞的迀移，還具有抗炎的作用，HA以其獨(dú)特的理化性質(zhì)，在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究方面發(fā)揮了重要的作用。
[0003]透明質(zhì)酸酶又叫玻璃酸酶，是可使HA發(fā)生低分子化作用的糖苷酶，也能降解其他機(jī)體組織中的酸性粘多糖，其廣泛存在于真核生物和原核生物中，具有特異性的生理學(xué)活性。目前公認(rèn)的分類方法將透明質(zhì)酸酶分為三大類:(I)第一類是內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.35)，主要來源于脊椎動物以及某些生物的毒液。這類酶是水解酶和轉(zhuǎn)糖苷酶，通過作用于β_1，4糖苷鍵降解底物得到以四糖為主的終產(chǎn)物。(2)第二類是內(nèi)切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.36)，主要從水蛭的唾液腺和十二指腸蟲提取。該類酶是水解酶，主要作用域β_1，3糖苷鍵，可特異性降解ΗΑ，產(chǎn)生以四糖或己糖(還原端為葡萄糖醛酸)為主的終產(chǎn)物；(3)第三類為透明質(zhì)酸裂解酶(EC4.2.2.1)，主要是由梭菌屬、鏈球菌、鏈霉菌產(chǎn)生，作用于β_1，4糖苷鍵，通過β_消去機(jī)制進(jìn)行降解，降解HA后的終產(chǎn)物為4，5-不飽和雙糖。
[0004]據(jù)本發(fā)明人通過查閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，目前有報道來源于鏈霉菌(Streptomyces koganeiensis)的透明質(zhì)酸酶，分子量21.6kDa(專利號:CN 102439144 B);來源于芽孢桿菌的透明質(zhì)酸酶，分子量123kDa(專利號:CN 103255076 A);來源于芽孢桿菌(Bacillus niacini)的透明質(zhì)酸酶，分子量120kDa(Atsushi Kurata等)；來源于■尼古丁節(jié)桿菌(Artbrobacter nicotinovorous)的透明質(zhì)酸酶，分子量22.lkDa(蘇康等)；來源于豬鏈球菌(Streptococcus suis)的透明質(zhì)酸酶，分子量130 kDa(Andrew G等)；來源于化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的透明質(zhì)酸酶，分子量40 kDa(Sudhir Kumar Singh等)；來源于鏈球菌屬的透明質(zhì)酸酶，分子量111 kDa(John E.Coligan等)；來源于無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的透明質(zhì)酸酶，分子量58 kDa(Martin Oettl等)。
[0005]通過大量信息檢索，在產(chǎn)酶微生物與酶的分子量方面比對，未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明人研究的透明質(zhì)酸酶相同的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]
本發(fā)明的目的是提供了一種球形節(jié)桿菌及其產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶，本發(fā)明分離純化出一株來源于海洋的球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis Al52)菌株，并對其進(jìn)行生物材料的保藏，其保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址:湖北省武漢市洪山區(qū)八一路武漢大學(xué);保藏日期:2015年10月29日；保藏號:CCTCC M 2015649，利用該菌株通過液體發(fā)酵可以獲得活力高、穩(wěn)定性好、成本低的透明質(zhì)酸酶。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種球形節(jié)桿菌，其分類命名為球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis A152)，其保藏編號:CCTCC M 2015649。
[0008]該菌株球形態(tài)時細(xì)胞直徑為0.6-0.8μπι，桿形態(tài)時細(xì)胞直徑為0.5-0.8μπι X 1_4μπι，
菌落淡黃色，呈圓形，邊緣光滑。
[0009]本發(fā)明還提供了所述的球形節(jié)桿菌變溫調(diào)控生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶，它通過以下制備方法制得:
(1)將斜面菌種接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度31°C_37°C、轉(zhuǎn)速120-180rpm的條件下培養(yǎng)16-48h，獲得種子培養(yǎng)液；
(2)將種子培養(yǎng)液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度18°C_30°C、轉(zhuǎn)速120-180rpm的條件下培養(yǎng)16-48h，獲得透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液；
(3)離心或過濾分離所述透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液，取上清液；
(4)用硫酸錢沉淀所述上清液，離心或過濾收集粗蛋白；
(5)緩沖液復(fù)溶步驟(4)收集的粗蛋白，超濾或透析除去小分子雜質(zhì)，得到純化的透明質(zhì)酸酶。
[0010]制得的所述透明質(zhì)酸酶的分子量為73.7kDa。
[0011]所述制備方法還包括步驟(6):將步驟(5)中得到的透明質(zhì)酸酶利用QFF離子交換色譜或Sephadex G100凝膠過濾色譜精制，得到電泳純的透明質(zhì)酸酶。
[0012]所述制備方法還包括步驟(7):將步驟(5)或步驟(6)得到的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行真空冷凍干燥。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是:本發(fā)明涉及一株來源于海洋的球形節(jié)桿菌。經(jīng)過基因測序技術(shù)，遺傳標(biāo)志是包含序列表所示的16SrDNA核酸序列，通過在GenBank數(shù)據(jù)庫同源比對和生理生化鑒定，確定其為球形節(jié)桿菌，命名為Arthrobacter globiformis A152。該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，其發(fā)酵液中透明質(zhì)酸酶的活力達(dá)到最高，用本發(fā)明的菌株作為透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品活性高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短、成本低的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0014]本發(fā)明涉及一種來源于Arthrobacter globiformis A152的透明質(zhì)酸酶及透明質(zhì)酸酶的變溫調(diào)控生產(chǎn)方法，該酶的特征在于分子量為73.7kDa，其分子量不同于已報道的透明質(zhì)酸酶。通過種子液培養(yǎng)階段到發(fā)酵液培養(yǎng)階段的變溫調(diào)控、冷凍離心、硫酸銨沉淀法收集、超濾或透析，獲得純化的透明質(zhì)酸酶，將純化的透明質(zhì)酸酶通過Q-Sepharose ? FastFlow陰離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析處理，獲得一種電泳純的透明質(zhì)酸酶。該菌株產(chǎn)酶具有營養(yǎng)范圍廣、容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時間短的特點(diǎn)，發(fā)酵液中透明質(zhì)酸酶活力最高 7100U/mL。
【附圖說明】
[0015]
圖1:純化后的透明質(zhì)酸酶SDS-PAGE電泳結(jié)果。左邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，右邊為球形節(jié)桿菌Al 52制備并經(jīng)純化的透明質(zhì)酸酶單帶，數(shù)量表示單位:kDa。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明
1.一株Arthrobacter globiformis A152菌株的篩選與純化
本發(fā)明Arthrobacter globiformis A152菌株的獲得:從山東省青島市膠東海岸潮間帶淤泥，加入到裝有25mL的富集培養(yǎng)基中(透明質(zhì)酸0.28，牛肉膏0.58，蛋白胨0.58，K2HPO4 lg，MgS04 0.5g，NaCl 0.5g，CaCl2 0.0lg，H20 lOOOmL，自然pH)的三角瓶中，28°C，160rpm搖瓶培養(yǎng)2d，然后將富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后，取0.1ml涂布初篩分離培養(yǎng)基(透明質(zhì)酸 0.2g,K2HPO4 lg,MgSO4 0.5g,NaCl 0.5g，CaCl2 0.0lg，牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，牛血清白蛋白:0.18，瓊脂粉18.(^，出0 lOOOmL，自然pH )平板。28°C倒置培養(yǎng)2d，獲得選取平板上有透明圈性狀的菌落，得到一株能產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的細(xì)菌即為Arthrobacter globiformis A152菌株。
[0017]2.所述Arthrobacter globiformis A152菌株的鑒定
采用 che I ex-100基因組提取DNA，正向引物27F: