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一種球形節(jié)桿菌及其產生的透明質酸酶的制作方法_2

文檔序號:9804414閱讀:來源:國知局
5' -AGAGTTTGATCMTGCTCAG-37 (SEQ IDNo: 2),反向引物 1492R: 5' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-37 (SEQ ID No: 3)。反應體系50ul ;反應條件:94°C預變性2min,94°C變性30s,55°C退火40s,72°C延伸Imin,最后72°C延伸lOmiruPCR產物的純化、克隆、測序由上海生物工程有限公司完成,將16SrDNA基因序列測序結果(SEQ ID No:1)在GenBank數據庫進行同源比對確定其為節(jié)桿菌屬。
[0018]再經過伯杰手冊節(jié)桿菌屬的形態(tài)和生理生化鑒定,其特征是:革蘭氏陽性,專性好氧,不產生芽孢,可以水解淀粉,還原硝酸鹽,在標準營養(yǎng)肉湯中生長良好,菌株對營養(yǎng)要求不嚴格,可在以氯化銨為單一氮源,葡萄糖為碳源和能源的無機鹽培養(yǎng)基中生長,不需要添加生物素、硫胺素、泛酸、B12 ο菌株球形態(tài)時細胞直徑約為0.6-0.Sym,桿形態(tài)時細胞直徑為0.5-0.8μπι X 1_4μπι。該菌株分離自近海污泥,在10°C生長,最適溫度在25°C_30°C,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h成單菌落,菌落淡黃色,圓形,邊緣光滑,確定其為球形節(jié)桿菌,命名為Arthrobacter globiformis A152菌株。
[0019]對該菌株進行菌株保藏,其保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡稱CCTCC,地址:湖北省武漢市洪山區(qū)八一路武漢大學;保藏日期:2015年10月29日;保藏編號:CCTCC M2015649。
[0020]3.利用所述Arthrobacter globiformis A152菌株變溫調控生產透明質酸酶
將所述的Arthrobacter globiformis A152菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基(透明質酸 0.8g,牛肉膏 15g,蛋白胨 10g,MgSO4 0.5g,NaCl 5g,F(xiàn)Cl30.lg,H20 lOOOmL,自然pH)中,培養(yǎng)溫度32°C,培養(yǎng)轉速160rpm,培養(yǎng)時間36h,獲得種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基(透明質酸3g,牛肉膏5g,蛋白胨10g,MgS04 0.5g,NaCl 15g,CaCl2
0.0lg,H2O lOOOmL,自然pH),培養(yǎng)溫度22°C(未變溫調控組別培養(yǎng)溫度為32°C),培養(yǎng)轉速180rpm,培養(yǎng)時間24h,獲得含透明質酸酶的發(fā)酵液,未變溫調控組別發(fā)酵液酶活5461U/ml,變溫調控組別發(fā)酵液酶活為7100U/ml,以未變溫調控組別為對照,變溫調控使發(fā)酵液酶活提尚了 30%。
[0021]本發(fā)明所有涉及到透明質酸酶活定義與測定皆參考下面的描述:
(I)透明質酸酶活測定方法:2ml 20mM pH 6.0含有0.2% HA的磷酸鹽緩沖液,添加20μI酶液,37°C反應20min,添加2mlDNS試劑,520nm波長下測出反應結束后體系中的還原糖含量。
[0022](2)透明質酸酶活力定義:在37°C,pH 6.0的條件下,每min降解透明質酸產生Iyg還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)
4.來源于所述Arthrobacter globiformis A152菌株的透明質酸酶分離純化通過冷凍離心除去發(fā)酵液菌體,離心條件:溫度4°C、轉速8000rpm、離心時間1min,得到含透明質酸酶的發(fā)酵上清液。發(fā)酵上清液經70%飽和度硫酸銨沉淀后收集沉淀,用20mMpH7.5的磷酸鹽復溶,經截留分子量為3 kDa的聚醚砜超濾膜除去小分子雜質、濃縮10倍得到純化的透明質酸酶(比活為1.1 X 104U/mg)。
[0023]將純化的透明質酸酶加樣于Q-Sepharose ? Fast Flow柱,洗脫液為含有NaCl(O?1M)20mM磷酸鹽(pH 7.5)緩沖液,進行梯度洗脫,在280nm下檢測蛋白峰,DNS法測酶活,收集有活性的蛋白。將Q-Sepharose ? Fast Flow部分純化后的活性蛋白加樣于Sephadex GlOO凝膠柱,洗脫液為20mM磷酸鹽(pH 7.5)緩沖液,在280nm下檢測蛋白峰,DNS法測酶活后收集有活性的蛋白,獲得進一步精制的透明質酸酶(比活為6.9X 14U/
mg) ο
[0024]5.來源于所述Arthrobacter globiformis A152菌株的透明質酸酶分子量測定具體方法:將經凝膠色譜層析得到的所述透明質酸酶蛋白組分濃縮5倍,取20yL,加入8
V-L Sample Buffer在沸水浴中加熱5min使其變性,取出冷卻后,與預染maker—起上樣電泳,電泳后用考馬斯亮藍R250染色45min,脫色后測定標準蛋白質和樣品的迀移距離,計算相對迀移率,以相對迀移率和各標準蛋白質分子量的對數以最小二乘法做標準曲線,計算此酶的分子量,此酶在SDS-PAGE上顯示的分子量為:73.7 kDa (見附圖1)。
[0025]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案,而非對其進行限制;盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明,對于本領域的普通技術人員來說,依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改,或者對其中部分技術特征進行等同替換;而這些修改或替換,并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種球形節(jié)桿菌,其特征在于其分類命名為球形節(jié)桿菌Arthrobacter globiformisA152,其保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期:2015年10月29日,保藏編號:CCTCCM 2015649。2.根據權利要求1所述的球形節(jié)桿菌,其特征在于:菌株球形態(tài)時細胞直徑為0.6-0.8μm,桿形態(tài)時細胞直徑為0.5-0.8μπι X 1-4μπι,菌落淡黃色,呈圓形,邊緣光滑。3.權利要求1所述的球形節(jié)桿菌變溫調控生產的透明質酸酶,其特征在于它通過以下制備方法制得: (1)將斜面菌種接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度31°0371、轉速120_180rpm的條件下培養(yǎng)16-48h,獲得種子培養(yǎng)液; (2)將種子培養(yǎng)液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度18°C_30°C、轉速120-180rpm的條件下培養(yǎng)16-48h,獲得透明質酸酶發(fā)酵液; (3)離心或過濾分離所述透明質酸酶發(fā)酵液,取上清液; (4)用硫酸錢沉淀所述上清液,離心或過濾收集粗蛋白; (5)緩沖液復溶步驟(4)收集的粗蛋白,超濾或透析除去小分子雜質,得到純化的透明質酸酶。4.根據權利要求3所述的透明質酸酶,其特征在于:制得的所述透明質酸酶的分子量為73.7 kDa05.根據權利要求3所述的透明質酸酶,其特征在于:所述制備方法還包括步驟(6):將步驟(5)中得到的透明質酸酶利用QFF離子交換色譜或Sephadex GlOO凝膠過濾色譜精制,得到電泳純的透明質酸酶。6.根據權利要求3或5所述的透明質酸酶,其特征在于:所述制備方法還包括步驟(7):將步驟(5)或步驟(6)得到的透明質酸酶進行真空冷凍干燥。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種球形節(jié)桿菌及其產生的透明質酸酶。本發(fā)明涉及一種來源于潮間帶污泥的球形節(jié)桿菌<i>Arthrobacter?globiformis</i>?A152,該菌株具有營養(yǎng)條件簡單、易培養(yǎng)的特點,使用本發(fā)明的菌株生產透明質酸酶,具有產酶活力高、穩(wěn)定性好、成本低的特點,能夠實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng),滿足工業(yè)化的應用。本發(fā)明還涉及了一種通過變溫調控生產方法獲得的透明質酸酶,將種子培養(yǎng)轉接到發(fā)酵培養(yǎng)過程中進行低溫誘導發(fā)酵,發(fā)酵液經過分離純化、冷凍干燥,可以獲得不同規(guī)格的透明質酸酶產品,該方法具有產酶量高,生產周期短,操作簡單的優(yōu)勢。本發(fā)明中來源于<i>Arthrobacter?globiformis?</i>A152的透明質酸酶,SDS-PAGE確定該酶分子量為73.7?kDa。CCTCC NO.M 201564920151029
【IPC分類】C12R1/06, C12N1/20, C12N9/26
【公開號】CN105567606
【申請?zhí)枴緾N201610115793
【發(fā)明人】張京良, 朱常亮, 江曉路
【申請人】青島海洋生物醫(yī)藥研究院股份有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月2日
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