球形節(jié)桿菌生產(chǎn)的酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠用于食品產(chǎn)業(yè)中的安全性高的差向異構(gòu)酶和酮糖的制造方法。本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其能夠從屬于節(jié)桿菌（Arthrobacter）屬的微生物得到，并且具有下述的底物特異性：（1）將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖。（2）在D-或者L-酮糖中，相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。
【專利說(shuō)明】球形節(jié)桿菌生產(chǎn)的酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物生產(chǎn)的酶(酮糖3_差向異構(gòu)酶)、以及使用該酶的酮糖的制造方法，詳細(xì)而言，涉及酮糖3-差向異構(gòu)酶，進(jìn)一步涉及使用該酶的酮糖的制造方法，其中，所述酮糖3-差向異構(gòu)酶能夠從屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物，優(yōu)選為球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) M30 (保藏編號(hào)NITEBP-1111)得到，并且具有下述(A)和(B)的底物特異性:
[0002](A)將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖。
[0003](B)在D-或者L-酮糖中，相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。
【背景技術(shù)】
[0004] D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構(gòu)體，在甜味的強(qiáng)度和種類上與D-果糖極其類似。但是D-阿洛酮糖與D-果糖不同，其在體內(nèi)吸收時(shí)基本不代謝，熱量貢獻(xiàn)低。在專利文獻(xiàn)I中，記載了 D-阿洛酮糖作為低卡路里甜味劑，能夠有利地利用于低卡路里飲食品的制造中。即，D-阿洛酮糖可以作為減肥食品的有效成分使用。作為非砂糖甜味劑而廣泛利用的糖醇類如果超過(guò)規(guī)定量攝取，則會(huì)引起腹瀉等的副作用，但是D-阿洛酮糖這樣的副作用很少。進(jìn)一步，D-阿洛酮糖在人體內(nèi)基本不代謝，因此熱量值大致接近零，通過(guò)抑制脂質(zhì)合成酶的活性而具有減少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖也可以作為對(duì)體重減少有益的甜味劑使用(例如，參照非專利文獻(xiàn)I和2)。另外，在專利文獻(xiàn)2中，記載了由于D-阿洛酮糖具有血糖上升抑制作用，因此能夠有利地利用于健康食品、糖尿病患者用飲食品、瘦身用飲食品等中。從這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，D-阿洛酮糖集中了作為健康食品、減肥甜味劑的多個(gè)關(guān)注點(diǎn)，因此，在食品產(chǎn)業(yè)中，對(duì)于高效且安全的生成D-阿洛酮糖的方法的開(kāi)發(fā)的必要性提高。
[0005]另一方面，在非專利文獻(xiàn)3中，公開(kāi)了來(lái)自菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)ST-24的D-酮糖3-差向異構(gòu)酶,記載了通過(guò)利用該酶可以從D-果糖來(lái)制造D-阿洛酮糖。但是，正如該酶的別名被稱為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose3_epimerase)那樣，已知其對(duì)D-塔格糖的特異性最高，對(duì)D-果糖的作用比較弱。另外，菊苣假單胞菌是植物病原性微生物，D-酮糖3-差向異構(gòu)酶產(chǎn)生能力非常低，因此，還不能說(shuō)其適合工業(yè)的利用。因此尋求與屬于假單胞菌屬的微生物不同的，酮糖3-差向異構(gòu)酶產(chǎn)生能力高的，在食品生產(chǎn)方面、安全性方面沒(méi)有問(wèn)題的微生物，以及對(duì)D-果糖的特異性高，且適合制造D-阿洛酮糖的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶。
[0006] 在此，在專利文獻(xiàn)3中，以提供新型的酮糖3-差向異構(gòu)酶及其制造方法、編碼該酶的DNA、含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及使用該酶的酮糖的制造方法為課題，通過(guò)提供從屬于根瘤菌屬的微生物能夠得到的酮糖3-差向異構(gòu)酶及其制造方法、編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及使用該酶將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化來(lái)制造對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖的方法，從而解決上述課題。另外，在專利文獻(xiàn)4中，開(kāi)發(fā)了使用來(lái)自農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶(以下稱為阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶)的D-阿洛酮糖的生成方法。[0007]如以上所述，為了處理上述問(wèn)題，對(duì)于使用D-果糖作為底物，用酶生成D-阿洛酮糖的方法進(jìn)行了研究。但是迄今開(kāi)發(fā)的方法在用于作為食品的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)中時(shí)，在安全性方面還存在很多問(wèn)題點(diǎn)。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:日本專利特開(kāi)2001-011090號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)2:日本專利特開(kāi)2005-213227號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)3:W02007/058086號(hào)公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)4:日本專利特表2008-541753號(hào)公報(bào)
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)I:Matsuo, T., Y.Baba, M.Hashiguchi, K.Takeshita, K.1zumori andH.Suzuki, Asia Pac.J.Clin.Nutr.，10:233-237(2001)
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Matsuo, T.and Κ.1zumori,Asia Pac.J.Clin.Nutr.， 13:S127(2004)
[0017]非專利文獻(xiàn)3:Ken I zumor i e t al., Biosc1.Biotech.Biochem.，57，1037-1039(1993)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明所要解決的課題
[0019]本發(fā)明的課題在于提供從作為在制造食品時(shí)使用被認(rèn)可的、在現(xiàn)有添加物名冊(cè)收錄清單中收錄的菌種中基本沒(méi)有毒性的菌種中，獲得以高收率催化從D-果糖向D-阿洛酮糖的異構(gòu)化的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶，以及使用該酶的酮糖的制造方法。
[0020]本
【發(fā)明者】等在每次有機(jī)會(huì)的時(shí)候就采集各地的土壤，從其中分離微生物，持續(xù)探索具有酮糖3-差向異構(gòu)酶產(chǎn)生能力的屬于假單胞菌屬微生物以外的微生物。除了上述日本的現(xiàn)有添加物名冊(cè)收錄清單以外，還著眼于在歐洲和美國(guó)作為食品使用被認(rèn)可的清單中記載的菌種中基本沒(méi)有毒性的菌種，持續(xù)專門(mén)探索。
[0021]其結(jié)果，在大量分離的菌株中發(fā)現(xiàn)了新型的產(chǎn)生酮糖3-差向異構(gòu)酶的屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物。另外，來(lái)自該微生物的新型的酮糖3-差向異構(gòu)酶具有作用于D或者L-酮糖的3位，催化向?qū)?yīng)的D-或者L-酮糖進(jìn)行差向異構(gòu)化的廣泛的底物特異性，并意外地發(fā)現(xiàn)其在D-或者L-酮糖中，相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高，適合于從D-果糖到D-阿洛酮糖的制造。從而確立能夠通過(guò)屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶及其制造方法，并確立利用該酶的酮糖的轉(zhuǎn)化方法以及酮糖的制造方法，由此完成本發(fā)明。
[0022]即，本發(fā)明的目的在于，提供能夠從屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到的酮糖3-差向異構(gòu)酶，以及利用該酶將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，制造對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖的方法。 [0023]屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物的新型酮糖3_差向異構(gòu)酶產(chǎn)生能力比較高，并且和菊苣假單胞菌不同，不具有植物病原性。另外，能夠從該微生物中得到的本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶尤其能夠很好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖之間的相互轉(zhuǎn)化，因此在從D-果糖到D-阿洛酮糖的制造中有用。
[0024]解決課題的手段
[0025]本發(fā)明將下述(I)~(6)中記載的酮糖3-差向異構(gòu)酶作為要點(diǎn)。
[0026](1) 一種酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述酮糖3-差向異構(gòu)酶能夠從屬于節(jié)桿菌屬的微生物得到，并且具有下述(A)、(B)的底物特異性:
[0027](A)將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖，
[0028](B)在D-或者L-酮糖中，相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。
[0029](2)如上述(I)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述屬于節(jié)桿菌屬的微生物為球形節(jié)桿菌。
[0030](3)如上述(I)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述屬于節(jié)桿菌屬的微生物為球形節(jié)桿菌M30 (保藏編號(hào)NITE BP-1lll)。
[0031](4)如上述(I)~(3)中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述酮糖3-差向異構(gòu)酶是通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的亞單位的分子量為約32kDa，通過(guò)凝膠過(guò)濾法測(cè)定的分子量為120kDa、亞單位的分子量為32kDa的同源四聚體(homotetramer)結(jié)構(gòu)。
[0032](5)如上述(I)~(4)中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述酮糖3-差向異構(gòu)酶具有下述物理化學(xué)性質(zhì)(a)~(e):
[0033](a)最適 pH
[0034]在30°C下反應(yīng)30分鐘，在20mM的鎂(Mg2+)存在的條件下，pH為6~11 ;
[0035](b)最適溫度
[0036]在ρΗ7.5下反應(yīng)30分鐘，在20mM的鎂(Mg2+)存在的條件下溫度為60~80°C ；
[0037](c) pH 穩(wěn)定性
[0038]在4°C下保持24小時(shí)的條件下，至少在pH5~11的范圍內(nèi)穩(wěn)定；
[0039](d)熱穩(wěn)定性
[0040]在PH7.5下保持I小時(shí)，在4mM的鎂離子(Mg2+)存在的條件下，在約50°C以下穩(wěn)定；在鎂離子(Mg2+)不存在的條件下，在約40°C以下穩(wěn)定；
[0041](e)通過(guò)金屬離子活化
[0042]通過(guò)二價(jià)錳離子(Mn2+)、二價(jià)鈷離子(Co2+)、鈣(Ca2+)和鎂離子(Mg2+)活化。
[0043](6)如上述(I)~(5)中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中，所述酮糖3-差向異構(gòu)酶具有下述底物特異性1.~8.:
[0044]1.將D-果糖作為底物時(shí)相對(duì)活性為43.8%，
[0045]2.將D-阿洛酮糖作為底物時(shí)的活性為100%，
[0046]3.將D-山梨糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為1.13%，
[0047]4.將D-塔格糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為18.3%，
[0048]5.將L-果糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為0.97%，
[0049]6.將L-阿洛酮糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為21.2%，
[0050]7.將L-山梨糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為16.6%，
[0051]8.將L-塔格糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為44.0%，
[0052]其中，將D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)化活性作為100，將相對(duì)于各個(gè)酮糖的活性作為相對(duì)活性來(lái)表示。[0053]另外，本發(fā)明將下述(7)中記載的酮糖的轉(zhuǎn)化方法、以及下述(8)中記載的酮糖的制造方法作為要點(diǎn)。
[0054](7)—種酮糖的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在含有選自D-或者L-酮糖中的I種以上的酮糖的溶液中，使上述(I)~(6)中任一項(xiàng)記載的酮糖3-差向異構(gòu)酶作用，從而將該酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化。
[0055](8)—種酮糖的制造方法，其特征在于，在含有選自D-或者L-酮糖中的I種以上的酮糖的溶液中，使上述(I)~(6)中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶作用，從而將該酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的酮糖并收集該酮糖。
[0056]發(fā)明效果
[0057]本發(fā)明可以得到以下的效果。
[0058]1.作為將來(lái)自球形節(jié)桿菌的本酶用于食品產(chǎn)業(yè)中的最大優(yōu)勢(shì)在于菌的安全性。
[0059]2.D-阿洛酮糖生產(chǎn)菌的最適pH為,假單胞菌屬(Pseudomonas)為7~9,根瘤菌屬(Rhizobium)為9~9.5, 土壤桿菌屬(Agrobacterium)為7~8。另一方面，由本菌株生產(chǎn)的酶的最適pH在6~8之間，在著色少的7以下的pH下也可以生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0060]3.由測(cè)定了 30分鐘的酶活性的結(jié)果,報(bào)告了根瘤菌屬(Rhizobium)通過(guò)Mn2+、MR2+會(huì)增加活性，土壤桿菌屬(ARrobacterium)通過(guò)Co2+、Mn2+會(huì)增加活性。在本酶的情況下，確認(rèn)了通過(guò)Mn2+和Co2+會(huì)增加活性。另外，通過(guò)Mg2+、Ca2+也可以增加活性。
[0061]4.與以前的酶相比，可以進(jìn)行在寬范圍溫度區(qū)域內(nèi)的反應(yīng)。
[0062]5.從L-塔格糖向L-山梨糖的反應(yīng)活性大。
[0063]6.可以得到即便在培養(yǎng)基中添加的D-阿洛酮糖少至0.15%也具有活性的菌體。
[0064]7.即便在水中也具有酶活性，進(jìn)行從果糖向阿洛酮糖的反應(yīng)。
[0065]8.比菊苣假單胞菌繁殖速度大。
[0066]通過(guò)本發(fā)明，能夠從作為在制造食品時(shí)使用被認(rèn)可的、在現(xiàn)有添加物名冊(cè)收錄清單中收錄的菌種中基本沒(méi)有毒性的菌種中，獲得以高收率催化從D-果糖向D-阿洛酮糖的異構(gòu)化的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶。進(jìn)而，提供使用該酶的酮糖的制造方法。
[0067]即，本發(fā)明能夠提供能夠從屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到的酮糖3-差向異構(gòu)酶，以及能夠提供利用該酶，從而將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖的方法。能夠從該微生物得到的本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶，尤其可以良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖之間的相互轉(zhuǎn)化，因此在從D-果糖制造D-阿洛酮糖中有用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0068]圖1是表示使用了無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的各種碳源對(duì)酶生產(chǎn)量的影響的圖。
[0069]圖2是表不在各種培養(yǎng)基中對(duì)酶生產(chǎn)量的影響的圖。
[0070]圖3是表示金屬離子對(duì)D-PE活性的影響的圖。
[0071]圖4是表示最適溫度的圖。
[0072]圖5是表示熱穩(wěn)定性的圖。
[0073]圖6是表示最適pH的圖。
[0074]圖7是表示pH穩(wěn)定性的圖。[0075]圖8是表示通過(guò)離子交換色譜進(jìn)行的分離洗提的圖。
[0076]圖9是表示用疏水作用色譜進(jìn)行的分離洗提的圖。
[0077]圖10是用于確認(rèn)純度的SDS-PAGE的照片。
[0078]圖11是表示最適pH的范圍的圖。
[0079]圖12是表示最適溫度的范圍的圖。
[0080]圖13是表示穩(wěn)定的pH范圍的圖。
[0081]圖14是表示穩(wěn)定的溫度范圍的圖。
[0082]圖15是表示泳動(dòng)距離(migration distance)和分子量的關(guān)系的圖。
[0083]圖16是表不標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)的移動(dòng)距尚的關(guān)系圖和分子量的關(guān)系的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0084]本發(fā)明涉及能夠從屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到的，具有下述底物特異性的酮糖3-差向異構(gòu)酶，在食品工業(yè)中使用的菌的安全性、低的最適pH、熱穩(wěn)定性以及金屬要求性方面有特點(diǎn)。
[0085][安全性]
[0086]作為將本酶、球形節(jié)桿菌用于食品產(chǎn)業(yè)中的最大優(yōu)勢(shì)在于菌的安全性。該菌種首先在美國(guó)由 FDA 在 EAFUS (Everything Added to Food in the United States):A FoodAdditive Database中作為“來(lái)自固定化球形節(jié)桿菌的葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerasefrom immobilized arthrobacter globiformis)”而被收錄。該使用方法將菌體直接固定化，并且證明菌體本身的安全性非常高。
[0087]另外，在歐洲由EFFCA (The European food&feed cultures association)和 IFD(International Federation for the Roofing Trade)的〈〈Inventory of Microorganismswith a documented history of use in food》中記載了作為“柑橘發(fā)酵以除去朽1檬苦素并降低苦味(Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness)，，被使用的要點(diǎn)。這顯示與酵母等同樣，將該菌種用于發(fā)酵中，并顯示安全性極高。在日本，節(jié)桿菌屬是作為“ct -淀粉酶、異麥芽糖葡聚糖酶(isomaltodextranase)、鹿糖酶(Invertase)、尿素酶、葡聚糖酶、α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶”等的酶基原微生物，另外，作為海藻糖或者維生素K (甲萘醌)生產(chǎn)菌而被收錄于食品添加物清單中。
[0088]雖然這樣在日美歐有很長(zhǎng)的使用實(shí)際成績(jī)，但是驚訝的是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由該菌種產(chǎn)生的差向異構(gòu)酶。
[0089]另一方面，作為至今已知的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)酶，有通過(guò)假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)等產(chǎn)牛.的牛.產(chǎn)酶。它們也有上述美歐的清單中沒(méi)有收錄的作為機(jī)會(huì)致病菌或者植物細(xì)胞感染等的報(bào)告。
[0090]另外，在通過(guò)作為糖質(zhì)酶的代表性酶的葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行的從葡萄糖來(lái)生產(chǎn)果糖中，報(bào)告有多種菌株(60種以上),但是實(shí)用化的菌株不過(guò)是在鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、節(jié)桿菌屬等少數(shù)的屬中的應(yīng)用。因此，節(jié)桿菌屬是具有使用實(shí)際成績(jī)的安全性高的菌種。
[0091][最適pH和金屬要求性]
[0092]進(jìn)一步，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于以下的事項(xiàng)。[0093]D-阿洛酮糖的最適pH為,假單胞菌屬為7~9,根瘤菌屬為9~9.5,土壤桿菌屬為7~8。另一方面，由本菌株生產(chǎn)的酶的最適pH在6~8之間,在著色少的7以下的pH下也可以生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0094]另外，由測(cè)定了 30分鐘的酶活性的結(jié)果，報(bào)告了根瘤菌屬通過(guò)Mn2+、Mg2+會(huì)增加活性，土壤桿菌屬通過(guò)Co2+、Mn2+會(huì)增加活性。在本酶的情況下，確認(rèn)了通過(guò)Mn2+和Co2+會(huì)增加活性。另外，由于通過(guò)Mg2+、Ca2+也可以增加活性，因此使用了 Mg2+等的本菌株可以生產(chǎn)D-阿洛酮糖。
[0095][菌株的來(lái)源以及鑒定]
[0096]本
【發(fā)明者】等在大量分離的菌株中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新型的酮糖3-差向異構(gòu)酶的微生物M30株，并且通過(guò)基于16SrRNA基因堿基序列同源性進(jìn)行系統(tǒng)分析，判定M30株屬于球形節(jié)桿菌。
[0097]菌株的鑒定 [0098](I) 16SrRNA基因堿基序列同源性
[0099]分析16SrRNA基因區(qū)域，并確定堿基數(shù)為734。
[0100](2)同源性檢索
[0101]針對(duì)該菌株的16SrRNA基因的堿基序列，通過(guò)BLAST檢索(日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行與已知菌種的同源性檢索。由相對(duì)于上述特定的堿基數(shù)734的堿基序列，同源性為97%以上的菌株名和同源性(％)的值來(lái)確定M30株的微生物為球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)。
[0102]作為本發(fā)明的具有酮糖3-差向異構(gòu)酶活性的菌株,球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)M30是在2011年6月22日保藏在位于千葉縣木更津市上總鐮足2_5_8的獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心，首先以受理編號(hào)NITE AP-1lll受理，并以保藏編號(hào)NITE P-1lll保藏。
[0103]在本發(fā)明中所謂的酮糖是指具有酮糖結(jié)構(gòu)的六碳糖，具體而言，是指果糖、阿洛酮糖、塔格糖、和山梨糖，D-或者L-酮糖是指它們的D-體和L-體。
[0104]本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶具有將D-或者L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖的活性，并且催化D-或者L-果糖與D-或者L-阿洛酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化、以及D-或者L-塔格糖與D-或者L-山梨糖之間的相互轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶是在D-或者L-酮糖中相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高的酶。本發(fā)明的酶可以由屬于后述的節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物得到。
[0105]本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶可以通過(guò)培養(yǎng)屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬且具有酮糖3-差向異構(gòu)酶產(chǎn)生能力的微生物，從在培養(yǎng)液中繁殖的菌體中采集酮糖3-差向異構(gòu)酶來(lái)調(diào)制。作為屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的微生物,可以優(yōu)選利用球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) M30 (保藏編號(hào) NITE BP-1lll)株及其變異株等。M30 株的酮糖3-差向異構(gòu)酶的產(chǎn)生能力比較高，因此在得到本發(fā)明的酶方面優(yōu)選。M30株在此次進(jìn)行國(guó)際申請(qǐng)時(shí)，于2012年5月2號(hào)請(qǐng)求從2011年6月22日原保藏在日本國(guó)獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(日本國(guó)千葉縣木更津市東上總鐮足2-5-8)的NITE P-1lll移管至基于布達(dá)佩斯條約的保藏，并以保藏編號(hào)為NITE BP-1lll進(jìn)行國(guó)際保藏。[0106][精制前的本酶的物理化學(xué)性質(zhì)]
[0107]精制前的酶的酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性可以通過(guò)將D-果糖作為底物，測(cè)定D-阿洛酮糖的生成量來(lái)測(cè)定。具體而言，酶反應(yīng)液組成是使用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.0)200ml、0.2M D-果糖375 μ 1、酶液100 μ 1、IOmM氯化錳75 μ 1，在55°C下反應(yīng)30分鐘，煮沸2分鐘以停止反應(yīng)，通過(guò)HPLC測(cè)定反應(yīng)后的溶液組成。I單位酶活性定義為在上述條件下，將D-果糖進(jìn)行差向異構(gòu)化在I分鐘內(nèi)生成1 μ mol的D-阿洛酮糖的酶的量。對(duì)于作為逆反應(yīng)的從D-阿洛酮糖向D-果糖的差向異構(gòu)化的酶單位，也在同樣條件下測(cè)定并同樣定義。
[0108]本發(fā)明的酮糖3-差向異構(gòu)酶有具有下述的物理化學(xué)性質(zhì)的情況。
[0109](a)最適 pH
[0110]在55°C下反應(yīng)30分鐘，在ImM的二價(jià)鈷離子(Co2+)存在的條件下，pH為6.0~10。
[0111](b)最適溫度
[0112]在pH7.0下反應(yīng)30分鐘，在ImM的二價(jià)鈷離子(Co2+)存在的條件下，溫度約為50°C ~約 70°C。
[0113](c) pH 穩(wěn)定性
[0114]在4°C下保持24分鐘，至少在pH5.5~11的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
[0115](d)熱穩(wěn)定性
[0116]在pH7.0下保持10分鐘，在ImM的二價(jià)鈷離子(Co2+)存在的條件下，在約7(TC以下穩(wěn)定，在ImM的二價(jià)鈷離子(Co2+)不存在的條件下，在約60°C以下穩(wěn)定。
[0117](e)通過(guò)金屬離子活化
[0118]通過(guò)二價(jià)錳離子(Mn2+)或者二價(jià)鈷離子(Co2+)活化。
[0119]酮糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)通常按照以下的條件進(jìn)行。底物濃度為I~60% (w/v)，優(yōu)選為約5~50% (w/v);反應(yīng)溫度為10~70°C，優(yōu)選為約30~60°C;反應(yīng)pH為5~10，優(yōu)選為7~10 ;酶活性為每Ig底物為I單位以上，優(yōu)選為選自50~5，000單位的范圍。反應(yīng)時(shí)間可以適當(dāng)選擇，由于與經(jīng)濟(jì)性的關(guān)系，在分批反應(yīng)的情況下，通常在5~50小時(shí)的范圍內(nèi)選擇。
[0120]由此轉(zhuǎn)化得到的反應(yīng)溶液含有原料的酮糖和新生成的酮糖，也可以有利地實(shí)施將其直接用作甜味劑、保濕劑、結(jié)晶析出防止劑、醬油糖汁賦予劑。通常反應(yīng)溶液可以按照常用方法使用活性碳來(lái)脫色，使用H型和OH型離子交換樹(shù)脂來(lái)脫鹽、濃縮得到糖漿狀制品。
[0121]如果需要可以將該濃縮液例如通過(guò)使用堿金屬型或者堿土類金屬型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的柱色譜，分離精制新生成的酮糖和原料酮糖，將高濃度含有新生成的酮糖的成分濃縮，得到糖漿狀制品，進(jìn)一步在能夠結(jié)晶化酮糖的情況下，也可以有利地實(shí)施使其結(jié)晶析出，從而得到結(jié)晶制品。另外，也可以有利地實(shí)施將該分離了的原料酮糖再次用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的原料中。
[0122]這樣得到的酮糖優(yōu)選作為甜味劑，并能夠有利地利用于飲食物、飼料、餌料、牙膏、口香片、舌下片、內(nèi)服藥等經(jīng)口攝取物的甜味賦予、嗜好性提高等中。另外，也能夠有利地作為發(fā)酵用碳源、試藥、化學(xué)品.醫(yī)藥品的原料、中間體等利用。
[0123]以下，通過(guò)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。另外，在以下的實(shí)驗(yàn)中，按照上述的活性測(cè)定法測(cè)定將D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶活性，標(biāo)記為酮糖3-差向異構(gòu)酶活性。
[0124]<實(shí)驗(yàn)1:球形節(jié)桿菌M30 (保藏編號(hào)NITE BP-1111)株的培養(yǎng)>
[0125]在將0.2%的D-阿洛酮糖作為碳源、將硫酸銨作為氮源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，無(wú)菌添加球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) M30 (受保藏編號(hào)NITE BP-1lll)株的種營(yíng)養(yǎng)液1% (v/v)，一邊通氣攪拌一邊在30°C下培養(yǎng)16小時(shí)。得到的培養(yǎng)液中的酮糖3-差向異構(gòu)酶活性約為14單位/100mL培養(yǎng)液。
[0126]<實(shí)驗(yàn)2:球形節(jié)桿菌M30 (保藏編號(hào)NITE BP-1111)株的培養(yǎng)和粗酶的提取>
[0127]通過(guò)離心分離從培養(yǎng)液中回收菌體。回收了的菌體使用ImM Tris-HCl緩沖液(pH7.0)清洗。接下來(lái)，將菌體懸濁于IOml的ImM Tris-HCl緩沖液(pH7.0)之后，一邊將該菌體懸濁液在冰水中冷卻一邊用超聲波均質(zhì)機(jī)(株式會(huì)社SONICS&MATERIALS)破碎細(xì)胞。將破碎物在12000rpm下離心20分鐘，將該離心上清液作為粗酶。
[0128]<實(shí)驗(yàn)3:粗酶的透析>
[0129]向纖維素酯透析膜(Cellulose Ester Dialysis Membrane) (SPECTRUMLaboratory公司)中加入粗酶，將膜整體浸潰于含有20mM EDTA的IOmM Tris-HCl緩沖液中12小時(shí)以透析。將膜用IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7.0)清洗2次之后，從膜中提取粗酶液。
[0130]<實(shí)驗(yàn)4:酶活性的檢測(cè)>
[0131]按照下述的反應(yīng)條件，分別使之反應(yīng)之后，通過(guò)煮沸停止反應(yīng)。用離子交換樹(shù)脂將反應(yīng)溶液進(jìn)行脫鹽，用過(guò)濾器處理調(diào)制HPLC樣品。將樣品在HPLC系統(tǒng)(T0S0HCORPORATION)中用CK08EC (三菱化學(xué))進(jìn)行色譜分析。從色譜圖的峰面積值算出生成的各種糖。
[0132]〈試驗(yàn)結(jié)果〉
[0133]<實(shí)驗(yàn)5:酮糖3-差向異構(gòu)酶的性質(zhì)>
[0134]1.碳源及其濃度對(duì)活性的影響
[0135]在含有0.05-1%的D-阿洛酮糖(D-p)、1%的D-果糖(D_f )、1%的D-塔格糖(D_t)、0.1%的果糖(D-f)和0.1%的D-阿洛酮糖(D-p)、1%的D-阿洛酮糖(D-ρ)和0.1%的D-塔格糖(D-t)的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)球形節(jié)桿菌M30 (保藏編號(hào)NITE BP-1111)株，并按照與上述同樣的操作調(diào)節(jié)所得到的粗酶的各活性。
[0136]其結(jié)果(圖1)可知，由于本菌的酶是在D-阿洛酮糖存在時(shí)被生產(chǎn)的，因此是由D-阿洛酮糖得到的誘導(dǎo)酶，D-阿洛酮糖濃度為0.2%時(shí)顯示最高活性。
[0137]2.培養(yǎng)基對(duì)酶活性的影響
[0138]用3種不同的培養(yǎng)基(最少無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、以及酶提取物(YE)培養(yǎng)基)在30°C下培養(yǎng)16小時(shí)，按照與上述同樣的方法得到粗酶。
[0139]其結(jié)果(圖2)可知，酶在通過(guò)向最便宜的最少無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中添加D-阿洛酮糖，酶活性最聞。
[0140]3.金屬離子對(duì)D-PE活性的影響
[0141]對(duì)在實(shí)驗(yàn)3中所示的含有EDTA的緩沖液，使用透析過(guò)的酶液，在以下的表1所示的反應(yīng)條件下測(cè)定酶活性。得到的結(jié)果示于圖3中。
[0142] 通過(guò)對(duì)EDTA進(jìn)行透析活性會(huì)消失表示本酶要求金屬離子。測(cè)定金屬離子對(duì)酶活性的影響，結(jié)果通過(guò)添加MnCl2、CoCl2,酶活性增大。由此確認(rèn)本酶需要Mn2+或者Co2+。
[0143][表1]
[0144]
【權(quán)利要求】
1.一種酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中， 所述酮糖3-差向異構(gòu)酶能夠從屬于節(jié)桿菌屬的微生物得到，并且具有下述(A)、(B)的底物特異性: (A)將D-或L-酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的D-或者L-酮糖， (B)在D-或者L-酮糖中，相對(duì)于D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特異性最高。
2.如權(quán)利要求1所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中， 所述屬于節(jié)桿菌屬的微生物為球形節(jié)桿菌。
3.如權(quán)利要求1所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中， 所述屬于節(jié)桿菌屬的微生物為球形節(jié)桿菌M30，其保藏編號(hào)為NITE BP-1lll。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶，其中， 所述酮糖3-差向異構(gòu)酶是通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的亞單位的分子量為約32kDa，通過(guò)凝膠過(guò)濾法測(cè)定的分子量為120kDa、亞單位的分子量為32kDa的同源四聚體結(jié)構(gòu)。
5.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶,其中， 所述酮糖3-差向異構(gòu)酶具有下述物理化學(xué)性質(zhì)(a)~(e): Ca)最適pH 在30°C下反應(yīng)30分鐘，在20mM的鎂Mg2+存在的條件下，pH為6~11 ; (b)最適溫度 在pH7.5下反應(yīng)30分鐘，在20mM的鎂Mg2+存在的條件下，溫度為60~80°C ; (c)pH穩(wěn)定性 在4°C下保持24小時(shí)的條件下，至少在pH5~11的范圍內(nèi)穩(wěn)定； (d)熱穩(wěn)定性 在pH7.5下保持I小時(shí)，在4mM的鎂離子Mg2+存在的條件下，在約50°C以下穩(wěn)定；在鎂離子Mg2+不存在的條件下，在約40°C以下穩(wěn)定； (e)通過(guò)金屬離子活化 通過(guò)二價(jià)錳離子Mn2+、二價(jià)鈷離子Co2+、二價(jià)鈣離子Ca2+以及鎂離子Mg2+活化。
6.如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶,其中， 所述酮糖3-差向異構(gòu)酶具有下述的底物特異性1.~8.: . 1.將D-果糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為43.8%， . 2.將D-阿洛酮糖作為底物時(shí)的活性為100%， . 3.將D-山梨糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為1.13%， . 4.將D-塔格糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為18.3%， . 5.將L-果糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為0.97%，. 6.將L-阿洛酮糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為21.2%，
7.將L-山梨糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為16.6%，
8.將L-塔格糖作為底物時(shí)的相對(duì)活性為44.0%， 其中，將D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)化活性作為100，將相對(duì)于各個(gè)酮糖的活性作為相對(duì)活性來(lái)表示。 . 7.一種酮糖的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于， 在含有選自D-或者L-酮糖中的I種以上的溶液中，使權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向異構(gòu)酶作用，從而將該酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化。`8.一種酮糖的制造方法，其特征在于， 在含有選自D-或者L-酮糖中的1種以上的溶液中，使權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的酮糖3-差向 構(gòu)酶作用，從而將該酮糖的3位進(jìn)行差向異構(gòu)化，生成對(duì)應(yīng)的酮糖并收集該酮糖。
【文檔編號(hào)】C12N9/90GK103946379SQ201280033597
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】何森健, P·K·古洛帕利, 新谷知也, 吉川諒 申請(qǐng)人:松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 株式會(huì)社希少糖生產(chǎn)技術(shù)研究所