專利名稱：：一種增強(qiáng)土著根瘤菌固氮能力的生物源激活劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種根瘤菌固氮能力生物源激活劑，尤其是涉及一種利用木霉菌及其代謝產(chǎn)物增強(qiáng)土著根瘤菌固氮能力的生物源激活劑。
背景技術(shù)：
：在根瘤菌一豆科作物這一共生固氮體系中，共生固氮作用是一個(gè)由雙方有關(guān)基因共同參與、協(xié)同作用并自主調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，影響和決定根瘤菌共生固氮效率的因素包括土壤生態(tài)環(huán)境、寄主植物和根瘤菌自身遺傳特性等3個(gè)方面。就根瘤菌而言，土著根瘤菌的數(shù)量、根瘤菌耐酸性(前人用熒光抗體法研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤酸化程度的不斷增加，根瘤菌結(jié)瘤受抑制的程度加大，但不同根瘤菌菌株耐酸性有所不同)、有效性(固氮效能)為最主要影響因子。前人研究表明，經(jīng)過有效性選擇的好的根瘤菌品系，固氮量可以達(dá)到每年每公頃200一300公斤氮素，但無效菌株(如大多數(shù)野生的土著菌株)，僅僅只能提供30公斤/公頃的氮素，甚至更少，固氮功效相差十倍以上。因此人們嘗試輔助于人工接種高效根瘤菌，以達(dá)到獲得高共生固氮效能的目的。這也是目前國內(nèi)外將如何提高該體系共生固氮效率的研究重點(diǎn)大都放在根瘤菌的遺傳基因的改造上的重要原因。雖然近年來已通過自然選育或基因工程技術(shù)獲得了不少具有高效固氮能力的菌株，并在人工控制的條件下證明它們能夠使豆科作物顯著增產(chǎn)。但由于人工接種的菌株在成為結(jié)瘤占優(yōu)勢的菌株之前，在土壤中需要一個(gè)長時(shí)間的積累過程(有試驗(yàn)證明為4年)。而且，根瘤菌在土壤中的繁殖速度，也決定了其競爭結(jié)瘤的效率，通常人工接種的根瘤菌在土壤中的繁殖速度比培養(yǎng)基上慢很多。前人實(shí)驗(yàn)表明，根瘤菌主要從植物根毛表皮細(xì)胞侵入，而植物新生根毛在4-5h即喪失受感態(tài)，這對于在土壤中代時(shí)達(dá)3-5d的慢生型根瘤菌的侵染顯然是不利的，由此也造成了土著根瘤菌在競爭結(jié)瘤方面往往較人工接種的菌株占有優(yōu)勢，這是根瘤菌在土壤中的"位置效應(yīng)"。由于人工接種高效固氮菌株與土著根瘤菌的競爭結(jié)瘤問題一直未得到很好解決，阻礙了這些高效固氮菌株田間應(yīng)用效果的發(fā)揮。還有研究指出，土壤中普遍存在大量的土著根瘤菌，但土著根瘤菌絕大部分存在著侵染力強(qiáng)，固氮活性低的弱點(diǎn)，在競爭結(jié)瘤上，卻又常占優(yōu)勢。因此，如何將具有數(shù)量優(yōu)勢的土著根瘤菌結(jié)瘤力強(qiáng)、固氮力低這一生物學(xué)特性改變?yōu)榻Y(jié)瘤力與固氮力均強(qiáng)的特性，成為人們追求的共生固氮效果最大化的重要目標(biāo)和研發(fā)方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對豆科作物栽培中，人工接種的根瘤菌劑侵染力、結(jié)瘤率較低，而土著根瘤菌結(jié)瘤率雖強(qiáng)但固氮能力低的缺陷，提供一種增強(qiáng)土著根瘤菌固氮能力的生物源激活劑。本發(fā)明之生物源激活劑采用以下所述方法制成(1)將哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)T216(已于2007年9月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNa:M207141)接種到裝有150mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于27士TC下轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)60小時(shí)，作為發(fā)酵種子用；液體培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04lg，MgS0.7H200.5g，CaC030.25g，(NH4)2S042g，水1000mL，PH自然，經(jīng)115。C滅菌15-20分鐘；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵將第(1)步所得木霉菌種子培養(yǎng)液按10%(V/V)的接種量接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵控制參數(shù)為-溫度控制，分為兩個(gè)階段，發(fā)酵第一階段，即菌體培養(yǎng)階段0-72小時(shí)，26-28。C;發(fā)酵第二階段，即代謝產(chǎn)物生產(chǎn)階段72-100小時(shí)，23-25°C;通氣量(V/V):0-20小時(shí)1:0.6;20-40小時(shí)1:0.8;40-80小時(shí)1:1.2，80小時(shí)以后:1:0.6;攪拌速度250-300rpm;初始pH值控制為6.5-6.8，前24小時(shí)維持在初始值；發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分1.5-2.0%麥麩汁液，0.5-1.0%葡萄糖，2.0-3.0%玉米粉，1.0-2.0%酵母膏，0.l-O.5%CaC03，0.Ol-O.03%MgS04，0.5-0.8%磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，pH值為6.5-6.8，余量為水；通入蒸氣達(dá)12rC在位滅菌30分鐘；所述百分比均為重量百分比；(3)發(fā)酵完成后，發(fā)酵液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH=7-8(優(yōu)選7.5)悶罐過夜，滅菌紗布真空過濾，得濾液，密封包裝，即成。本發(fā)明的有益效果在豆科作物播種前，將本發(fā)明之生物源激活劑按20-30%(體積比)添加入浸種液浸泡種子4-6小時(shí)，或在豆科作物幼苗移栽時(shí)，用清水稀釋4-5倍的生物源激活劑浸根半小時(shí)，作物生長期間，能誘導(dǎo)土著根瘤菌結(jié)瘤固氮能力顯著增強(qiáng)。例如，試驗(yàn)表明，本發(fā)明之生物源激活劑可以顯著提高豇豆、花生等供試作物的根瘤數(shù)量、根瘤鮮干重和固氮活性以及提高作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)等。經(jīng)本發(fā)明之生物源激活劑處理后的土著根瘤菌所結(jié)根瘤中的豆血紅蛋白的含量達(dá)0.40umol/plant，提高量高達(dá)57.14%;含鐵量提高了1.16倍；處理后的土著根瘤菌所結(jié)根瘤固氮酶活性比對照固氮酶活性提高了61.01%。而且可促進(jìn)土著根瘤菌對豆科作物根部的親和力和侵染力，促使宿主中心組織加快分化形成根瘤組織，使宿主比對照提早3天結(jié)瘤，根瘤提前5天具有固氮活性；圖1為本發(fā)明混合接種試驗(yàn)根瘤類菌體DNA的AFLP指紋圖譜圖中0:Marker,1-3:單獨(dú)接種出發(fā)土著根瘤菌所結(jié)根瘤中類菌體DNA圖譜，4一5:單獨(dú)接種經(jīng)T216激活劑處理的土著根瘤菌所結(jié)根瘤中類菌體DNA圖譜，6—48:二者混合接種根瘤菌所結(jié)根瘤中類菌體DNA圖譜。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例l制備實(shí)施例(l)哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)T216母種斜面培養(yǎng)采用試管PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)木霉菌種子搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04lg，MgS04'7H200.5g，CaC030.25g，(NH4)2S042g，水1000mL，p朋.9,分裝入500mL三角瓶中，裝液量為200mL，經(jīng)115。C滅菌20分鐘，在無菌條件下將母種轉(zhuǎn)入搖瓶，于27土rC下轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)60小時(shí)，得到種子，備用；發(fā)酵罐發(fā)酵，按10%(V/V)的接種量接入發(fā)酵罐，進(jìn)行控制發(fā)酵，發(fā)酵控制參數(shù)為溫度控制，分為兩個(gè)階段，發(fā)酵第一階段菌體培養(yǎng)階段0-72小時(shí)，26-28°C，發(fā)酵第二階段代謝產(chǎn)物生產(chǎn)72-100小時(shí)，23-25'C;通氣量(V/V):0-20小時(shí):1:0.6;20-40小時(shí)1:0.8;40-80小時(shí)1:1.2，80小時(shí)以后1:0.6;攪拌速度250-300，;初始pH值控制為6.5-6.8，前24小時(shí)維持在初始值；(3)發(fā)酵醪用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7.5，悶罐過夜，滅菌紗布真空過濾，得濾液，密封包裝，即成。實(shí)施例2應(yīng)用實(shí)施例①應(yīng)用實(shí)施例產(chǎn)品(以下稱"T216激活劑")進(jìn)行田間試驗(yàn)(該試驗(yàn)是在長沙市馬坡嶺湖南省蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場進(jìn)行)，將T216激活劑按2(m(V/V)添加到浸種液浸泡豇豆種子4小時(shí)，然后采用常規(guī)方法播種，管理。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1T216激活劑不同處理菌株在豇豆上顯瘤能力<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(注表中數(shù)據(jù)為有50%豇豆根系出現(xiàn)根瘤或固氮能力的天數(shù)，不為平均數(shù))由表1可以看出，經(jīng)T216激活劑處理后，根瘤菌對豇豆根部的親和力和侵染力都強(qiáng)于對照清水處理的，使寄主較多地形成結(jié)瘤原基(比對照增加了47.89%)，并促進(jìn)寄主提前顯瘤，較對照提早5d具有固氮活性。表2T216激活劑不同處理根瘤菌對豇豆結(jié)瘤的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(注:表中數(shù)據(jù)均為20株的平均值)表2所示試驗(yàn)結(jié)果表明，T216激活劑處理土著根瘤菌后，可促進(jìn)根瘤菌對寄主豇豆的識別、侵染，使寄主較多、較大地形成根瘤，并提前進(jìn)入固氮期；經(jīng)處理豆科作物所結(jié)根瘤數(shù)為對照的1.54倍，根瘤干重是對照的1.44倍。表3對豇豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表3可知，經(jīng)T216處理的土著根瘤菌所結(jié)根瘤中豆血紅蛋白含量提高1.54倍，含鐵量提高l.16倍，固氮酶活性提高1.65倍。表4:對豇豆田間產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表4可知，經(jīng)T216激活劑處理的土著根瘤菌接種，其產(chǎn)量前期增產(chǎn)12.5%，后期增產(chǎn)16.81%。實(shí)施例3應(yīng)用實(shí)施例②將T216激活劑與水按1:5(體積比)的比例稀釋，對花生種子浸種6小時(shí)。供試花生品種為珍珠豆型品種花120。試驗(yàn)地為已經(jīng)多年水改旱、上年春夏種植花生后冬閑的水稻田?；ㄉ綁欧謳?寬度200cm)栽培，5月30日播種，行株距30X20cm，每兜播2粒種子，采用本土蓋籽。在播種前5d，每公頃一次性基施尿素和氯化鉀各75kg，過磷酸鈣525kg。小區(qū)面積20m，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。田間調(diào)查和室內(nèi)考種按花生試驗(yàn)調(diào)查的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。成熟收獲時(shí)調(diào)査成苗情況、根瘤數(shù)并考種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表5、表6所示。收獲時(shí)經(jīng)T216激活劑浸種處理的比對照增產(chǎn)24.3%，每株根瘤數(shù)增加ll.4%，明顯刺激了土著根瘤菌結(jié)瘤能力，使花生果實(shí)顆粒大小均勻，飽果數(shù)提高8%左右，花生品質(zhì)得到改善。豆血紅蛋白和固氮酶活性顯著提高。表5:生物源T216激活劑對花生經(jīng)濟(jì)性狀與結(jié)瘤能力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6:對花生根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例4生物源T216激活劑對土著根瘤菌生物學(xué)特性的影響(1)土著根瘤菌獲得采集田間自然條件下生長的初花期豇豆植株，摘取其上的新鮮、飽滿、個(gè)大的根瘤，用自來水沖洗干凈后，放入759()酒精浸泡lmin，滅菌水沖洗3次后，再放于O.1%氯化汞溶液中表面消毒5min，滅菌水沖洗數(shù)次后，將根瘤放到滅過菌的并裝有少量滅菌生理鹽水(l升水中加8.5克氯化鈉)的研缽中，用玻璃棒壓碎根瘤；用接種環(huán)沾取根瘤液汁在含有剛果紅的Y.E.M.培養(yǎng)基的平板上劃線，把培養(yǎng)皿放在28"C下培養(yǎng)，然后沿著劃線觀察是否出現(xiàn)典型的根瘤菌菌落，并對菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)、鑒定。所用Y.E.M.培養(yǎng)基的成分為磷酸氫二鉀0.5克；硫酸鎂0.2克；氯化鈉0.1克；甘露醇10克；酵母浸出液0.3克；蒸餾水900毫升。固體培養(yǎng)基加入17克瓊脂。(2)將T216激活劑按10%比例加入Y.E.M.培養(yǎng)基，設(shè)加入同量無菌水作對照，觀察出發(fā)菌株與經(jīng)處理的菌株的生物學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)確定，經(jīng)T216激活劑處理的土著根瘤細(xì)菌一是能加快根瘤菌的分裂，增強(qiáng)根瘤菌的生長、繁殖速率，二是其耐酸性得到了顯著增強(qiáng)。三是其抗逆性得到增強(qiáng)，與出發(fā)菌株相比，經(jīng)T216激活劑處理的根瘤菌大多表現(xiàn)出對抗生素、各類染料、鹽堿及高溫較強(qiáng)的耐受性。四是其代謝能力發(fā)生一些變化，在對碳源利用方面，各菌株表現(xiàn)較為一致。對碳源能利用的范圍都較廣泛，基本上沒有選擇性，不僅能利用己糖、五碳糖、三碳糖，而且能利用乳糖等雙糖。對氮源的利用方面表現(xiàn)也較為一致,均能利用a—鳥氨酸、半胱氨酸、谷氨酸；幾乎均不能利用丙氨酸和甘氨酸，而對賴氨酸利用能力較差；對天冬氨酸的利用則表現(xiàn)出差異性。將經(jīng)T216激活劑處理的土著根瘤菌與加入同量無菌水到液體培養(yǎng)基的土著根瘤菌，保溫?fù)u瓶培養(yǎng)48小時(shí)，混合接種到滅菌土的盆栽豇豆，待其長出根瘤，隨機(jī)挑取根瘤，提取其DNA，通過AFLP分子指紋技術(shù)測定兩種根瘤菌競爭結(jié)瘤的能力。結(jié)果表明(參見附圖l)，與T216激活劑處理的根瘤菌AFLP譜帶相同的根瘤數(shù)26個(gè)，占總瘤數(shù)的61.67%，而與出發(fā)土著根瘤菌AFLP譜帶相同的根瘤數(shù)則為16個(gè)，占總瘤數(shù)的38.33%。經(jīng)T216激活劑處理的根瘤菌競爭結(jié)瘤能力為對照的1.53倍，且經(jīng)T216激活劑處理后的土著根瘤菌所結(jié)根瘤也多為有效根瘤。權(quán)利要求1、一種增強(qiáng)土著根瘤菌固氮能力的生物源激活劑，其特征在于，采用以下方法制成(1)將保藏編號為CCTCC№M207141的哈茨木霉Trichodermaharzianum菌株T216接種到裝有150mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于27±1℃下轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)60小時(shí)，作為發(fā)酵種子用；液體培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO·7H2O0.5g，CaCO30.25g，(NH4)2SO42g，水1000mL，PH自然，經(jīng)115℃滅菌15-20分鐘；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵將第(1)步所得木霉菌種子培養(yǎng)液按10％(V/V)的接種量接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵控制參數(shù)為溫度控制，分為兩個(gè)階段，發(fā)酵第一階段，即菌體培養(yǎng)階段0-72小時(shí)，26-28℃；發(fā)酵第二階段，即代謝產(chǎn)物生產(chǎn)階段72-100小時(shí)，23-25℃；通氣量(V/V)0-20小時(shí)1∶0.6；20-40小時(shí)1∶0.8；40-80小時(shí)1∶1.2，80小時(shí)以后1∶0.6；攪拌速度250-300rpm；初始pH值控制為6.5-6.8，前24小時(shí)維持在初始值；發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分1.5-2.0％麥麩汁液，0.5-1.0％葡萄糖，2.0-3.0％玉米粉，1.0-2.0％酵母膏，0.1-0.5％CaCO3，0.01-0.03％MgSO4，0.5-0.8％KH2PO4和K2HPO4，pH值為6.5-6.8，余量為水；通入蒸氣達(dá)121℃在位滅菌30分鐘；所述百分比均為重量百分比；(3)發(fā)酵完成后，發(fā)酵液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7-8，悶罐過夜，滅菌紗布真空過濾，得濾液，密封包裝，即成。全文摘要一種增強(qiáng)土著根瘤菌固氮能力的生物源激活劑，其采用以下方法制成(1)哈茨木霉菌株T216母種斜面培養(yǎng)；(2)發(fā)酵罐發(fā)酵；(3)發(fā)酵完成后，發(fā)酵液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7-8，悶罐過夜，滅菌紗布真空過濾，得濾液，密封包裝。在豆科作物播種前，將本發(fā)明之生物源激活劑按20-30％(體積比)添加入浸種液浸泡種子4-6小時(shí)，或在豆科作物幼苗移栽時(shí)，用清水稀釋4-5倍的生物源激活劑浸根半小時(shí)，作物生長期間，能誘導(dǎo)土著根瘤菌結(jié)瘤固氮能力顯著增強(qiáng)。文檔編號C12N1/14GK101255400SQ20071030342公開日2008年9月3日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日發(fā)明者梁志懷,申愛榮,羅赫榮,陳玉榮,林魏,魏寶陽申請人:湖南省植物保護(hù)研究所