專利名稱：：一種高產(chǎn)膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌，屬于微生物菌株
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：膽固醇是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞膜的必需組分。在人體中它主要存在于血漿、肝、腎上腺以及細(xì)胞合成的脂質(zhì)混合物中，它是動(dòng)物脂質(zhì)代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)，可調(diào)節(jié)消化道對(duì)脂肪的吸收，并且是膽汁酸、類固醇激素和維生素D生物合成的前體物質(zhì)。血漿中膽固醇的水平是人體健康狀況的重要生理指標(biāo)，人體的心、腦、血疾病很多都與血液中的膽固醇含量有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、膽石癥等。因此近二十年來(lái)，過(guò)量膽固醇可能危害人體健康已成為國(guó)際食品醫(yī)學(xué)界的熱門(mén)話題。膽固醇氧化酶(COD，EC1丄3.6)是膽固醇代謝途徑第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能專一性的催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮(膽甾烯酮)和H202。膽固醇氧化酶在食品開(kāi)發(fā)、醫(yī)療保健、臨床檢測(cè)、生物農(nóng)藥等方面具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。例如在食品開(kāi)發(fā)中，膽固醇氧化酶可以應(yīng)用來(lái)轉(zhuǎn)化、降低食品中的膽固醇含量。膽甾-4-烯-3-酮是一系列固醇類激素藥物的前體，據(jù)報(bào)道其本身也具有抗肥胖以及治療肝病的效果，同時(shí)囟為膽固醇氧化酶能特征性的與膽固醇反應(yīng)，它還可以用來(lái)檢測(cè)血清膽固醇含量，因而在臨床檢測(cè)方面也有很廣泛的應(yīng)用潛力。另外有研究報(bào)道膽固醇氧化酶可以抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，可以成為一種對(duì)環(huán)境無(wú)危害的生物農(nóng)藥。自從1948年TurfittG.E.首次發(fā)現(xiàn)灰暗諾卡氏菌產(chǎn)生膽固醇氧化酶以來(lái)，已經(jīng)報(bào)道了有多種微生物能夠產(chǎn)生膽固醇氧化酶。目前報(bào)道的能產(chǎn)膽固醇氧化酶的微生物有甾短桿菌Bre-vibacteriumsterolicum(日本)、馬紅球菌Rhodococcusequi.(加拿大)、球殼桿菌5acz'〃wsp-haericus(韓國(guó))、庫(kù)特氏菌《w"/n'aC-5(韓國(guó))、節(jié)桿菌Arthrobacter-82(中國(guó))、桔紅諾卡氏菌7Vocm^arhodochrous(中國(guó))、紅球菌朋。(iococ，sp.(摩洛哥)、大腸桿菌Escherichia(烏克蘭)。1998年，NoriyukiDoukyu通過(guò)假單胞桿菌sp.ST-200發(fā)酵制備膽固醇氧化酶，酶活15.2U/mg。2001年，M.TabatabaeiY等人利用鏈霉菌發(fā)酵，得到酶活23U/mg的純酶。2003年，RitaVarma，SanjayNene，利用鏈霉菌NCIM2421發(fā)酵，得到1.42U/mg的膽固醇氧化酶。2002年，牛天貴，利用馬紅球菌4-2發(fā)酵膽固醇氧化酶，酶比活為:5.27U/mg。2006年廣西大學(xué)王發(fā)合等，以類芽胞桿菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外+LiCl、紫外+光敏試劑(8-mop)物理化學(xué)誘變處理，最后得到一株突變株XUM-IO，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終酶活為221.20U/L。野生菌的產(chǎn)酶能力在300U/L(發(fā)酵液)左右，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求；另外，野生菌產(chǎn)生膽固醇氧化酶必需要由底物誘導(dǎo)，而膽固醇不溶于水，難以在水相培養(yǎng)基中均勻地、穩(wěn)定地分散，也給膽固醇氧化酶的發(fā)酵、分離、應(yīng)用都帶來(lái)了困難。所以，學(xué)者們一直在對(duì)菌種進(jìn)行改造并優(yōu)化發(fā)酵條件，以提高菌種產(chǎn)酶活力、膽固醇氧化酶的分離純化及應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可以在以膽固醇為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中大量積累膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案一種高產(chǎn)膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌，其分類命名為短桿菌(SrevAactehwmsp.)DGCDC-82(choB)，該菌株巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207182。所述的CCTCCNO:M207182菌株，特征為a.利用膽固醇作為唯一碳源生長(zhǎng)；b.在整個(gè)生長(zhǎng)周期菌體均為桔紅色；c.在以膽固醇為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中大量積累膽固醇氧化酶。所述的CCTCCNO:M207182菌株，其是產(chǎn)膽固醇氧化酶的白色甾短桿菌的突變株。本發(fā)明的發(fā)明人以產(chǎn)膽固醇氧化酶的白色甾短桿菌作為出發(fā)菌株，采用誘變劑處理菌體細(xì)胞，獲得了一株顏色突變株，對(duì)這株顏色突變株進(jìn)行了發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)它同時(shí)是膽固醇氧化酶的高產(chǎn)突變株。作為出發(fā)菌株，本發(fā)明發(fā)明人采用了白色甾短桿菌野生菌株。對(duì)出發(fā)菌株的處理中，誘變劑采用了紫外線、亞硝基胍、6QCo、超聲波等一系列物理、化學(xué)誘變劑。對(duì)出發(fā)菌株，按常規(guī)誘變法，用紫外線、亞硝基胍、6QCo處理，再用亞硝基胍結(jié)合超聲波的方法進(jìn)行處理，誘變完之后進(jìn)行篩選，涂布于篩選培養(yǎng)基平板上。30"C培養(yǎng)36-48h，挑選透明圈較大的接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)36h，檢測(cè)其發(fā)酵酶活。從而得到了一株顏色和高產(chǎn)的突變株。用于誘變后突變株篩選的篩選培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基分別為篩選培養(yǎng)基A(g/L):酵母膏0.6，NaCll，瓊脂20，蒸餾水1L，pH7.5。篩選培養(yǎng)基B(g/L):篩選培養(yǎng)基A滅菌后添加顯色法膽固醇氧化酶檢測(cè)液A液(4-氨基-安替比林lmmol/L;苯酚6mmol/L;疊氮鈉0.2g/L;過(guò)氧化物酶5000U/L;磷酸鉀緩沖液25mmol/L,pH7.5)40ml，pH7.5。篩選培養(yǎng)基C(g/L):篩選培養(yǎng)基A滅菌后添加溴百里酚藍(lán)0.04%，pH7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):膽固醇3，酵母膏8，NaCll，CH3COONH42，K2HP040.2,MgS04*7H200.05,FeS04*7H200.01,CaCl20.1,吐溫-803mL，蒸餾水1L，pH7.5。得到的突變株為桔紅色，菌落邊緣整齊，表面光滑、潮濕，發(fā)酵水平較出發(fā)菌株的0.5U/mL提高到1.21U/mL，提高了140%。為鑒定其突變類型，對(duì)出發(fā)菌株和突變株進(jìn)行了16SrDNA同源性比較，測(cè)序結(jié)果表明兩株菌的16SrDNA同源性為100%。為了進(jìn)一步確定其突變型，選擇了部分特征培養(yǎng)基進(jìn)行生理生化鑒定，從表1中可以看出，與出發(fā)菌株相比，突變株的生理生化特征沒(méi)有明顯變化，目前可以確定其突變?yōu)楫a(chǎn)酶提高型和菌落顏色變化的形態(tài)突變型，該型產(chǎn)酶菌株目前沒(méi)有見(jiàn)到公開(kāi)報(bào)道，命名為短桿菌Bv/Z)flcto^wsp.DGCDC-82。表1突變株DGCDC-82生理生化鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>+為利用或陽(yáng)性，-為不利用或陰性在發(fā)酵研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，突變株菌落紅色越深，發(fā)酵產(chǎn)酶越高。為了確定這種偶聯(lián)關(guān)系，對(duì)突變株DGCDC-82進(jìn)行了回復(fù)突變研究。用亞硝基胍聯(lián)合超聲波的方法對(duì)DGCDC-82進(jìn)行誘變處理，誘變后，涂布于基本培養(yǎng)基上，以顏色為篩子篩選到兩株回復(fù)突變株R1和R2。Rl為淡粉色，R2為白色。首先對(duì)這兩株回復(fù)突變株進(jìn)行了生理生化研究，發(fā)現(xiàn)其生理生化特征較DGCDC-82無(wú)明顯變化。又對(duì)兩株回復(fù)突變株進(jìn)行發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)DGCDC-82發(fā)酵在約35h達(dá)到最高酶活1.24U/mL;Rl發(fā)酵在約24h達(dá)到最高酶活，為0.69U/mL;R2發(fā)酵在約24h達(dá)到最高酶活0.17U/mL。這就從反面證明了膽固醇氧化酶與紅色素之間的正相關(guān)偶聯(lián)關(guān)系，紅色素的含量越多發(fā)酵酶活越高，紅色素的含量越少發(fā)酵酶活也越低。這一特征可以作為高產(chǎn)菌種的篩選方法。對(duì)紅色素粗提取后全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)這種紅色素在450nm處有最大吸收，利用這種特殊吸收，采用比色法研究了紅色素含量和發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)系，結(jié)論為兩條曲線成正相關(guān)。膽甾_4-烯-3-酮是COD分解膽固醇的產(chǎn)物。紅色素和產(chǎn)酶成正相關(guān)偶聯(lián)，說(shuō)明酶分解底物后的物質(zhì)趨向于色素的合成，那么膽甾-4-烯-3-酮和色素應(yīng)該成反比關(guān)系。用比色法驗(yàn)證了這一推論，證實(shí)了產(chǎn)酶與紅色素正比的偶聯(lián)關(guān)系。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的高產(chǎn)膽固醇氧化酶的優(yōu)良菌株DGCDC-82。該菌株是在一株白色甾短桿菌的基礎(chǔ)上，主要通過(guò)亞硝基胍結(jié)合超聲波的方法誘變處理得到的。發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)該紅色菌株的產(chǎn)膽固醇氧化酶(COD)活力達(dá)到1.21U/mL，比出發(fā)菌株提高了140%。又采用回復(fù)突變的方法研究了該菌株產(chǎn)酶和紅色素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)酶和紅色素的含量成正相關(guān)關(guān)系，菌體的紅顏色越深，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力也就越高。圖l.不同誘變方法處理出發(fā)菌種致死率圖2.出發(fā)菌株與DGCDC-82發(fā)酵產(chǎn)膽固醇氧化酶比較圖3.回復(fù)突變株與DGCDC-82發(fā)酵酶活比較圖4.紅色素全波長(zhǎng)掃描圖5.DGCDC-82發(fā)酵不同時(shí)間酶活與紅色素的關(guān)系圖6.DGCDC-82發(fā)酵不同時(shí)間膽甾-4-烯-3-酮與紅色素關(guān)系生物材料樣品說(shuō)明本發(fā)明菌株分類命名為短桿菌(SreW6acfen^msp.)DGCDC-82(choB)，該菌株巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007年11月15日，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207182。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:復(fù)合誘變條件的確定超聲波作為物理誘變劑，是輔助的誘變手段，化學(xué)誘變劑NTG為主要誘變手段，需要考察菌濃度，處理時(shí)間、溫度相同的條件下，超聲波、NTG、超聲波輔助NTG對(duì)菌種致死率的影響。以逸擇使致死率較強(qiáng)的誘變處理方案。(1)超聲波誘變處理出發(fā)菌株取活化處理后的菌懸液30mL，平均分裝于六只試管，一只作對(duì)照，另五只采用超聲波(200w，50KHz)處理，每次超聲照射5min，中間停lmin。間歇處理2、3、4、5、6次，處理后，稀釋涂布于種子培養(yǎng)基中，3(TC、培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。(2)NTG誘變處理出發(fā)菌株取活化處理后的菌懸液30mL，平均分裝于六只試管，一只作對(duì)照，另五只采用NTG(lmg/mL)處理，在誘變處理10、15、20、25、30分鐘時(shí)，分別取出一只試管，取0.5mL菌懸液，稀釋100倍，終止誘變，再稀釋至適當(dāng)濃度后涂平板，30。C、24h培養(yǎng)，待形成明顯菌落后計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。(3)復(fù)合誘變處理出發(fā)菌株取6只試管，各分裝己活化處理后的菌懸液5mL，誘變處理，誘變條件為冰水浴中，超聲(200w，50KHz，每次5min，間歇lmin)輔助NTG(lmg/mL)誘變處理菌懸液，超聲間歇處理1、2、3、4、5、6次。每次超聲照射后，取l只試管誘變處理菌液，取0.5mL菌懸液，稀釋100倍，終止誘變，再稀釋至適當(dāng)濃度后涂平板，對(duì)照按與處理菌相同稀釋度涂布種子培養(yǎng)基中，30°C、24h培養(yǎng)，待形成明顯菌落后計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。采用亞硝基胍和超聲波聯(lián)合處理，以致死率為考察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖l。當(dāng)亞硝基胍濃度為lmg/mL，超聲處理35min時(shí)，致死率為90%。故確定復(fù)合誘變的條件為亞硝基胍lmg/mL，200W、50kHz超聲強(qiáng)度處理35min。實(shí)施例2:膽固醇氧化酶活的測(cè)定膽固醇氧化酶酶活測(cè)定采用比色法，其原理是膽固醇在COD的催化下分解成一分子的膽甾-4-烯-3-酮和一分子的H202，H202在過(guò)氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林與苯酚形成亞醌類呈紅色的化合物，它在500nm處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)液在500nm處的吸光值，可定量測(cè)定膽固醇的氧化量，從而計(jì)算出膽固醇氧化酶的酶活單位。3mL溶液A(4-氨基-安替比林lmmol/L;苯酚6mmol/L;疊氮鈉0.2g/L;過(guò)氧化物酶5000U/L;磷酸鉀緩沖液25mmol/L，pH7.5)，150pL溶液B(膽固醇8.26mg/mL;TritonX-1004.26%;異丙醇為溶劑)，50pL酶液，37°C、反應(yīng)5分鐘，沸水浴3分鐘，于500nm測(cè)吸光值。酶活(U/ml"1.6832xA，。實(shí)施例3:16srDNA菌種鑒定取指數(shù)生長(zhǎng)期新鮮菌液，離心收集細(xì)菌，按文獻(xiàn)方法提取基因組DNA。依據(jù)細(xì)菌16SrDNA中最保守的序列設(shè)計(jì)并合成引物，正向引物5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；反向引物5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反應(yīng)條件50)iL體系中含基因組DNAl|iig、20mmol/LTris-HCl(pH8.4)、5Ommol/LKC1、1.5mmol/L、MgCl2、200)imol/LdNTP、正反向引物各500pmol/L、2.5uTaq酶，97。C變性2min后進(jìn)入循環(huán)，94。Clmin，55。Clmin，72TM0min，共35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物的純化按上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明，測(cè)序由上海生工生物技術(shù)公司完成，測(cè)序引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。實(shí)施例4:突變株紅色物質(zhì)提取與全波長(zhǎng)掃描分析取發(fā)酵液100mL，5000r/min離心10min取菌體，菌體懸浮于30mLpH7.0、0.05M磷酸鉀緩沖液，超聲處理(200w，50KHz，間歇處理，每次5min，其間停lmin)。超聲4次后，8000r/min離心取上清，加入20mL甲醇振蕩均勻，靜置2h，8000r/min離心10min，取上清，水浴蒸干，溶解于50mL甲醇溶液，8000r/min離心10min，取上清。權(quán)利要求1.一種高產(chǎn)膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌，其分類命名為短桿菌(Brevibacteriumsp.)DGCDC-82，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM207182。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于a.利用膽固醇作為唯一碳源生長(zhǎng)；b.在整個(gè)生長(zhǎng)周期菌體均為桔紅色；c.在以膽固醇為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中大量積累膽固醇氧化酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于其是產(chǎn)膽固醇氧化酶的白色甾短桿菌的突變株。全文摘要一種高產(chǎn)膽固醇氧化酶的紅色甾短桿菌，屬于微生物菌株
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明菌株分類命名為短桿菌(Brevibacteriumsp.)DGCDC-82(choB)，該菌株巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM207182。本發(fā)明的菌株是在一株白色甾短桿菌的基礎(chǔ)上，主要通過(guò)亞硝基胍結(jié)合超聲波的方法誘變處理得到的。發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)該紅色菌株的產(chǎn)膽固醇氧化酶(COD)活力達(dá)到1.21U/mL，比出發(fā)菌株提高了140％。又采用回復(fù)突變的方法研究了該菌株產(chǎn)酶和紅色素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)酶和紅色素的含量成正相關(guān)關(guān)系，菌體的紅顏色越深，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力也就越高。文檔編號(hào)C12N1/20GK101186897SQ20071030244公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者楊海麟,吉桑,武王,王龍剛,霍惠芝申請(qǐng)人:江南大學(xué)