專利名稱:膽固醇氧化酶發(fā)酵制備工藝的制作方法
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。膽固醇氧化酶在生理條件下能夠氧化膽固醇成為膽甾-4-烯-3-酮及過氧化氫。由于它對膽固醇有專一性反應(yīng)，因此利用此反應(yīng)及其他輔助反應(yīng)，可以測定血清中游離膽固醇的含量，反應(yīng)過程如下膽固醇+O2(膽固醇氧化酶)/() 膽甾-4-烯-3-酮+H2O22H2O2+4-氨基安替比林+酚 (過氧化氫酶)/() 醌亞胺色素+4H2O以上反應(yīng)原理現(xiàn)在已經(jīng)普遍應(yīng)用于臨床診斷，是測定人血清中膽固醇含量的快速、靈敏、正確的方法。在上述反應(yīng)中，于37℃時，每分鐘能把1微克分子膽固醇按上述反應(yīng)轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮和過氧化氫的酶量定為1酶活單位。
1948年Turfit指出Proactinomyces erythropelia菌株能分解膽固醇為4-甾醇烯-3酮的代謝物，1973年W.Richmard由Nocardia菌屬中分離得到膽固醇氧化酶，其后H。M。Flegg從細菌中篩選獲得膽固醇氧化酶，因而從70年代開始，美、德、日本先后從細菌、諾卡氏菌、霉菌中生產(chǎn)膽固醇氧化酶，以替代化學(xué)試劑應(yīng)用于臨床，具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點，但是，在多烯類的產(chǎn)生菌中生產(chǎn)膽固醇氧化酶至今未見報導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是為得到符合臨床分析要求的膽固醇氧化酶。系采用經(jīng)過生理生化特征和形態(tài)培養(yǎng)特征鑒別為球孢鏈霉菌(Strep-tomyces globisporus)C-412菌種接種于含有3%黃豆餅粉水解液、1%葡萄糖、0.5%酵母膏、2.0%甘油、0.1%K2HPO4、0.1%碳酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基中或接種到含有1-4%葡萄糖、0.1-1%可溶性淀粉、0.1-1%酵母粉、0.1-1%Ca2CO3、1-5%黃豆餅粉水解液的培養(yǎng)基中、加入用表面活性劑預(yù)處理過的各種誘導(dǎo)劑在通氣攪拌的條件下，提高發(fā)酵產(chǎn)酶單位，發(fā)酵液經(jīng)過分離、提取、鹽析、透析、柱層析等步驟，所得的酶穩(wěn)定性好，可以保存一年半時間，該酶試劑用于臨床分析，檢測準(zhǔn)確率高，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。
實例一將Streptomyces globisporus C-412砂土孢子接種于淀粉-硝酸鉀的高氏合成一號孢子斜面培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7-10天后挖取適量成熟的斜面孢子接種于100毫升的種子培養(yǎng)液的750毫升三角瓶中、搖床220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)28℃48-72小時，然后將所得菌絲以1-5%種量接種至裝有4公斤的玻璃發(fā)酵罐中250-300轉(zhuǎn)/分，通氣1∶0.5v/v/min，28℃培養(yǎng)24-36小時，培養(yǎng)完畢，取10ml的定量發(fā)酵液、離心棄上清液再用蒸餾水洗滌離心棄上清液，加入Tris-HCl緩沖液至10ml，按照Richmond方法，測出在發(fā)酵液中能產(chǎn)生膽固醇氧化酶，經(jīng)測定其酶活力為0.1毫升的菌絲浸泡液具有0.6-0.7的OD值。
實例二將球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)C-412菌種接入3-5立升種子液培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖1%、可溶性淀粉2%、豆餅粉水解液2%、酵母粉1%、PH6.5 26℃培養(yǎng)72小時。
將培養(yǎng)好的種子液加入到50立升發(fā)酵罐中，罐內(nèi)培養(yǎng)基成份為4%黃豆餅粉水解液、2%葡萄糖、0.1%K2HPO4、0.5%誘導(dǎo)劑L-10，PH6.5，于26℃通氣、攪拌培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)完畢，收集菌體。
發(fā)酵液30立升經(jīng)分離后得菌絲體，加含有表面活性劑Tris-HCl緩沖液11立升提取，提取液以硫酸銨分級沉淀，沉淀溶解后得1.1立升酶液，該酶液通過裝有DEAE纖維素的層析柱吸附，酶液全部通過后以低濃度的Tris-HCl緩沖液洗滌層析柱，然后用相同的Tris-HCl緩沖液濃度梯度洗脫，分部收集酶活部分，每立升發(fā)酵液得200單位酶活，總收率為28%，提純6倍。
實例三將球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)C-412菌種接入裝有30立升種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，種子培養(yǎng)基配方為2%葡萄糖、1%可溶性淀粉、5%黃豆餅粉水解液、2%酵母粉，PH6.5于26℃通氣攪拌培養(yǎng)48-72小時。
將培養(yǎng)好的種子液加入到200立升發(fā)酵罐中，罐內(nèi)培養(yǎng)基成分為2%黃豆餅粉水解液、3%葡萄糖、1%K2HPO4、0.1%蛋白胨、0.6%誘導(dǎo)劑L-10，PH6.5于26℃通氣攪拌培養(yǎng)25小時，收集菌絲體，經(jīng)提取、鹽析、透析、柱層析得膽固醇氧化酶，每立升發(fā)酵液得300單位酶活，總收率30%。提純7倍。
④文件名稱 頁 行 補正前 補正后說明書 1 13 4-甾醇烯-3 膽-4-烯-3酮 -酮說明書 1 18 在多烯類的產(chǎn)生 在多烯類抗生素的菌中 產(chǎn)生菌中權(quán)利要求
書 1 17 2、按權(quán)利要求 2、按權(quán)利要求
11所述誘導(dǎo)劑L 所述的那種利用發(fā)-10為…… 酵工程制備膽固醇氧化酶的工藝，其特征是誘導(dǎo)劑L-10……
權(quán)利要求
1.一種利用發(fā)酵工程制備膽固醇氧化酶的工藝，本發(fā)明的特征在于將球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)C-412的菌種，經(jīng)配方為4%葡萄糖、2%黃豆餅粉水解液、0.5%酵母膏、0.5%可溶性淀粉、0.2%碳酸鈣的種子培養(yǎng)基100毫升置三角瓶中，于旋轉(zhuǎn)搖床220轉(zhuǎn)/分，28℃培養(yǎng)48-72小時，再經(jīng)配方為3%黃豆餅粉水解液、1%葡萄糖、0.5%酵母膏、2.0%甘油、0.1%K2HPO4、0.1%碳酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基、28℃24-36小時，分離菌絲體或經(jīng)配方為1-4%葡萄糖、0.1-1%可溶性淀粉、1-5%豆餅粉水解液、0.5%-2%酵母粉，L-10 0.1-10%誘導(dǎo)劑PH6-9的種子培養(yǎng)基在溫度25～35℃通氣攪拌培養(yǎng)48-72小時，再經(jīng)組份為1-4%葡萄糖、1-5%豆餅粉水解液、0.1-1%K2HPO4、0.1-0.5%蛋白胨、0.1-0.8%誘導(dǎo)劑L-10PH6-9的發(fā)酵培養(yǎng)基在溫度25-35℃發(fā)酵培養(yǎng)18-30小時分離菌絲體、再經(jīng)提取、鹽析、透析、柱層析精制獲得膽固醇氧化酶。
2.按權(quán)利要求
1所述的誘導(dǎo)劑L-10為各種酯類、油類、聚氧乙烯醚類和表面活性劑，其中酯類是豆磷酯、卵磷酯、膽固醇油酸酯、膽固醇亞油酸酯，其中油類為豆油和花生油。
3.按權(quán)利要求
2所述的誘導(dǎo)劑L-10中的表面活性劑為吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。將球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)C—412，經(jīng)過培養(yǎng)、發(fā)酵得到有酶活的菌體，通過分離、提取、精制制備膽固醇氧化酶。該酶的穩(wěn)定性好，可以保存一年半時間。該酶試劑可供臨床化驗，用于檢測血清中膽固醇，檢測準(zhǔn)確率高，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。
文檔編號C12N9/04GK86100555SQ86100555
公開日1987年10月21日 申請日期1986年4月10日
發(fā)明者徐月美, 楊光禮 申請人:國家醫(yī)藥管理局上海醫(yī)藥工業(yè)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan