一種檢測膽固醇的酶生物傳感器及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于電化學生物傳感器【技術領域】，具體涉及一種檢測膽固醇的酶生物傳感器及其制備方法與應用。所述酶生物傳感器采用經(jīng)典的三電極體系，其中工作電極上固化特定的物質識別酶膜，所述物質識別酶膜主要由石墨烯、硫堇、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶及殼聚糖混合制備而成。所述酶生物傳感器的制備方法為首先將硫堇溶液、石墨烯的殼聚糖溶液、辣根過氧化物酶溶液和膽固醇氧化酶溶液混合均勻，然后滴加到已處理過的工作電極上，再與參比電極及對電極組成三電極體系，得到所述酶生物傳感器。本發(fā)明所述酶生物傳感器具有經(jīng)濟、簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，且制備簡單，可用于膽固醇的定量檢測。
【專利說明】—種檢測膽固醇的酶生物傳感器及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學生物傳感器【技術領域】，具體涉及一種檢測膽固醇的酶生物傳感器及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及留體激素的原料。但隨著發(fā)展水平的提高，膽固醇異常的發(fā)病率呈增長趨勢?，F(xiàn)代研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，心臟病、糖尿病、動脈粥樣硬化、靜脈血栓、膽石癥等與高膽固醇血癥有密切的關系。因此膽固醇的快速測定方法具有重要意義。目前，臨床檢驗中普遍采用的是以分光光度計為基礎的酶比色法。但該方法用酶量大，所用儀器復雜，檢測時間長，干擾因素多，不適合患者家中自測。因此，研發(fā)一種簡單、方便、快速、準確、經(jīng)濟地測定膽固醇含量的方法是所趨之勢。
[0003]近幾十年來，酶生物傳感器是有關研究人員研究的熱點，也得到了迅速發(fā)展。但由于大多數(shù)酶的活性中心深埋在酶蛋白內部，再加上酶本身比較脆弱，易失活變性，電子隧道的距離等原因，都不易實現(xiàn)酶氧化還原中心與電極之間的電子傳遞。因此，目前發(fā)展的重心是尋找合適的載體、介體與酶的固定方法。研究人員已經(jīng)嘗試了各類修飾電極的載體、介體和酶的固定方法。膽固醇生物傳感器的載體用的最多的是碳納米管。[參考:(a) Yu-ChenTsai,Siao-YunChen,Chen-An Lee.Sensors and Actuators B135(2008)96-101.(b)G.Li,J.M.Liao,G.Q.Hu,N.Z.Ma,P.J.ffu.Biosensors and Bioelectronics20 (2005)2140-2144.(c)Xiaojun Cai, Xia Gao, Lisha Wang, Qi ffu, Xianfu Lin.Sensors and Actuators B181(2013)575-583.]。膽固醇生物傳感器的介體為用普魯士藍和聚合物(比如聚苯胺)，它們具有良好的導電能力，能提高酶與電極間的電子傳遞速率。[參考:(d) Xuecai Tan, MinjianLi,Peixiang Cai,Lijun Luo,Xiaoyong Zou.AnalyticalBiochemistry337(2005)111-120.(e)Suman Singh,Pratima R.Solanki,M.K.Pandey,B.D.Malhotra.Sensors and ActuatorsB115 (2006)534-541.]。酶的固定多用具有良好成膜性和生物相容性的殼聚糖[參考:(f)Changzhi Zhao, Li Wan, Li Jiang, Qin Wang, Kui Jia0.Analytical Biochemistry383(2008)25-30.)]。除此之外，物理、化學性能優(yōu)良的碳納米材料石墨烯，有較大的比表面積，優(yōu)良的導電性和載體特性，硫堇是被廣泛應用的電子傳介體，具有快速傳遞電子能力，都有被應用于葡萄糖、過氧化氫生物傳感器的制備，但膽固醇生物傳感方面的應用還尚未報道。

【發(fā)明內容】

[0004]為克服目前技術的不足及缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有良好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性的用于檢測膽固醇的酶生物傳感器；
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述酶生物傳感器的制備方法；
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述酶生物傳感器的應用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):[0008]—種檢測膽固醇的酶生物傳感器，由參比電極、對電極及修飾后的工作電極組成，所述修飾后的工作電極由工作電極及固化在工作電極表面的物質識別酶膜組成，其中，所述物質識別酶膜主要由石墨烯、硫堇、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶及殼聚糖混合制備而成；
[0009]所述物質識別酶膜為將I?5mg/mL的石墨烯-殼聚糖溶液、5?10mmol/L的硫堇水溶液、20?30mg/mL的膽固醇氧化酶水溶液及10?20mg/mL的辣根過氧化物酶水溶液混合后干燥制得；
[0010]優(yōu)選的，所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液、辣根過氧化物酶水溶液的體積比為1:1:1:1;
[0011]優(yōu)選的，所述工作電極為玻碳電極，所述參比電極為飽和甘汞電極或Ag/AgCl參比電極，所述對電極為鉬電極。
[0012]上述檢測膽固醇的酶生物傳感器的制備方法，包括如下步驟:首先將石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液混合均勻，得復合酶溶液；然后取復合酶溶液滴加到經(jīng)表面預處理的工作電極的表面，晾干后得到修飾后的工作電極；將所述修飾后的工作電極、參比電極及對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0013]上述檢測膽固醇的酶生物傳感器的制備方法，其具體步驟為:
[0014](I)在ImL質量分數(shù)為0.5%?2%的殼聚糖醋酸溶液中加入I?5mg石墨烯，超聲分散I?2h，得到石墨烯含量為I?5mg/mL的石墨烯-殼聚糖溶液；
[0015](2)分別配制5?10mmol/L的硫堇水溶液、20?30mg/mL的膽固醇氧化酶水溶液及10?20mg/mL的辣根過氧化物酶水溶液；
[0016](3)對工作電極進行表面預處理；
[0017](4)將步驟(I)與步驟(2)中所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按比例混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液3?5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0018](5)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0019]優(yōu)選的，步驟(I)所述的石墨烯的制備方法如下:取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯。
[0020]優(yōu)選的，步驟(3)所述的表面預處理的具體操作為:首先將工作電極的表面依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，再用水沖洗；然后依次在無水乙醇和水中分別超聲清洗lmin，取出用水洗凈，晾干；然后將晾干的工作電極置于0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化。[0021]優(yōu)選的，步驟(4)中所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液、辣根過氧化物酶水溶液的體積比為1:1:1:1 ;步驟(4)及步驟(5)中所述工作電極為玻碳電極，所述參比電極為飽和甘汞電極或Ag/AgCl參比電極，所述對電極為鉬電極。
[0022]上述檢測膽固醇的酶生物傳感器在膽固醇定量檢測中的應用。
[0023]本發(fā)明的原理:
[0024]本發(fā)明首先是將石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液混合均勻；然后，利用殼聚糖的包埋作用，將辣根過氧化物酶和膽固醇氧化酶包埋起來，并利用石墨烯的載體特性，負載更多的酶，
[0025]以利于對底物的催化；最后，取適量混合液滴于已表面預處理的工作電極上，
[0026]得到修飾后的工作電極；再利用所述的修飾后的工作電極，配合參比電極與對電極組成三電極體系，制得一種新型的檢測膽固醇的酶生物傳感器。硫堇是一種良好的電子傳遞體，經(jīng)電聚合后形成聚合膜穩(wěn)定性好，不易流失，且具有快速傳遞電子的能力，能夠實現(xiàn)電子的間接轉移。
[0027]本發(fā)明將石墨烯納米材料和硫堇介體結合，制備得到的檢測膽固醇的酶生物傳感器生物，檢測性能好，檢測線性范圍為y=2.91498+5.93126x，檢測限6X 10_7mol/L。
[0028]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
[0029](I)本發(fā)明所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器具有良好的電子傳遞性，能將反應產生的電子進行良好的轉移，能實現(xiàn)酶與電極之間的電子傳遞，提高所述酶生物傳感器的反應速度。
[0030](2)本發(fā)明所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器具有良好的包埋效果，將識別作用的酶很好的包埋在電極上，不易脫落，延長所述酶生物傳感器的使用壽命。
[0031](3)本發(fā)明所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器具有良好的負載效果，將更多的酶負載到工作電極上，可利于反應的發(fā)生，提高所述酶生物傳感器的靈敏度。
[0032](4)本發(fā)明所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器具有良好的選擇性，可對膽固醇進行準確檢測，抗干擾能力強。
[0033](5)本發(fā)明所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器的制備方法所用原料少、成本較低，且反應可在室溫中性環(huán)境中進行，制備工藝簡單、安全。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為所述酶生物傳感器的整體結構示意圖，其中I為修飾后的工作電極，2為參比電極，3為對電極，4為待測液。
[0035]圖2為所述修飾后的工作電極的剖面示意圖，其中1-1為工作電極，1-2為物質識別酶膜。
[0036]圖3為所述酶生物傳感器不同濃度膽固醇的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線圖，圖中方框內為磷酸鹽緩沖溶液中膽固醇的添加濃度。
[0037]圖4為所述酶生物傳感器對不同濃度膽固醇的響應電流的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0039]實施例1
[0040]一種檢測膽固醇的酶生物傳感器，整體結構示意圖如圖1所示，由參比電極2、對電極3及修飾后的工作電極I組成；修飾后的工作電極I的剖面示意圖如圖2所示，所述修飾后的工作電極I由工作電極1-1及固化在工作電極表面的物質識別酶膜1-2組成，其中，所述物質識別酶膜1-2主要由石墨烯、硫堇、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶及殼聚糖混合制備而成；
[0041]所述物質識別酶膜1-2為取I~5mg/mL的石墨烯-殼聚糖溶液、5~10mmol/L的硫堇水溶液、20~30mg/mL的膽固醇氧化酶水溶液及10~20mg/mL的辣根過氧化物酶水溶液混合后干燥制得；
[0042]優(yōu)選的，所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液、辣根過氧化物酶水溶液的體積比為1:1:1:1;
[0043]優(yōu)選的，所述工作電極I為玻碳電極，所述參比電極2為飽和甘汞電極或Ag/AgCl參比電極，所述對電極3為鉬電極。
[0044]將所述檢測膽固醇的酶生物傳感器放入待測液4中，可檢測待測液4中膽固醇的含量。
[0045]實施例2
[0046]—種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0047](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0048](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0049](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U (21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0050](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0051](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟
(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；[0052](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0053]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0054]采用循環(huán)伏安法對實施例2制備的酶生物傳感器進行測試，具體步驟為:室溫下，將所述檢測膽固醇的酶生物傳感器的三個電極浸入濃度為0.02mol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，往所述磷酸鹽緩沖溶液中不斷加入膽固醇，加入濃度為5.0Xl(T6mol/L到3.4X10_4mol/L，采用循環(huán)伏安法進行電化學測試，采用循環(huán)伏安時的掃速為50mV/s，掃描電位范圍為-0.4~0.2V。
[0055]循環(huán)伏安法測試結果:
[0056]圖3是在0.02mol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，不斷加入膽固醇得到的循環(huán)伏安曲線。從圖3可以看出，所述檢測膽固醇的酶生物傳感器在含膽固醇的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線的還原峰明顯大于不含膽固醇的磷酸鹽緩沖溶液中的還原峰。氧化峰減小，表明由于本發(fā)明所述酶生物傳感器中的膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶的催化，所述酶生物傳感器可對溶液中的膽固醇產生靈敏的電流響應。從圖3中可見，隨著膽固醇濃度的增加，電流響應也在不斷增大，電極表面實現(xiàn)了快速的電子轉移。
[0057]圖4所示的是本發(fā)明所述酶生物傳感器對不同濃度膽固醇的響應電流的標準曲線。膽固醇濃度在5.0X 10_6~3.4X 10_4mol/L內，響應電流與膽固醇濃度成線性關系。線性回歸方程為:y=2.91498+5.93126x，R2=0.99880，檢出限為 6X l(T7mol/L(信噪比為 3)。因此，本發(fā)明所述酶生物傳感器可用于膽固醇的定量檢測。
[0058]實施例3
[0059]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0060](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0061](2)稱取0.005g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為0.5%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為0.5%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0062](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U (21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0063](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0064](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0065](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0066]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0067]實施例4
[0068]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0069](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并 用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0070](2)稱取0.06g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為2%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為2%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0071](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U (21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0072](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0073](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0074](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0075]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0076]實施例5
[0077]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0078](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化墨稱取Ol所述氧化墨溶解于O蒸餾水中超聲60i得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼,反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0079](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入5mg石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為5mg / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0080](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U (21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0081](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0082](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0083](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感 器。
[0084]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0085]實施例6
[0086]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0087](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0088](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入3mg石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為3mg / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0089](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U (21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。[0090](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0091](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0092](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0093]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0094]實施例7
[0095]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0096](1)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入23 0mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0097](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC≥95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0098](3)稱取4.3mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成5mmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U(21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0099](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0100](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0101](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0102]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0103]實施例8
[0104]一種用于檢測 膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:[0105](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0106](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC ^ 95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0107](3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 84.8U(21.2U/mg)，加入0.2mL蒸懼水，配制成20mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040) 500U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成IOmg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0108](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0109](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0110](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0111]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快,檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0112]實施例9
[0113]一種用于檢測膽固醇的酶生物傳感器，其制備方法如下:
[0114](I)取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸，置于4°C的冰水浴中攪拌30min ;然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行多次洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸懼水中，超聲60min,得到穩(wěn)定的石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，并用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中充分干燥，即得到石墨烯；
[0115](2)稱取0.03g殼聚糖(T0060，DAC ^ 95%)加入到3mL濃度為0.lmol/L的醋酸溶液中，得質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液；取ImL所述質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，加入Img石墨烯，超聲分散2h，得到石墨烯含量為Img / mL的石墨烯-殼聚糖溶液。
[0116] (3)稱取8.6mg硫堇,加入3mL蒸懼水,配制成IOmmol / L的硫堇水溶液；稱取膽固醇氧化酶(Sigma) 127.2U(21.2U/mg),加入0.2mL蒸懼水,配制成30mg / mL的膽固醇氧化酶水溶液；稱取辣根過氧化物酶(Roche M0040)1000U (250U/mg)，加入0.2mL蒸餾水，配制成20mg / mL的辣根過氧化氫酶水溶液。
[0117](4)將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗，然后依次在無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗lmin，再將玻碳電極置于
0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化，取出用蒸餾水沖洗，晾干。
[0118](5)將所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按1:1:1:1的體積比混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液3 μ L滴加到步驟
(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極；
[0119](6)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
[0120]所述檢測膽固醇的酶生物傳感器響應時間短，反應速度快，檢出限較低，靈敏度高，檢測范圍寬，可檢測較大范圍的膽固醇的含量。
[0121 ] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種檢測膽固醇的酶生物傳感器，由參比電極、對電極及修飾后的工作電極組成，所述修飾后的工作電極由工作電極及固化在工作電極表面的物質識別酶膜組成，其特征在于:所述物質識別酶膜主要由石墨烯、硫堇、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶及殼聚糖混合制備而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器，其特征在于:所述物質識別酶膜為將I~5mg/mL的石墨烯-殼聚糖溶液、5~10mmol/L的硫堇水溶液、20~30mg/mL的膽固醇氧化酶水溶液及10~20mg/mL 的辣根過氧化物酶水溶液混合后干燥制得。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器，其特征在于:所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液、辣根過氧化物酶水溶液的體積比為1:1:1:1。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器，其特征在于:所述工作電極為玻碳電極，所述參比電極為飽和甘汞電極或Ag/AgCl參比電極，所述對電極為鉬電極。
5.一種根據(jù)權利要求1~4任一項所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器的制備方法，其特征在于包括如下步驟:首先將石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液混合均勻，得復合酶溶液；然后取復合酶溶液滴加到經(jīng)表面預處理的工作電極的表面，晾干后得到修飾后的工作電極；將所述修飾后的工作電極、參比電極及對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于具體步驟為: (1)在ImL質量分數(shù)為0.5%~2%的殼聚糖醋酸溶液中加入I~5mg石墨烯，超聲分散I~2h，得到石墨烯含量為I~5mg/mL的石墨烯-殼聚糖溶液； (2)分別配制5~10mmol/L的硫堇水溶液、20~30mg/mL的膽固醇氧化酶水溶液及10~20mg/mL的辣根過氧化物酶水溶液； (3)對工作電極進行表面預處理； (4)將步驟(1)與步驟(2)中所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液及辣根過氧化物酶水溶液按比例混合均勻得復合酶溶液，取復合酶溶液3~5 μ L滴加到步驟(3)所述表面預處理后的工作電極的表面，室溫晾干，得到修飾后的工作電極； (5)將所述修飾后的工作電極與參比電極和對電極組成三電極體系，得到所述檢測膽固醇的酶生物傳感器。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的石墨烯的制備方法為:取5g鱗片石墨和2g NaNO3進行混合，加入120mL濃硫酸,置于4°C的冰水浴中攪拌30min ；然后加入20gKMn04，磁力攪拌反應60min，再移入40°C溫水浴中繼續(xù)反應30min ;然后加入230mL蒸餾水，于95°C的溫度條件攪拌5min，再加入質量分數(shù)為5%的雙氧水，至不產生氣泡，趁熱過濾，并用去離子水和質量分數(shù)為5%的鹽酸進行洗滌；然后透析一周，再在60°C真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；稱取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸餾水中，超聲60min，得到石墨分散液；加熱所述石墨分散液至80°C并滴加2mL水合肼，反應4h后過濾，再用甲醇和蒸餾水沖洗，然后在60°C真空干燥箱中干燥，即得到石墨烯。
8.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的表面預處理的具體操作為:首先將工作電極的表面依次用直徑為0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3粉末拋光成鏡面，再用水沖洗；然后依次在無水乙醇和水中分別超聲清洗lmin，取出用水洗凈，晾干；然后將晾干的工作電極置于0.5mol/L的H2SO4溶液中進行電極活化。
9.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的石墨烯-殼聚糖溶液、硫堇水溶液、膽固醇氧化酶水溶液、辣根過氧化物酶水溶液的體積比為1:1:1:1;步驟(4)及步驟(5)中所述工作電極為玻碳電極，所述參比電極為飽和甘汞電極或Ag/AgCl參比電極，所述對電極為鉬電極。
10.根據(jù)權利要求1 ~4任一項所述的檢測膽固醇的酶生物傳感器在膽固醇定量檢測中的應用。
【文檔編號】G01N27/327GK103954660SQ201410149341
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權日:2014年4月14日
【發(fā)明者】樸金花, 張秀花 申請人:華南理工大學