一種自生固氮菌mbc4及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物固氮領域，具體涉及一種自生固氮菌MBC4及其應用。
【背景技術】
[0002]荒漠生態(tài)系統占全球面積的41 % (Delgado-Baquerizo, et al.，2013)，其凈初級生產力約占陸地生態(tài)系統生產力的20% (Whittaker，1975)。在荒漠生態(tài)系統當中，土壤氮素養(yǎng)分的匱乏嚴重地限制了系統凈初級生產力(Asner，et al.，2003，Crutsinger，et al.,2013，Reich，et al., 2006) 0而且荒漠化還在進一步發(fā)展，導致了土地退化，氮素養(yǎng)分流失嚴重。
[0003]自然環(huán)境中的氮素輸入方式主要為生物固氮。固氮作用增加土壤可利用氮含量，為微生物和植物補充氮素促進其生長和代謝，以增加生態(tài)系統的初級生產力，并且對于生態(tài)系統的氮素循環(huán)也有著至關重要的作用。生物固氮主要有共生固氮和自生固氮。由于荒漠地區(qū)環(huán)境條件惡劣，植被稀少，因此可以進行共生固氮的豆科植物也十分稀少，自生固氮是荒漠生態(tài)系統主要的氮素輸入方式。因此，自生固氮對于荒漠化防治工作和荒漠生態(tài)系統的恢復有重大意義。
[0004]為了幫助荒漠化防治工作，對于荒漠土壤自生固氮菌的研究和應用迫在眉睫。目前對于固氮細菌的報道仍以共生固氮菌為主，對于自生固氮菌的報道非常少。而且這些少量已知的自生固氮菌劑對環(huán)境溫度和濕度等環(huán)境條件均有要求，抗逆性較差，多應用于農田或者堆肥當中，不適于環(huán)境條件惡劣的荒漠生態(tài)系統。
[0005]因此有必要提供一種抗逆性強、適用于荒漠生態(tài)系統的具有自生固氮能力的固氮菌株。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種適用于干旱、溫差大、鹽堿災害和高紫外線強度并且可以自生固氮的菌株，以增加土壤固氮活性和有效氮含量。
[0007]為達到以上目的，本發(fā)明提供了一種自生固氮菌(Pseudomonas oryzihabitans)MBC4，其保藏號為CGMCC N0.10820，保藏日期為2015年5月19日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0008]上述菌株為Pseudomonas oryzihabitans。菌株 Pseudomonas oryzihabitans (菌種名)-MBC4(菌株名)，是將荒漠地區(qū)的表層土壤用無菌裝置采集低溫條件在帶回實驗室，經過分離、純培養(yǎng)，革蘭氏染色、固氮活性檢測和16srDNA測序所得。
[0009]形態(tài)特性:桿菌約為0.8 X 2.0 μ m。積累聚-β -羥基丁酸鹽顆粒作為細胞的碳貯藏物，在缺氮的培養(yǎng)基上尤其這樣。以極生叢毛運動。
[0010]培養(yǎng)特性:產生黃綠擴散性的非熒光色素，在缺鐵培養(yǎng)基上尤為明顯。在復雜培養(yǎng)基上，大多數培養(yǎng)物為暗黃色。在含2-4%蔗糖培養(yǎng)基上產生粘液。專性需氧。生長的最適溫度約為30-35°C。所有的菌株可在40°C生長，幾乎所有的都能在41°C生長，而在4°C不生長。菌落形態(tài)各異，多數直徑2-3mm，邊緣不整齊，扁平濕潤。
[0011 ] 生理特性:沒有反硝化作用，氧化酶陽性，卵黃反應樣性，有解脂作用。不需要生長因素。菌株至少利用78種不同有機化合物作為生長的唯一碳源。能利用的特殊碳源很多，包括D-核糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、纖維二糖、海藻糖，柳醇，中-和D-酒石酸鹽、2，3- 丁二醇、中康酸鹽、DL-精氨酸鹽、甜菜堿和胡蘆巴堿。不適合作為碳源的化合物有:麥芽糖、L-鼠李糖、乙酰丙酸鹽、赤癬醇、間=羥基本甲酸鹽、色胺和α戊胺。
[0012]功能特性:通過斜面阿須貝培養(yǎng)基培養(yǎng)，用乙炔還原法測定，該菌株表現出了固氮活性。
[0013]本發(fā)明還提供了含有所述自生固氮菌MBC4的菌劑。所述菌劑可以為液體菌劑，也可以為固體菌劑。
[0014]可選的，所述菌劑中還含有菌體吸附材料，所述菌體吸附材料選自草炭、珍珠巖、蛭石粉和微粉碳酸鈣中的至少一種。
[0015]可選的，在所述菌劑中，自生固氮菌MBC4的含量為2.1 X 10s_2.9X 10scfu/g。
[0016]優(yōu)選的，在所述菌劑中，自生固氮菌MBC4的含量為2.9X10scfu/g。
[0017]可選的，所述菌劑的pH值為6.8-7.2。
[0018]本發(fā)明還提供了所述菌劑的制備方法，包括以下步驟:
[0019]將所述自生固氮菌MBC4接種于一級斜面培養(yǎng)基中，在28-30°C培養(yǎng)3_5天，獲得一級菌株；將所述一級菌株接種于二級液體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下震蕩培養(yǎng)2-3天，獲得二級菌株；將所述二級菌株接種于三級固體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下培養(yǎng)在1-2天后獲得三級菌株；將所述三級菌株與草炭按照(2.1 X 108-2.9X 108) cfu/g的配比混勻勻后獲得菌劑，優(yōu)選為2.9X 10scfu/g ;
[0020]其中，所述一級斜面培養(yǎng)基的配方為:KH2P040.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，瓊脂 20g，蒸餾水 lOOOmL ；
[0021 ] 二級液體培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03
5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸餾水 lOOOmL ；
[0022]三級固體培養(yǎng)基的配方為:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP04
0.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL, H20 1000mL，瓊脂 20g，pH 6.8-7.0。
[0023]本發(fā)明還提供了所述自生固氮菌MBC4或所述的自生固氮菌劑在土壤改良中的應用。
[0024]可選的，所述應用包括將所述菌劑和砂土按質量比1:9-11混合均勻后施用于土壤表面。
[0025]可選的，所述菌劑的用量為420_560g菌劑/畝。
[0026]發(fā)明提供了一種自生固氮細菌，通過乙炔還原法直接測得其固氮活性為87.73ηmol/yL-ho該菌株是從寧夏地區(qū)的荒漠生態(tài)系統環(huán)境提取的。該地區(qū)氣候干旱；全年以及晝夜溫差大(馮薇，2014) ; 土壤鹽堿災害嚴重，紫外線非常強烈，尤其夏季紫外線強度高達到2(K)-533 μW/Cm2(蒲愛萍，et al.，2005)，輻射指數在8級左右。而一般情況下在輻射強度在70-130 μ W/cm2的紫外線下，輻射時間從15s到30min不等，殺菌率可達99%以上(李香云，et al., 2006,張鳳才and袁而森，1988，張福云and況凡，2005)。普通滅菌條件的紫外線強度和照射時均明顯低于寧夏夏季的紫外線強度。該菌株在干旱、大溫差、鹽堿災害和強烈的紫外線輻射下依然能夠生存繁殖并具有固氮活性，尤其該細菌對紫外線的高度抗性是一般細菌所不具備的，在全球氣候變化臭氧空洞增加紫外線輻射日益強烈的今天來說，更加具有生態(tài)學意義和廣闊的應用價值。其制成的菌劑能夠施用于干旱、高紫外線輻射的生態(tài)系統，并且能夠增加這些生態(tài)系統的氮素積累，可以起到改良土壤環(huán)境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加凈初級生產力。實驗表明，將該菌劑接種在寧夏西南緣無固氮活性的裸沙表面一年之后，其表層可以檢測到固氮活性，為1001.60n mol C2H2m 2h \并且有效氮也增加了由3.16mg kg1增加到了 29.lmg kg \簡單說，該菌株制成的菌劑有制作簡單、低成本、抗干旱、高紫外線抗性和固氮等優(yōu)點。
[0027]保藏信息:保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心ChinaGeneral Microb1logical Culture Collect1n Center(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101);保藏日期是2015年05月19日；該保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.10820 ;該保藏中心建議的分類命名是:棲稻假單胞菌 Pseudomonas oryzihabitans ;菌株編號為 MBC4。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0029]實施例1
[0030]該菌株是從寧夏地區(qū)的荒漠生態(tài)系統表層提取的。該地區(qū)氣候干旱；全年和晝夜溫差大(馮薇，2014);紫外線非常強烈，尤其夏季紫外線強度高達到200-533 yW/Cm2(蒲愛萍，et al.，2005)，輻射指數在8級左右。而一般情況下在輻射強度在70-130 μ W/cm2的紫外線下，福射時間從15s到30min不等，殺菌率可達99%以上(李香云，et al., 2006,張鳳才and袁而森，1988，張福云and況凡，2005)。普通滅菌條件的紫外線強度和照射時均明顯低于寧夏夏季野外的紫外線強度，因而該菌株具有對紫外線具有高度抗性。
[0031]稱取表層土壤樣品10g并放入帶有玻璃珠的100mL的無菌水中靜置20min，在旋轉式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成土壤懸液。用無菌移液管分別吸取5.0mL上述土壤懸液加入45mL無菌水中稀釋，用無菌移液管將菌懸液加至固體阿須貝培養(yǎng)基上，于28°C的條件下培養(yǎng)。以平板劃線法純化菌株。本發(fā)