明所用的阿須貝培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL。
[0032]將篩選出來細(xì)菌進(jìn)行格蘭氏染色，然后在顯微鏡(OLYMPUS BX51)下觀測細(xì)菌形態(tài)并拍照。
[0033]然后用移液槍將培養(yǎng)基中的純化菌落50 μ L接種到斜面阿須貝固體培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)箱里(30°C )培養(yǎng)三天，然后用乙炔還原法測定固氮酶活性。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入20%的C2H2時(shí)，樣品所表現(xiàn)的固氮活性最高，所以本實(shí)驗(yàn)中C2H2量占培養(yǎng)容器體積的20%。為了使實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝徒窈笸悓?shí)驗(yàn)比較，將樣品在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以保證精確的環(huán)境條件。為了使結(jié)果更加接近真實(shí)值，培養(yǎng)條件模擬研究區(qū)夏季的環(huán)境條件。培養(yǎng)時(shí)間為24h，前16h有光照，同時(shí)溫度為25°C，后8小時(shí)無光照，同時(shí)溫度為15°C。培養(yǎng)完畢后從錐形瓶中抽取50yL樣氣，注人已走穩(wěn)基線的氣相色譜儀(日立163型氣象色譜儀)中測定乙稀生成量。用乙稀生成量(nmol C2H4/m 2h 描述該固氮菌株的固氮活性，為83.73n mol/μ L.h0
[0034]將表現(xiàn)出然后用16S rDNA序列識別的方法對分離出的具有固氮活性的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，過程如下:用苯酚和氯仿提取細(xì)菌DNA，用異丙醇溶解，于4°C保存。然后以
1.0 μ 1 (lOpmol/ μ 1) 27f 和 1.0 μ 1 (lOpmol/ μ 1) 1496r 作為引物，1.5 μ 1 細(xì)菌 DNA 為模板，加入 0.3 μ L (2.5mmol/L each) dNTPs 和 18.7 μ 1 ddH20，配成 25 μ 1 反應(yīng)體系。將此進(jìn)行PCR反應(yīng)，30個(gè)循環(huán)，變性、退火和延伸溫度分別是94°C、52°C和72 °C，該反應(yīng)在ABI — 2720儀器上完成。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品于-20°C保存。將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測序，將所測序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)導(dǎo)的模式細(xì)菌序列進(jìn)行相似性比較，本文認(rèn)為序列相似度大于98%的菌株與模式細(xì)菌同種。
[0035]實(shí)施例2
[0036]將自生固氮菌MBC4接種于一級斜面培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)4天，獲得一級菌株；將一級菌株接種于二級液體培養(yǎng)基中，在30°C條件下震蕩培養(yǎng)3天，獲得二級菌株；將二級菌株接種于三級固體培養(yǎng)基中，在30°C條件下培養(yǎng)在2天后獲得三級菌株；將三級菌株與草炭接觸混勻后獲得菌劑；使得菌劑中自生固氮菌MBC4的含量為2.9X 10scfu/g，菌劑的pH值為7.0。
[0037]其中，所述一級斜面培養(yǎng)基的配方為:KH2P040.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，瓊脂 20g，蒸餾水 lOOOmL ；
[0038]二級液體培養(yǎng)基的配方為:ΚΗ2Ρ04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03
5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸餾水 lOOOmL ；
[0039]三級固體培養(yǎng)基的配方為:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP04
0.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL, H20 1000mL，瓊脂 20g，pH 6.8-7.0。
[0040]所述Rh 微量元素液:H3B03 5.0g，Na3Mo04 5.0g，H20 1000mL。
[0041]實(shí)施例3
[0042]將實(shí)施例2中制備的菌劑與砂土按照質(zhì)量比1:10混勻后獲得混合物，再將該混合物灑在毛烏素沙地南緣土壤表層，菌劑的用量為用量約為500g菌劑/畝。
[0043]將該菌劑接種在毛烏素沙地南緣無固氮活性的裸沙表面一年之后，其表層可以檢測到固氮活性，為1001.60n mol C2H2m 2h、并且土壤有效氮也由3.16mg kg 1增加到了29.lmg kg:0
[0044]毛烏素沙地自然環(huán)境條件十分惡劣，主要災(zāi)害天氣有干旱、紫外線過強(qiáng)、大風(fēng)、沙暴、干熱風(fēng)、霜凍、冰雹等，不利于動植物和微生物的生存和繁育。毛烏素沙地屬于典型中溫帶大陸性氣候，其氣候控制因子主要為西北環(huán)流，尤其是長時(shí)間控制的北方大陸氣團(tuán)，因此晝夜溫差較大，且平均氣溫較低，約為6-7°C;該地區(qū)氣候干旱，平均降水量大約為280mm，年潛在蒸發(fā)量為2100-2500mm，無霜期為128d，絕對無霜期為100d ;風(fēng)沙災(zāi)害嚴(yán)重，主風(fēng)向?yàn)槲鞅憋L(fēng)，年平均風(fēng)速約為2.8m s \最大風(fēng)速可達(dá)15-18m s \當(dāng)年11月至次年4月多出現(xiàn)大風(fēng)天，大風(fēng)日數(shù)是45.8d，最多可達(dá)52d，年平均沙暴日數(shù)為20.6d ;土壤鹽堿程度很高，pH為8.7-9.2 ;紫外線非常強(qiáng)烈，尤其夏季紫外線強(qiáng)度高達(dá)到200-533 μ W/cm2，輻射指數(shù)在8級左右。該菌株的發(fā)現(xiàn)和其菌劑的接種效果說明了對于干旱、溫差大、風(fēng)沙、鹽堿災(zāi)害和強(qiáng)紫外線輻射具有優(yōu)良的耐受能力，可以有效地增加土壤的氮素輸入能力，增加了土壤有效氮含量。尤其，在紫外線輻射強(qiáng)度為70-130 μ W/cm2時(shí)，輻射時(shí)間從15s到30min不等，殺菌率通?？蛇_(dá)99%以上。上述普通滅菌條件的紫外線強(qiáng)度和照射時(shí)均明顯低于毛烏素沙地南緣夏季野外的紫外線強(qiáng)度和時(shí)間，說明了該菌株以及菌劑比之一般的絕大多數(shù)細(xì)菌具有特殊的高紫外線抗性。
[0045]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種自生固氮菌(Pseudomonasoryzihabitans)MBC4，其保藏號為 CGMCC N0.10820，保藏日期為2015年5月19日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.含有權(quán)利要求1所述自生固氮菌MBC4的菌劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑中還含有菌體吸附材料，所述菌體吸附材料選自草炭、珍珠巖、蛭石粉和微粉碳酸鈣中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于，所述菌體吸附材料為草炭。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于，在所述菌劑中，自生固氮菌MBC4的含量為2.1 X 108-2.9 X 108cfu/g,優(yōu)選為 2.9 X 108cfu/go6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任意一項(xiàng)所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑的pH值為6.8_7.2 ο7.權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將所述自生固氮菌MBC4接種于一級斜面培養(yǎng)基中，在28-30°C培養(yǎng)3_5天，獲得一級菌株；將所述一級菌株接種于二級液體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下震蕩培養(yǎng)2-3天，獲得二級菌株；將所述二級菌株接種于三級固體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下培養(yǎng)在1-2天后獲得三級菌株；將所述三級菌株與菌體吸附材料按照菌劑中自生固氮菌MBC4的含量為2.1 X 108-2.9X 108cfu/g的配比混勻后獲得菌劑； 其中，所述一級斜面培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC035.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg，pH 7.0，瓊脂 20g，蒸餾水 lOOOmL ； 二級液體培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸餾水 lOOOmL ； 三級固體培養(yǎng)基的配方為:甘露醇10.0g，酵母粉l.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP040.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL，瓊脂 20g，H20 1000mL，pH 6.8-7.0。8.權(quán)利要求1所述的自生固氮菌MBC4或權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的自生固氮菌劑在土壤改良中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將所述菌劑和砂土按質(zhì)量比1:9-11混合均勻后施用于土壤表面。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述菌劑的用量為420-560g菌劑/畝。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自生固氮菌(Pseudomonas？oryzihabitans)MBC4，其保藏號為CGMCC？No.10820，保藏日期為2015年5月19日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該菌株在干旱、大溫差、鹽堿災(zāi)害和強(qiáng)烈的紫外線輻射下依然能夠生存繁殖并具有固氮活性。其制成的菌劑能夠施用于干旱、大溫差、鹽堿災(zāi)害和高紫外線輻射的生態(tài)系統(tǒng)，并且能夠增加這些生態(tài)系統(tǒng)的氮素積累，可以起到改良土壤環(huán)境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加凈初級生產(chǎn)力。CGMCC No. 1082020150519
【IPC分類】C09K17/00, C12N1/20, C12R1/38, C09K105/00
【公開號】CN105400715
【申請?zhí)枴緾N201510857725
【發(fā)明人】張宇清, 邵晨曦, 秦樹高, 馮薇, 吳斌
【申請人】北京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月30日