一株產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果酸（Malic acid)又名二羥基丁二酸，是一種重要的四碳平臺化合物，被美國 能源部列為12種有潛力化合物之一。它是TCA生物體循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，具有特殊愉快 的酸味，易被人體吸收利用，因此作為性能優(yōu)異的食品酸味劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食 品行業(yè)。同時(shí)具有抗氧化、抑制油脂酸敗等作用，被用于化妝品、醫(yī)藥、化工行業(yè)。
[0003] 目前，蘋果酸的生產(chǎn)方法主要有：生物催化法、兩步發(fā)酵法和一步發(fā)酵法。國內(nèi)外 以生物催化法為主，其中日本是L-蘋果酸主要的生產(chǎn)國與出口國。（1)生物催化法以富馬 酸為底物經(jīng)富馬酸酶轉(zhuǎn)化生成蘋果酸。其原料價(jià)格高、成品中雜酸高以及生物污染較大； (2)兩步發(fā)酵法指經(jīng)兩種微生物分兩階段發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸。其發(fā)酵周期長、副產(chǎn)物多、分離 純化成本高以及培養(yǎng)條件復(fù)雜，目前正處于實(shí)驗(yàn)室研究水平；（3) -步發(fā)酵法指經(jīng)一種微 生物發(fā)酵獲得蘋果酸。其發(fā)酵條件簡單，生產(chǎn)成本低。
[0004] -步發(fā)酵法常見使用的微生物有霉菌（黃曲霉、米曲霉）和大腸桿菌工程菌。霉 菌發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸雖然其產(chǎn)量高、生產(chǎn)強(qiáng)度大，但由于其積累大量雜酸，提取成本高、菌絲 易結(jié)球發(fā)酵條件難以控制，同時(shí)積累大量毒素，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。而大腸桿菌由于最適 生長PH為中性，提取時(shí)需要添加大量中和劑，成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重。而釀酒酵母具有耐酸 性，故選擇其作為宿主菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。
[0005] 目前，蘋果酸積累的路徑主要有四條：1)胞質(zhì)還原路徑，丙酮酸經(jīng)丙酮酸羧化酶 羧化成草酰乙酸，再經(jīng)過蘋果酸脫氫酶的作用生成蘋果酸；2) TCA循環(huán)；3)乙醛酸循環(huán)；4) 乙醛酸非循環(huán)路徑，丙酮酸經(jīng)乙醛酸循環(huán)至蘋果酸，但蘋果酸不再生成草酰乙酸。由于釀酒 酵母不存在將線粒體中的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且胞質(zhì)還原路徑的理論摩爾得 率最高，故只能利用胞質(zhì)還原路徑進(jìn)行積累。
[0006] 然而，目前利用釀酒酵母積累蘋果酸仍存在幾個(gè)關(guān)鍵問題：1)發(fā)酵周期長；2)生 產(chǎn)強(qiáng)度低；3)菌體濃度低，菌株生長緩慢；4)異源表達(dá)霉菌等真核生物基因時(shí)，內(nèi)含子去除 困難；5)過量表達(dá)大片段基因，代謝負(fù)擔(dān)重等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株利用黃曲霉代謝路徑產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒 酵母工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明是在釀酒酵母中過量表達(dá)源于Aspergillus flavus的丙酮酸羧化酶（Afpyc)、蘋果酸脫氫酶（Afmdh)和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Afmae)基因 構(gòu)建蘋果酸積累路徑。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母 工程菌過表達(dá)來源于Aspergillus flavus的丙酮酸羧化酶基因 Afpyc、蘋果酸脫氫酶基因 Afmdh和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 Afmae。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Aspergillus fIavus是Aspergillus fIavus ATCC 13697〇
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述丙酮酸羧化酶基因的氨基酸序列與NCBI上 accession numble :ΧΜ_002377040的基因編碼的氨基酸序列一致；所述蘋果酸脫氫酶基 因的氨基酸序列與是NCBI上accession numble :ΧΜ_002378178的基因編碼的氨基酸 序列一致；所述蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的氨基酸序列一致在NCBI上accession numble : XM_002376564的基因編碼的氨基酸序列一致。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述過表達(dá)Afpyc是以PY14載體進(jìn)行游離表達(dá)；所 述過表達(dá)Afmae和Afmdh，是將這兩個(gè)基因連接到PY26載體上進(jìn)行游離表達(dá)。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母工程菌是以S. cerevisiae tTAM為 宿主得到的；所述S. cerevisiae tTAM是在S. cerevisiae TAM的基礎(chǔ)上，利用Cre/Loxp 系統(tǒng)敲除色氨酸基因 trp得到；所述S. cerevisiae TAM是文獻(xiàn)（Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae, Yielding a C2~ Independent, Glucose-Tolerant, and Pyruvate-Hyperproducing Yeast)的菌株，是在 S. cerevisiae CEN. PK 113-7D 的基礎(chǔ)上通過 Cre/LoxP 系統(tǒng)敲除基因 PDCl，PDC5 和 PDC6 所 獲得的三重缺陷型菌株。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種權(quán)利要求1所述釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包 括：
[0014] (I) PCR擴(kuò)增或者化學(xué)合成核苷酸序列分別如XM_002377040、XM_002378178、 XM_002376564 所示的 Afpyc 片段、Afmdh 片段、Afmae 片段；
[0015] (2)將Afpyc片段連接到質(zhì)粒PY14上得到重組質(zhì)粒PY14/TEF-Afpyc，將Afmae片 段和Afmdh片段先后連接到質(zhì)粒PY26上得到重組質(zhì)粒PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh ;并驗(yàn) 證；
[0016] (3)將上一步得到的兩個(gè)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到受體菌S. cerevisiae tTAM中，涂布 Ura及Trp缺陷平板進(jìn)行篩選；
[0017] (4)驗(yàn)證正確的重組菌，即為產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述釀酒酵母工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸方面的應(yīng) 用。
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是將釀酒酵母工程菌活化后，于溫度30°C、 轉(zhuǎn)速800rpm，通氣量I. 5vvm，8mM的KOH調(diào)節(jié)pH至5. 0下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為84h。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有：葡萄糖100g/L， K2S046 . 6g/L，KH2P043g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，尿嘧啶、色氨酸終濃度 20mg/L，尿素終濃度 lg/L，生物素終濃度為lmg/L，CaCl2 · 2H20終濃度為5mM，微量金屬離子液lmL/L，維生素液 lmL/L〇
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述微量金屬離子液，按mg/L計(jì)，含有：EDTA 15， ZnSO4 · 7H20 4. 5, CoCl2 · 6H20 0· 3, MnCl2 · 4H20 1，CuSO4 · 5H20 0· 3, CaCl2 · 2H20 4. 5， FeSO4 · 7H20 3, NaMoO42 · 2H20 0· 4, H3BO3I, KI 0· 1。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述維生素液，按mg/L計(jì)，含有：生物素0. 05,泛酸 鈣1，煙酸1，肌醇25,鹽酸硫胺素1，鹽酸吡哆醇1，對氨基苯甲酸0. 2。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] 由于Aspergillus flavus ATCC13697本身高產(chǎn)蘋果酸，但其具有黃曲霉毒素及發(fā) 酵工藝難，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。菌株S. cerevisiae tTAM丙酮酸積累能力強(qiáng)，為蘋果酸的積 累提供大量的前體物質(zhì)。因此，本發(fā)明在S. cerevisiae中成功構(gòu)建了黃曲霉積累蘋果酸的 代謝路徑，實(shí)現(xiàn)蘋果酸的積累。宿主酵母本身不積累蘋果酸，利用本發(fā)明的釀酒酵母工程菌 發(fā)酵84h生產(chǎn)蘋果酸，產(chǎn)量可達(dá)27. 3g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0. 325gAL *h)，蘋果酸相對葡萄糖的 得率為 〇· 41mol/mol〇
【附圖說明】
[0025] 圖 I :A. flavus 來源基因 Afpyc、Afmdh 及 Afmae PCR 擴(kuò)增圖，M: 1000 OMarker ; l:Afmdh ；2:Afmae ；3:Afpyc
[0026] 圖 2 :質(zhì)粒 PY14/TEF-Afpyc 和 PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 圖譜，A:質(zhì)粒 PY14/ TEF-Afpyc 圖譜；B:質(zhì)粒 PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 圖譜
[0027] 圖 3 :質(zhì)粒 PY14/TEF-Afpyc 和 PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 酶切示意圖， M: 1000 OMarker ;1:PY14/TEF-Afpyc 質(zhì)粒 BamHI、PstI 雙酶切圖；2 :PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 質(zhì)粒 Bgl II、NotI 雙酶切示意圖；3 :PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 質(zhì)粒 EcoRI、 Xho I雙酶切示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0028] 蘋果酸檢測方法（高效液相色譜條件）：
[0029] 色譜柱：Atlantis :動C'i.s: (5 μ m 4. 6 X 250mm);
[0030] 流動相：0· lmol/L KH2PO4,磷酸調(diào) pH 至 2· 8 ;
[0031] 柱溫：20°C;
[0032] 檢測波長：215nm ;
[0033] 進(jìn)樣量：1