0μ1;
[0034] 流速：0· 6ml/min。
[0035] 實施例1 :產(chǎn)蘋果酸的釀酒酵母工程菌株的構(gòu)建
[0036] (1)以 A. flavus ATCC13697 的 cDNA 為模板，利用引物 1 (序列如 SEQ ID NO. 1)和引物2 (序列如SEQ ID NO. 2)將來自于A. flavus ATCC13697的丙酮酸羧 化酶基因 （NCBI accession numble:XM_002377040, 3582bp)進行 PCR 擴增，利用引 物3(序列如SEQ ID NO. 3)和引物4(序列如SEQ ID NO. 4)擴增蘋果酸脫氫酶基因 (NCBI accession numble:XM_0〇2378l78, 9%bp)，利用引物 5(序列如 SEQ ID NO. 5) 和引物6(序列如SEQ ID N0.6)進行PCR擴增蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白基因 （NCBI accession numble:XM_002376564，1197bp);
[0037] 引物序列如下：
[0038] 引物 1 :5, -CGGGATCCATGGCGGCTCCGTTTCGT-3'
[0039] 引物 2 :5' -AACTGCAGTTGCTTACGCTTTGACGAT-3'
[0040] 引物 3 :5, -ATTTGCGGCCGCATGGTCAAAGCTGCGGTACT-3，
[0041] 引物 4 :5' -GAAGATCTTCAAAGCTTTGGTGGTGGGTT-3'
[0042] 引物 5 :5, -CGGAATTCATGTTCAATAACGAACACC-3，
[0043] 引物 6 :5, -CCGCTCGAG CTAATCAGATACATCCTCAT-3'
[0044] (2)將擴增得到的片段與pMD19 Tsimple-vector 16°C連接過夜；
[0045] (3)將步驟2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板， 挑取轉(zhuǎn)化子進行測序驗證；
[0046] (4)提取測序正確的含有基因 Afpyc的質(zhì)粒，用BamH I、Pst I雙酶切上述質(zhì)粒及 PY14質(zhì)粒，提取含有基因 Afmae的質(zhì)粒，用EcoR I、Xho I酶切上述質(zhì)粒及PY26質(zhì)粒，膠回 收純化后，用T4DNA連接酶16°C連接過夜；
[0047] (5)將步驟4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板， 挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗證，得到質(zhì)粒ΡΥΗ/TEF-Afpyc及PY26/GPD-Afmae ;
[0048] (6)提取質(zhì)粒PY26/GPD-Afmae，用Bgl II、Not I雙酶切該質(zhì)粒及含有Afmdh基 因的質(zhì)粒，膠回收純化后，用T4DNA連接酶16°C連接過夜；
[0049] (7)將步驟6連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板， 挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗證，得到質(zhì)粒PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh ;
[0050] (8)將步驟 5 和步驟 6 得到的質(zhì)粒PY14/TEF-Afpyc 和 PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh 采用LiAc轉(zhuǎn)化法導入受體菌當中，涂布ura及trp缺陷平板；
[0051] (9) PCR驗證所述工程菌；
[0052] (10)搖瓶發(fā)酵，驗證蘋果酸的生產(chǎn)情況。
[0053] 實施例2 :利用釀酒酵母生產(chǎn)L-蘋果酸
[0054] 將保存于甘油管中的工程菌株接種于YNB培養(yǎng)基斜面，取一環(huán)至種子培養(yǎng)基 (100mL/500mL三角燒瓶），30°C，200r/min培養(yǎng)48h后，以10%接種量（V/V)接種發(fā)酵培 養(yǎng)基（100mL/500mL三角燒瓶），溫度為30°C，轉(zhuǎn)速800rpm，通氣量I. 5vvm，8mM的KOH調(diào)節(jié) pH至5.0,發(fā)酵時間為84h。采用高效液相色譜（HPLC)測得：本發(fā)明的基因工程菌（WllOl) 蘋果酸的產(chǎn)量為27. 3g/L，而出發(fā)菌株（WT)積累少量蘋果酸。蘋果酸相對葡萄糖的得率為 0· 41mol/mol 〇
[0055] 表1產(chǎn)物產(chǎn)量（單位：g/L)
[0057] 本發(fā)明的優(yōu)點：1)本發(fā)明菌株相對于已報道的釀酒酵母工程菌生長速率快，生產(chǎn) 強度高達〇. 325gAL · h)，發(fā)酵時間短；2)本發(fā)明采用的基因來源為高產(chǎn)蘋果酸菌株，成功 的將曲霉來源基因在釀酒酵母中表達；3)本發(fā)明將丙酮酸羧化酶基因采用低拷貝質(zhì)粒表 達，降低該基因?qū)甑拇x負擔；此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將本發(fā)明的PY14質(zhì)粒替換成常用的 高拷貝質(zhì)粒PYX212時，會嚴重增加細胞代謝負擔，導致菌株生長緩慢、無法蘋果酸或者合 成產(chǎn)量極低；4)本發(fā)明為高產(chǎn)蘋果酸菌株的構(gòu)建提供了一種新的思路。
[0058] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一株產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌過表達來源 于Aspergillusflavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、蘋果酸脫氫酶基因Afmdh和蘋果酸轉(zhuǎn) 運蛋白基因Afmae。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因的氨 基酸序列與NCBI上accession numble :XM_002377040的基因編碼的氨基酸序列一致；所 述蘋果酸脫氫酶基因的氨基酸序列與是NCBI上accession numble :XM_002378178的基因 編碼的氨基酸序列一致；所述蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的氨基酸序列一致在NCBI上accession numble :XM_002376564的基因編碼的氨基酸序列一致。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述過表達Afpyc是以PY14 載體進行游離表達；所述過表達Afmae和Afmdh，是將這兩個基因連接到PY26載體上進行 游離表達。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述Aspergillusflavus是 AspergillusflavusATCC13697。5. -種權(quán)利要求1所述釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括： (1) PCR擴增或者化學合成核苷酸序列分別如XM_002377040、XM_002378178、 XM_002376564所示的Afpyc片段、Afmdh片段、Afmae片段； (2) 將Afpyc片段連接到質(zhì)粒PY14上得到重組質(zhì)粒PY14/TEF-Afpyc，將Afmae片段和 Afmdh片段先后連接到質(zhì)粒PY26上得到重組質(zhì)粒PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh;并驗證； (3) 將上一步得到的兩個重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母宿主中，涂布Ura及Trp缺陷平板 進行篩選； (4) 驗證正確的重組菌，即為產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌。6. 權(quán)利要求1所述釀酒酵母工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸方面的應用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用是將釀酒酵母工程菌活化后，于 溫度30°C、轉(zhuǎn)速800rpm，通氣量1. 5vvm，調(diào)節(jié)pH至5. 0以下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為84h。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有：葡萄 糖 100g/L，K2S04 6 . 6g/L，KH2P04 3g/L，MgS04 · 7H20 0· 5g/L，尿嘧啶、色氨酸終濃度 20mg/ L，尿素終濃度lg/L，生物素終濃度為lmg/L，CaCl2 · 2H20終濃度為5mM，微量金屬離子 液lmL/L，維生素液lmL/L;所述微量金屬離子液，按mg/L計，含有：EDTA15,ZnS04 · 7H20 4· 5,CoC12 · 6H20 0· 3,MnCl2 · 4H20 1，CuS04 · 5H20 0· 3,CaCl2 · 2H20 4· 5,FeS04 · 7H20 3， NaMo042 · 2H20 0. 4,H3B03 1，KI0. 1 ;所述維生素液，按mg/L計，含有：生物素0. 05,泛酸鈣 1，煙酸1，肌醇25,鹽酸硫胺素1，鹽酸吡哆醇1，對氨基苯甲酸0. 2。
【專利摘要】本發(fā)明的公開了一株產(chǎn)L-蘋果酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及應用，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明在高產(chǎn)丙酮酸的菌株S.cerevisiae？tTAMΔura3Δtrp1中過量游離表達源于Aspergillus？flavus？ATCC13697的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、蘋果酸脫氫酶(Afmdh)和蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白(Afmae)基因，構(gòu)建了蘋果酸積累路徑，獲得菌株W1101。上述菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸，發(fā)酵84h，其蘋果酸產(chǎn)量為27.3g/L，而原始出發(fā)菌株不積累蘋果酸，這將高產(chǎn)L-蘋果酸菌株黃曲霉的代謝路徑成功應用于釀酒酵母，為高產(chǎn)L-蘋果酸菌株的構(gòu)建提供了一種新策略。
【IPC分類】C12P7/46, C12R1/865, C12N15/81, C12N1/19
【公開號】CN105400711
【申請?zhí)枴緾N201511018190
【發(fā)明人】劉立明, 王元彩, 陳修來, 陳瑞東, 董曉翔, 高聰, 胡貴鵬, 郭亮
【申請人】江南大學
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月30日