專利名稱：固氮菌及其菌劑、菌劑組合物和它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固氮菌的分離、純化及其發(fā)酵制品。具體地講，本發(fā)明涉及芽孢固氮菌的分離、純化及其發(fā)酵制品，以及由所述芽孢固氮菌及其組合物用于制備生物活性肥制品的應(yīng)用。
眾所周知，氮是一種重要的生命元素，如何給植物尤其是經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物提供安全有效的氮肥一直是人們所關(guān)心的問題。
含氮化肥在給農(nóng)業(yè)帶來(lái)巨大益處的同時(shí)，也帶來(lái)造成土地板結(jié)、生態(tài)破壞、產(chǎn)品質(zhì)量下降的缺陷。1972年，有機(jī)農(nóng)業(yè)聯(lián)盟就發(fā)出了“停止使用含氮化肥”的呼吁。
自1895年出現(xiàn)了第一種生物肥料一根瘤菌接種劑以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已開發(fā)出很多種基于固氮菌的生物肥料。這些肥料中的固氮菌根據(jù)其與植物的生長(zhǎng)關(guān)系，可分成以下三類1.共生固氮菌，其代表性的例子是根瘤菌。該類微生物與豆科植物構(gòu)成共生關(guān)系，根瘤菌侵入豆科植物的根部，并使植物在被侵入部位生成根瘤。根瘤菌將空氣中游離態(tài)的氮固定并轉(zhuǎn)化為植物可利用的氮，而植物也為固氮菌提供了生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)。
2.聯(lián)合固氮菌，其代表性的例子是巴西固氮螺菌。這類菌可以進(jìn)入植物根部細(xì)胞，但并不致瘤。
3.自生固氮菌，其代表性的例子是圓褐固氮菌。這類菌不侵入植物細(xì)胞，而與植物成相互獨(dú)立的關(guān)系。這種菌可將空氣中的氮固定轉(zhuǎn)化為植物可利用的氮，并將之富集在土壤中。
目前開發(fā)出的基于以上三類固氮菌的生物肥料卻各自存在著不足之處。例如，基于根瘤菌的生物肥料其應(yīng)用范圍受到了根瘤菌宿主范圍的限制，這類生物肥料一般只適用于豆科植物，而對(duì)非豆科植物是無(wú)效的。而且，由于現(xiàn)有的自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和根瘤菌均沒有芽孢，因此它們不耐熱、不耐干，使基于這三類固氮菌的生物肥料存在著有效菌易死亡、易生雜菌、保存時(shí)間短和不便運(yùn)輸?shù)娜秉c(diǎn)。
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的發(fā)明人致力于分離、篩選和純化有芽孢的固氮菌；經(jīng)過數(shù)年的努力他們終于得到了兩株耐熱、耐干、耐鹽、有芽孢的固氮菌?；谶@兩株固氮菌，還分別開發(fā)出了菌劑、菌劑組合物和生物活性肥制品。
本發(fā)明的目的在于提供一種能耐熱、耐干、耐鹽、有芽孢的固氮菌。本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述本發(fā)明固氮菌經(jīng)發(fā)酵制成的菌劑。本發(fā)明的又一目的是提供一種含有上述本發(fā)明固氮菌劑的菌劑組合物。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有上述本發(fā)明固氮菌和/或本發(fā)明固氮菌劑的生物活性肥制品。
本發(fā)明包括如下幾個(gè)方面1.本發(fā)明的固氮菌本發(fā)明的固氮菌是于1999年月日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)的ND1和ND2。ND1和ND2的保藏編號(hào)分別為CGMCC--和CGMCC--。ND1是一種球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)。ND2是一種巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。這兩種固氮菌的最適生長(zhǎng)溫度為28-32℃，并可耐受80℃的高溫達(dá)1-3小時(shí)；可耐受20％的(NH4)2SO4；最適pH為6.8-7.2。保存培養(yǎng)基為Dǒbereiner低氮培養(yǎng)基。
本發(fā)明的上述兩株固氮菌不但具有很強(qiáng)的固氮酶活性，還具有較強(qiáng)的解析金屬元素如磷、鉀的能力和分泌激素的能力。
2.本發(fā)明的固氮菌液劑和粉劑本發(fā)明的固氮菌菌劑是通過將本發(fā)明固氮菌依次經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子瓶培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)制成的。一種固氮菌劑是本發(fā)明的ND1的發(fā)酵培養(yǎng)液，其中含有約1.0×108-2.0×109個(gè)ND1/毫升。向該固氮菌劑中添加載體，再經(jīng)過濾/離心、干燥、粉碎、過篩，可制得粉狀的含ND1的固氮菌劑(下文稱之為ND1粉劑)，該固氮菌劑中的有效活菌總數(shù)為約5.0～7.0×108-1.0～1.4×1010個(gè)ND1的細(xì)胞/克，優(yōu)選含有至少約7.0×109個(gè)ND1的細(xì)胞/克。
本發(fā)明的另一種固氮菌劑是本發(fā)明的ND2的發(fā)酵培養(yǎng)液，其中含有1.0×107-4.0×108個(gè)ND2/毫升。向該固氮菌劑中添加載體，再經(jīng)過濾/離心、干燥、粉碎、過篩，可制得粉狀的含ND2的固氮菌劑(下文稱之為ND2粉劑)，該固氮菌劑中的有效活菌總數(shù)為約5.0～7.0×107-2.0～2.8×109個(gè)ND2的細(xì)胞/克，優(yōu)選含有至少約2.0×108個(gè)ND2的細(xì)胞/克。
對(duì)所述的過濾/離心、干燥、粉碎、過篩等步驟沒有特殊的要求，可使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ê驮O(shè)備，只要能達(dá)到所需的目的即可。
所述粉劑的粒徑大小為60-100目，優(yōu)選80-100目。
所述的載體為碳酸鈣、高嶺土、膨潤(rùn)土中的一種或多種的混合物。優(yōu)選采用碳酸鈣作載體。
本發(fā)明的固氮菌劑除了可以用來(lái)制備本發(fā)明的活性菌劑組合物，進(jìn)而制備生物活性拌種劑、生物活性菌粒、生物活性復(fù)混肥或顆粒摻混肥外，很顯然的是，它們亦可作為肥料而直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
3.本發(fā)明的活性菌劑的組合物本發(fā)明還提供一種生物活性菌劑的組合物，該組合物含有下面四種菌粉劑中的至少兩種上述ND1的粉劑、上述ND2的粉劑、有芽孢解磷菌如由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的ND3的粉劑和有芽孢解鉀菌如由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的ND4的粉劑，其中，上述有芽孢解磷菌的粉劑和有芽孢解鉀菌的粉劑的制備和本發(fā)明固氮菌菌劑的制備方法類似，即在經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后加載體、制成濾餅或離心得沉淀，然后烘干和粉碎過篩制成。其他各粉劑與上述ND1粉劑的配合比例為0.5～1∶1，優(yōu)選按1∶1配合。例如，可將ND1的粉劑、ND2的粉劑按1∶(0.5～1)的比例混合。如果本發(fā)明的生物活性菌劑的組合物包含上述四種活性菌，則其中ND1∶ND2∶解磷菌∶解鉀菌的比例為1∶(0.5～1)∶(0.5～1)∶(0.5～1)，優(yōu)選按1∶1∶1∶1的等比混合。同時(shí)含有ND1的粉劑和ND2的粉劑的本發(fā)明混合菌劑是優(yōu)選的。
本發(fā)明對(duì)上述菌劑的混合次序、混合方式?jīng)]有限制，只要能將個(gè)組分混合均勻即可。
當(dāng)然，可以想見，可將各菌先單獨(dú)發(fā)酵，然后將各發(fā)酵液按預(yù)定比例混合，再經(jīng)添加或不添加載體，而制成所需的混合菌劑；也可將各菌首先混合發(fā)酵培養(yǎng)，然后加載體制成混合菌劑。例如，可將本發(fā)明的兩種固氮菌按比例混合培養(yǎng)發(fā)酵，再采用與制備單一固氮菌粉劑同樣的方法來(lái)制備本發(fā)明兩種固氮菌的混合粉劑。
在本發(fā)明的上述生物活性菌劑的組合物中，有效活菌的總數(shù)為3.0×109～1.2×1010/克，其中優(yōu)選有效活菌總數(shù)大于或等于7.0×109/克。
本發(fā)明的上述生物活性菌劑的組合物，粒徑一般為60-100目，優(yōu)選為80-100目。
上述菌劑組合物可作為肥料直接使用，但是優(yōu)選將所述菌劑組合物經(jīng)一定比例的稀釋后再施用，如加水制成混懸液后噴灑、澆灌，或與其他有機(jī)質(zhì)、中微量元素、和/或化肥的粉末摻混后施用。
4.本發(fā)明固氮菌劑或其組合物用于制備生物活性肥料a.用于制備生物活性拌種劑可選用工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活廢棄的和自然的有機(jī)物(如污泥、垃圾、糞便、秸桿，以及河湖塘泥、草炭等)為載體，并采用磷酸二氫鉀、腐植酸鉀、中微量元素等為營(yíng)養(yǎng)成分，以300-500℃對(duì)載體、營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行高溫滅菌細(xì)粉碎達(dá)到60-100目，優(yōu)選80-100目；然后進(jìn)行二次滅菌；在無(wú)菌條件下按照配方，即，按活性菌粉劑(載體+營(yíng)養(yǎng)成分)為1∶10～30的比例進(jìn)行摻混。成品為松散粉末狀固體，粒徑大小為60-100目，優(yōu)選為80-100目，有效活菌數(shù)至少為4.0×108/克，含水分5％以下，所含有機(jī)質(zhì)以C.計(jì)至少為30wt％，雜菌率為不高于15％。該組合物產(chǎn)品可用于拌種。
b.用于制備生物活性菌粒也可將本發(fā)明的活性菌粉劑進(jìn)一步配制成制備生物活性肥制品用的生物活性菌粒。選用工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生活廢棄的和自然的有機(jī)物(如污泥、垃圾、糞便、秸桿，以及河湖塘泥、草炭等)為載體，按下述基本工序生產(chǎn)對(duì)載體以300-500℃進(jìn)行高溫烘干滅菌，時(shí)間10-30分鐘左右；對(duì)滅菌烘干后的載體進(jìn)行細(xì)粉碎，要求粒度為60-100目，優(yōu)選80-100目；按照活性菌粉劑載體=1∶30～40的比例，將本發(fā)明活性菌粉劑組合物和有機(jī)載體，經(jīng)機(jī)械式攪拌均勻；使用圓盤、轉(zhuǎn)鼓或擠壓造粒機(jī)，加水造粒，制成直徑為2.5～4.5mm的顆?；蛑睆綖?～8mm的圓柱體；接著進(jìn)行烘干；經(jīng)冷卻處理，降低產(chǎn)品溫度、水份，增強(qiáng)硬度。所得產(chǎn)品的含水量為5％以下，粒徑為2.5-4.5毫米，顆?？箟簭?qiáng)度6N以上，有效活菌數(shù)至少為1.0×108/克，所含有機(jī)質(zhì)以C計(jì)至少為20wt％，雜菌率為不高于20％。
很顯然，本發(fā)明的生物菌粒本身也可作為肥料直接使用，優(yōu)選在使用時(shí)與一定量的化肥或有機(jī)質(zhì)和/或一定量的大、中、微量元素配合。
c.用于制備生物活性復(fù)混肥按上文4b.所述制備本發(fā)明的生物菌粒，按傳統(tǒng)的復(fù)混肥生產(chǎn)工藝，制備出無(wú)機(jī)顆粒。例如，將N、P、K、Mn、Zn按一定比例稱料，再向其中加入草炭等，然后造粒?？筛鶕?jù)不同地區(qū)、不同作物、作物不同生長(zhǎng)階段對(duì)肥料的具體需要，將所制得的生物菌粒和無(wú)機(jī)顆粒按30～50∶50～70的比例摻混，即可得到本發(fā)明的生物活性復(fù)混肥。其中，所得產(chǎn)物的總養(yǎng)分含量以(N+P2O5+K2O)計(jì)，至少為20％，水溶性磷占有效磷含量至少為40％，游離水含量不超過5％，顆粒平均抗壓碎力至少為6N，有效活菌總數(shù)至少為2.0×107/克，雜菌率不超過20％，粒徑在2.5～4.5之間，pH為6.0～7.5。
d.用于制備生物活性顆粒摻混肥分別生產(chǎn)生物活性菌粒和無(wú)機(jī)氮、磷、鉀肥的三種單質(zhì)顆粒，顆粒直徑為2-4毫米，含水分3％以下，顆粒強(qiáng)度大于18N。生物菌粒按上文4.(b)所述工藝生產(chǎn)；選用粉狀鉀肥，添加粘接劑如污泥、微量元素，按復(fù)混肥生產(chǎn)工藝生產(chǎn)鉀肥顆粒，或直接使用符合要求的鉀肥顆粒；選用符合粒度、強(qiáng)度、含水率、含養(yǎng)量等標(biāo)準(zhǔn)的氨肥、磷肥顆粒。根據(jù)不同需要，按配方將生物菌粒與三種顆粒中的一種或多種進(jìn)行摻混，優(yōu)選將四種顆粒按1∶1∶1∶1的比例摻混均勻，制得生物活性顆粒摻混肥。所得產(chǎn)品為四種不同顏色，比重、體積相近的顆粒狀產(chǎn)品。其中，總養(yǎng)分含量以(N+P2O5+K2O)計(jì)，至少為20％，水溶性磷占有效磷含量至少為40％，游離水含量不超過5％，顆粒平均抗壓碎力至少為6N，有效活菌總數(shù)至少為2.0×107/克，雜菌率不超過20％，粒徑在2.0～4.0之間，pH為6.0～7.5。
附圖的簡(jiǎn)要說明


圖1是本發(fā)明ND1的顯微照片。
圖2是本發(fā)明ND2的顯微照片。
圖3是本發(fā)明固氮菌ND1和ND2的生長(zhǎng)曲線。
圖4是本發(fā)明固氮菌的ND1和ND2的生孢曲線。
下面利用本發(fā)明的固氮菌ND1、ND2、以及由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物室提供的兩種巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)--解磷菌ND3和解鉀菌ND4，以實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明如下。這些實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明的，本發(fā)明不應(yīng)受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1本發(fā)明ND1的分離、純化采用稀釋平板法并采用改良Dǒbereiner培養(yǎng)基從土壤中分離純化本發(fā)明的固氮菌。將采回的根際土混勻，稱取10克根與土的混合物，在研缽中研碎，加無(wú)菌水至100ml，按10倍稀釋法稀釋至10-5，共三個(gè)重復(fù)，取10-4和10-5兩個(gè)濃度的土壤懸液各0.1ml，均勻涂于無(wú)氮培養(yǎng)基平皿中，30℃下培養(yǎng)3天后，并將不同菌落標(biāo)號(hào)接出，在改良Dǒ氏LN培養(yǎng)基上測(cè)其乙炔還原活性(ARA)。然后，選乙炔還原活性高于20nmol C2H4/hr/ml的菌株，淘汰無(wú)活性和活性低的菌株，以低氮/無(wú)氮平板劃線法進(jìn)行分離提純，又選出不同形態(tài)的單菌落接出，選ARA值顯著的菌落繼續(xù)分離，直到選出ARA較高的純菌株。其中，所用改良Dǒbereiner培養(yǎng)基的配方如下表1所示表1
用NaOH調(diào)pH為7.2。
其中不加蛋白胨，則為無(wú)氮培養(yǎng)基(NN)；加蛋白胨0.2g，則為低氮培養(yǎng)基(LN)；加蛋白胨5g，則為高氮培養(yǎng)基(HN)。NN和LN用于篩選固氮菌和測(cè)定固氮菌的乙炔還原活性(ARA)；HN則用于固氮菌的生長(zhǎng)繁殖。
固氮菌的乙炔還原活性(ARA)測(cè)定在15×150mm試管中加入4.5ml的改良的Dǒ氏LN固體培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15分鐘，做成斜面。接種后在30℃下培養(yǎng)18-24小時(shí)，將棉塞換為橡皮塞密封，抽取1.8ml的空氣，注入1.6ml的C2H2，繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí)后，取100μl氣樣在SQ-204型氣相色譜儀上測(cè)定乙烯峰值，標(biāo)準(zhǔn)氣C2H2的濃度為138mg·ml-1。氣相色譜儀的工作條件設(shè)置為檢測(cè)室溫度100℃，柱溫60℃，進(jìn)樣口溫度60℃，柱長(zhǎng)為1m，表頭載氣壓力氮?dú)鉃?.95kg·cm-2，氫氣為0.8kg·cm-2，空氣為0.6kg·cm-2。
乙炔還原活性計(jì)算方法為 乙炔還原后測(cè)得ND1和ND2的酶活性分別為210-330n molC2H4／hr/ml、160-190nmol C2H4／hr/ml?；旌吓囵B(yǎng)時(shí)的固氮酶活性為2500-2800n mol C2H4/hr/ml，說明這兩株菌具有聯(lián)合增效作用。實(shí)施例2本發(fā)明固氮菌特征的鑒定分別對(duì)按實(shí)施例1分離純化得到的ND1和ND2進(jìn)行顯微鏡檢查，并對(duì)它們進(jìn)行微生物的常規(guī)生理生化反應(yīng)的測(cè)定。其結(jié)果分別為ND1為G+、桿狀，大小為0.4-0.5×0.9-1.5μ。芽孢中性到亞中性。孢囊膨大。芽孢大多數(shù)為圓球形，也有橢圓形的。生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為VP-，培養(yǎng)液pH8.5。淀粉水解-。吲哚-。脲酶-。接觸酶+。氧化酶+。檸檬酸鹽利用+。丙酸鹽利用-。乙酸鹽利用-。蘋果酸鹽利用-。鼠李糖利用-。葡萄糖產(chǎn)酸-。阿拉伯糖產(chǎn)酸-。木糖產(chǎn)酸-。甘露醇產(chǎn)酸-。硝酸鹽還原-。在厭氧培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在7％NaCl中不生長(zhǎng)。根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)、生理生化特性，查對(duì)《系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)伯杰氏手冊(cè)》，將該新菌株定名為球狀芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)ND1。
ND2為G+、桿狀，大小為1.0-1.2×2.5-4.0μ。芽孢中性到亞中性。孢囊不膨大。芽孢一般呈橢圓形大芽孢。孢內(nèi)有pHB顆粒。VP-，淀粉水解-。檸檬酸鹽利用+。丙酸鹽利用-。卵磷脂酶-。葡萄糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸。阿拉伯糖不產(chǎn)酸或弱產(chǎn)酸。能在7％NaCl中生長(zhǎng)。不能在厭氧培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)、生理生化特性，查對(duì)《系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)伯杰氏手冊(cè)》，將該新菌株定名為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)ND2。實(shí)施例3本發(fā)明固氮菌固氮功能的測(cè)定A.乙炔還原法(1)測(cè)定方法按照實(shí)施例1中分離純化固氮菌時(shí)測(cè)固氮酶活性的同樣步驟進(jìn)行。
(2)測(cè)定結(jié)果。ND1的乙烯還原活性(ARA)為210-330nmolC2H4/hr/ml；ND2的乙烯還原活性(ARA)為160--190nmol C2H4/hr/ml；菌株ND1和ND2混合培養(yǎng)有固氮增效作用，混合培養(yǎng)的乙炔還原活性為2500-2800nmol C2H4/hr/ml培養(yǎng)基。
B.15N標(biāo)記法(1)測(cè)定方法。A以Dǒ氏培養(yǎng)基配方，每1000ml加5g瓊脂及0.2g蛋白胨，配成改良Dǒ氏低氮半固體培養(yǎng)基，在25ml的三角瓶中注入10ml，121℃高壓滅菌20分鐘。然后，垂直穿刺接種，以橡皮塞密封三角瓶。B根據(jù)用量的計(jì)算，在塑料瓶加適量(15NH2)4SO4，抽氣，又加氬氣，抽氣3次，然后注入適量LiBrO，生成15N2備用。(15NH2)4SO4由上海化工研究院生產(chǎn)，其15N豐度為10.12％。C抽出已接種三角瓶中的空氣，加氬氣，重復(fù)3次，然后加8％的氧氣，其中空加15N2，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)物小心倒入硝煮管中，80℃下烘干。D在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所電鏡質(zhì)譜試驗(yàn)室的MU-1305型質(zhì)譜儀上，測(cè)樣品中15N同位素的豐度，質(zhì)譜儀的精度為0.5％。試驗(yàn)條件為向樣品中加濃硫酸5ml，催化劑混合物(K2SO4∶Se=500∶1)2ml，消化后用H2SO4吸收。
(2)測(cè)定結(jié)果。ND1的15N原子百分超為0.311％，ND2的15N原子百分超為0.103％。實(shí)施例4耐鹽性能的測(cè)定以20％和30％的(NH4)2SO4溶液10ml，浸泡NDl和ND2兩個(gè)菌株的菌粉5-10天，每個(gè)菌株菌粉量各1克，蒸餾水浸泡為對(duì)照。然后，把浸泡液加入有玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，以30-50rpm速度搖0.5小時(shí)，取1ml加于9ml的無(wú)菌水試管中搖勻，依次重復(fù)稀釋至108倍，取106、107、108倍菌懸液各0.1ml于平板中，以三角刮刀均勻涂開，30℃培養(yǎng)1-2天計(jì)數(shù)，存活率％結(jié)果見下表2，可看出ND2菌株的耐鹽性較好。表2
測(cè)定ND1在不同濃度(NH4)2SO4培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況下，結(jié)果如下表3所示。
表3
+表示可生長(zhǎng)，++表示生長(zhǎng)較好，-表示未見生長(zhǎng)。實(shí)施例5耐高溫性能的測(cè)定以80℃和100℃為處理溫度，以1、3、5小時(shí)為處理時(shí)間，以自然保存溫度為對(duì)照，對(duì)ND1和ND2兩個(gè)菌株的菌粉進(jìn)行耐高溫處理后，稱量1克菌粉放入有玻璃珠的99ml無(wú)菌水三角瓶中，以30-50rpm速度搖0.5小時(shí)，取1ml加于9ml的無(wú)菌水試管中搖勻，依次重復(fù)稀釋至108倍；各取106、107、108倍菌懸液0.1ml于平板中，以三角刮刀均勻涂開，30℃下培養(yǎng)1-2天計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果把芽孢存活率的影響見下表4。表4
可以看出，本發(fā)明新分離出的兩菌株均可以耐受較高的溫度，在80℃溫度-3個(gè)小時(shí)的處理下菌粉中芽孢存活率基本為80-90％，但看得出處理5小時(shí)時(shí)ND1和ND2死亡較多。實(shí)施例6本發(fā)明固氮菌的其他功能的測(cè)定1.解析磷的能力的測(cè)定所用培養(yǎng)基配方如下表5所示。
表5
按上述配方制備用于測(cè)定解磷能力的培養(yǎng)基，用鹽酸或NaOH調(diào)pH至7.0-7.5。取100ml分裝分裝于250ml的三角瓶中進(jìn)行滅菌，按1％接種量接種被測(cè)定菌，30℃振蕩培養(yǎng)4天，離心，用等離子輻射光譜法測(cè)定解析的磷。結(jié)果列于下表8中。2.解析鉀的能力的測(cè)定所用培養(yǎng)基配方如下表6所示。
表6
按上述配方制備用于測(cè)定解鉀能力的培養(yǎng)基，用鹽酸或NaOH調(diào)pH至7.0。取100ml分裝于250ml的三角瓶中進(jìn)行滅菌，按1％接種量接種被測(cè)定菌，30℃振蕩培養(yǎng)4天，離心，取上清夜，用原子吸收光譜法測(cè)定解析的鉀。結(jié)果列于下表8中。3.測(cè)定植物激素分泌的培養(yǎng)基所用培養(yǎng)基配方如下表7所示。
表7
按上述配方制備測(cè)定分泌植物激素用的培養(yǎng)基。取100ml分裝于250ml的三角瓶中進(jìn)行滅菌，按1％接種量接種被測(cè)定菌，30℃振蕩培養(yǎng)5天，離心，取上清液，用液相色譜法測(cè)定本發(fā)明的固氮菌分泌出的植物激素。重復(fù)三次，取其平均值。結(jié)果列于下表8中。
表8 實(shí)施例7本發(fā)明固氮菌菌劑的制備將保存的本發(fā)明ND1的試管種，在改良的Dǒ氏低氮平板培養(yǎng)基上劃線，在30±1℃溫箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，至長(zhǎng)出單菌落。將典型的單菌落接入試管斜面，在30±1℃溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。將ND1再由該試管接入裝有5ml的液體培養(yǎng)基的試管中，在30±1℃搖床上繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將5ml液體培養(yǎng)基中的ND1按一管對(duì)一瓶接入瓶裝量為40ml的500ml三角瓶中；在30±1℃、200rpm搖床上培養(yǎng)48小時(shí)。接著，將500ml三角瓶中的種子一對(duì)一地接入瓶裝量為400ml的2000ml三角瓶中，在30±1℃、200rpm搖床上繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后將種子菌以3％的接種量接入種子罐，以30±1℃的溫度和1∶1.5的空氣流量進(jìn)行培養(yǎng)，至生孢率達(dá)約95％時(shí)停止培養(yǎng)，以10％的接種量將種子菌接入發(fā)酵罐，同樣以30±1℃的溫度和1∶1.5的空氣流量進(jìn)行培養(yǎng)，至生孢率達(dá)約95％時(shí)停止，即得含本發(fā)明ND1的液體菌劑。以平板計(jì)數(shù)法測(cè)發(fā)酵液中有效活菌的數(shù)量，結(jié)果為約1.6×109個(gè)ND1/克。
向上述發(fā)酵液中按照3-5wt％比例加入載體CaCO3，離心以制得沉淀物，于70℃烘干，粉碎過80目篩，即得含本發(fā)明ND1的粉劑，其中的有效活菌總數(shù)為約9.6×109個(gè)ND1/克。
制備含本發(fā)明ND2的液體菌劑或固體粉劑的工藝與ND1的類似，其中所不同的是，對(duì)于本發(fā)明ND2來(lái)講，不用經(jīng)過由試管斜面接入5ml液體培養(yǎng)基的步驟，可由試管斜面直接接入500ml三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)，在2000ml培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)時(shí)間為16-18小時(shí)，由種子瓶接入發(fā)酵罐的接種量為1.5wt％。發(fā)酵后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，結(jié)果為約2.0×108個(gè)ND2/毫升。
如本實(shí)施例中關(guān)于ND1所述，向上述ND2發(fā)酵液中加入載體，然后依次經(jīng)離心、烘干、粉碎、過篩后制得粉末，經(jīng)測(cè)定含有約1.2×109個(gè)ND2/克。實(shí)施例8本發(fā)明固氮菌混合菌劑的制備將實(shí)施例7中制備的固氮菌液體菌劑或固體粉劑按照ND1∶ND2=1∶1的比例混合，分別制成液體菌劑混合產(chǎn)品和固體粉劑混合產(chǎn)品，其中有效活菌總數(shù)分別為約9.0×108/克和5.4×109/克。實(shí)施例9活性菌劑組合物的制備按照實(shí)施例7中制備ND2菌劑的步驟，分別使用由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)(中國(guó)，北京)提供的有芽孢解磷菌ND3和有芽孢解鉀菌ND4，制備解磷菌ND3發(fā)酵液或粉劑以及解鉀菌ND4發(fā)酵液或粉劑；其中在接入試管斜面后在30±1℃的溫箱中的培養(yǎng)時(shí)間分別為ND3，12小時(shí)；ND4，24-36小時(shí)。在種子瓶中的培養(yǎng)時(shí)間為ND3，18小時(shí)；ND4，18小時(shí)。由種子瓶接入發(fā)酵罐的接種量為ND3，1％；ND4，1.5％。
以平板計(jì)數(shù)測(cè)定有效活菌總數(shù)，結(jié)果為ND3發(fā)酵液，含有約8.0×108個(gè)ND3/毫升；ND3粉劑，含有4.8×109個(gè)ND3/克；ND4發(fā)酵液，含有約3.6×108個(gè)ND4/毫升；
ND4粉劑，含有2.1×109個(gè)ND4/克；將實(shí)施例7中制備的ND1粉劑、ND2粉劑和本實(shí)施例中制得的ND3粉劑和ND4粉劑按等比混合均勻，制得一種粒度為80-100目的白色粉末狀的活性菌劑組合物，其中有效活菌總數(shù)的含量為約9.4×109/克。實(shí)施例10生物活性拌種劑的制備使用實(shí)施例9制得的組合物，用草炭(內(nèi)蒙古，吳川縣)為載體，并添加磷酸二氫鉀、腐植酸鉀，按以下工序生產(chǎn)。以400±20℃對(duì)載體高溫滅菌細(xì)粉碎達(dá)到80-100目；二次滅菌；在無(wú)菌間按照1∶12∶0.05∶0.005配方將上述原料摻混。對(duì)所得產(chǎn)品用肉眼測(cè)外觀，按NY/T302-1995測(cè)含水量，按NY-227標(biāo)準(zhǔn)測(cè)有機(jī)質(zhì)含量，按GB15063-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)粒度，有效活菌數(shù)和雜菌含量按照NY-227-9標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。按NY-227-94pH測(cè)定法測(cè)pH。所測(cè)結(jié)果列于下表9中。實(shí)施例11生物活性菌粒的制備選用草炭(內(nèi)蒙古，吳川縣)為載體，選用污泥作粘合劑，按下述基本工序生產(chǎn)對(duì)載體以400±20℃進(jìn)行高溫烘干滅菌，時(shí)間為12分鐘；對(duì)滅菌烘干后的載體進(jìn)行細(xì)粉碎，要求60目；將實(shí)施例9制得的活性菌劑組合物、有機(jī)載體、污泥按1∶15∶13的比例，經(jīng)機(jī)械式攪拌均勻使用圓盤造粒機(jī)，加水20％造粒。將成品于料溫溫度70℃烘干；經(jīng)自然冷卻處理，降低產(chǎn)品溫度、水份，增強(qiáng)硬度。對(duì)所得產(chǎn)品用肉眼測(cè)外觀，按NY/T302-1995測(cè)含水量，按NY-227-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)有機(jī)質(zhì)含量，按GB15063-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)粒度和抗壓碎力，有效活菌數(shù)、雜菌含量和pH按照NY-227-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。所測(cè)結(jié)果列于下表9中。
表9
實(shí)施例12生物活性復(fù)混肥的制備按照與實(shí)施例11同樣的方法制備生物菌粒，只是將實(shí)施例9的活性菌劑組合物、有機(jī)載體和污泥按3∶13∶15的比例摻混后造粒，制得制備生物活性復(fù)混肥的生物菌粒。將尿素、過磷酸鈣、硫酸鉀、硼砂、硫酸錳和硫酸鋅按1∶0.71∶1.92∶0.006∶0.016∶0.02的比例稱料660Kg，加草炭340Kg，按一般復(fù)混肥生產(chǎn)工藝制備無(wú)機(jī)顆粒。將所制得的無(wú)機(jī)顆粒和生物顆粒按70∶30的比例摻混，制成生物活性復(fù)混肥。對(duì)所得產(chǎn)品用肉眼測(cè)外觀，按GB8576-885復(fù)混肥料中游離水含量測(cè)定(真空烘箱法)測(cè)游離水量，按NY-227-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)有效活菌總數(shù)、雜菌率、pH和有機(jī)質(zhì)含量，按GB15063-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)粒度及N、P、K和微量元素的含量。所測(cè)結(jié)果列于下表10中。實(shí)施例13生物活性顆粒摻混肥的制備分別生產(chǎn)生物菌粒和無(wú)機(jī)氮、磷、鉀三種單質(zhì)肥的顆粒，顆粒直徑為2-4毫米。生物菌粒按實(shí)施例11的方法生產(chǎn)；選用國(guó)產(chǎn)粉狀鉀肥(KCl，中國(guó)青海省制造)，將KCl、硼砂、硫酸錳、硫酸鋅按70∶10∶10∶10的比例稱料，按復(fù)混肥生產(chǎn)工藝生產(chǎn)鉀肥顆粒；選用粒度、強(qiáng)度、含水率、含養(yǎng)量等符合標(biāo)準(zhǔn)的氮肥(中國(guó)海南化肥廠生產(chǎn)的大顆粒尿素)、磷肥顆粒(美國(guó)生產(chǎn)的磷酸二銨)；按1∶1∶1∶1將四種顆粒摻混。對(duì)所得產(chǎn)品用肉眼測(cè)外觀，按GB8576-885復(fù)混肥料中游離水含量測(cè)定(真空烘箱法)測(cè)游離水量，按NY-227-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)有效活菌總數(shù)、雜菌率、pH和有機(jī)質(zhì)含量，按GB15063-94標(biāo)準(zhǔn)測(cè)粒度及N、P、K和微量元素的含量。所測(cè)結(jié)果列于下表10中。表10
實(shí)施例14本發(fā)明生物活性菌劑組合物的效果盆載及大田試驗(yàn)顯示，本發(fā)明實(shí)施例9的生物活性菌劑組合物的增產(chǎn)幅度為9.95-53.5％。我們?cè)O(shè)計(jì)了嚴(yán)格的盆載試驗(yàn)、三角瓶試驗(yàn)、大田試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)材料的光合面積和光合強(qiáng)度、根系吸收面積及根系活力、土壤固氮酶活性變化等進(jìn)行了測(cè)定。具體的測(cè)定步驟和結(jié)果如下1.增大葉面積、增加葉綠素含量。
取相應(yīng)位置葉片稱取1-2g，乙醇提取，分光光度計(jì)比色，讀取消光值，按公式計(jì)算出葉綠素含量(mg/g鮮葉)=(C×25)/G。C=D652/34.5。結(jié)果如下表11增加葉綠素含量(mg/g)
表12增加葉面積(cm2)
作物的產(chǎn)量，不管是子粒還是莖葉，都是光合作物的產(chǎn)物，沒有光合作用就沒有產(chǎn)量可言。光合作用的強(qiáng)弱取決于葉面積大小和光合強(qiáng)度。葉綠素是吸收光能的物質(zhì)。從上表可以看出所試作物葉綠素含量普遍增加，增幅達(dá)45-70％。葉面積增幅達(dá)17-100％。這就大大提高了光能利用率，增加了光合產(chǎn)物的合成。
2.擴(kuò)大根系吸收面積、增強(qiáng)根系活力稱取根1-2g，用α-奈胺氧化法測(cè)定根系活力。根據(jù)光密度值查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得相應(yīng)的α-奈胺濃度。根系氧化的α-奈胺量=試驗(yàn)開始時(shí)的α-奈胺量-自動(dòng)氧化值-結(jié)束時(shí)α-奈胺量。被氧化的α-奈胺量以μg/單位根重/小時(shí)表達(dá)。結(jié)果如下表13所列
表13 從上表可知，根重和根系活力均有增加，增幅分別為23-29％、48-57％。由于養(yǎng)分吸收面積和吸收強(qiáng)度的增加，這就保證提供給植物更多的養(yǎng)分和水分，使作物合成更多的蛋白、脂肪、糖類等物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、代謝，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量。
3.增強(qiáng)土壤固氮酶活性在水稻盆載和田間試驗(yàn)中，在不同生育期取根際土樣測(cè)定固氮酶活性。具體方法是每隔17天用原位法取樣測(cè)定ARA，取樣時(shí)用直徑4cm、高11cm的銅管取根際原柱土樣連同土管放入廣口瓶中，密封，抽出10％的氣體，再換入10％的乙炔氣體，30℃培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)ARA，每個(gè)處理三次重復(fù)，并設(shè)不加乙炔對(duì)照。
試驗(yàn)田的土壤的ARA值一直比對(duì)照高，抽穗時(shí)出現(xiàn)高峰，試驗(yàn)的ARA值明顯高于對(duì)照。
通過以上的說明可以看出本發(fā)明的固氮菌是一種耐熱、耐干的有芽孢的固氮菌。與單一菌劑的效果相比，本發(fā)明混合菌劑的固氮作用更強(qiáng)，效果更好。本發(fā)明的生物活性肥制品耐熱、耐干，所以易于儲(chǔ)存、運(yùn)輸和施用。
權(quán)利要求
1．一種固氮菌ND1，是一種球型芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)，其保藏編號(hào)為CGMCC-----。
2．一種固氮菌劑，該菌劑是權(quán)利要求1的固氮菌ND1的發(fā)酵培養(yǎng)液，其中含有1.0×108-2.0×109個(gè)ND1/毫升。
3．一種固氮菌劑，所述菌劑為粉末或顆粒狀固體，由權(quán)利要求2的固氮菌劑經(jīng)進(jìn)一步加入載體、干燥、粉碎制得，其中含有5.0～7.0×108-1.0～1.4×1010個(gè)ND1/克。
4．按照權(quán)利要求3的固氮菌劑，其中的載體為碳酸鈣、高嶺土、膨潤(rùn)土中的一種或多種，該載體的添加量為3-5wt％。。
5．權(quán)利要求4的固氮菌劑，其中的載體為碳酸鈣，該菌劑至少含有7.0×109個(gè)ND1/克。
6．權(quán)利要求3、4或5的固氮菌劑，其中的顆粒大小為80-100目。
7．一種固氮菌ND2，是一種巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，其保藏編號(hào)為CGMCC-----。
8．一種固氮菌劑，該菌劑是權(quán)利要求7的固氮菌ND2的發(fā)酵培養(yǎng)液，其中含有1.0×107-4.0×108個(gè)ND2/毫升。
9．一種固氮菌劑，所述菌劑為粉末或顆粒狀固體，由權(quán)利要求8的固氮菌劑經(jīng)進(jìn)一步加入載體、干燥、粉碎制得，其中含有5.0～7.0×107-2.0～2.8×109個(gè)ND2/克。
10．按照權(quán)利要求9的固氮菌劑，其中的載體為碳酸鈣、高嶺土、膨潤(rùn)土中的一種或多種，該載體的添加量為3-5％。
11．權(quán)利要求10的固氮菌劑，其中的載體為碳酸鈣，該菌劑至少含有2.0×108個(gè)ND2/克。
12．權(quán)利要求9、10或11的固氮菌劑，其中的顆粒大小為80-100目。
13．一種生物活性菌劑的組合物，含有按0.5～1∶0.5～1的比例配合的如權(quán)利要求4和10所述的固氮菌劑，其中的有效活菌總數(shù)為3.0×109～1.2×1010／克。
14．權(quán)利要求13的生物活性菌劑的組合物，還含有相當(dāng)于ND1的孢粉量0.5～1倍的解磷菌的孢粉，其中，有效活菌總數(shù)為3.0×109～1.2×1010/克。
15．權(quán)利要求13的生物活性菌劑的組合物，還含有相當(dāng)于ND1的孢粉量0.5～1倍的解鉀菌的孢粉，其中，有效活菌總數(shù)為3.0×109～1.2×1010/克。
16．權(quán)利要求13的生物活性菌劑的組合物，還含有分別相當(dāng)于ND1的孢粉量0.5～1倍的解鉀菌的孢粉和解磷菌的孢粉，其中，有效活菌總數(shù)為3.0×109～1.2×1010/克。
17．權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的生物活性菌劑的組合物，其中的載體為碳酸鈣，有效活菌總數(shù)至少為7.0×109/克。
18．權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的生物活性菌劑的組合物，其中的顆粒大小為80-100目。
19．權(quán)利要求17的生物活性菌劑的組合物，其中的顆粒大小為80-100目。
20．權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的生物活性菌劑的組合物，還含有與所述活性菌劑按1∶10～30的比例配合的有機(jī)質(zhì)，其中，有效活菌總數(shù)為1.0×108～1.2×109/克。
21．權(quán)利要求20的生物活性菌劑的組合物，其中所述的有機(jī)質(zhì)為選自污泥、垃圾、糞便、秸桿、草炭等中的一種或多種的混合物，該組合物中的顆粒大小為80-100目，其中，有效活菌總數(shù)至少為4.0×108/克。
22．權(quán)利要求21的生物活性菌劑的組合物，其中所述的有機(jī)質(zhì)為草炭。
23．權(quán)利要求13～16中任一項(xiàng)所述的生物活性菌劑的組合物，還含有與所述活性菌劑按1∶30～40的比例配合的有機(jī)質(zhì)，其中有效活菌總數(shù)為1.0×107～6.0×107/克。
24．權(quán)利要求23的生物活性菌劑的組合物，其中所述的有機(jī)質(zhì)為選自污泥、垃圾、糞便、秸桿、草炭等中的一種或多種的混合物，該組合物是顆粒大小為2.5-4.5毫米的顆粒，其中，有效活菌總數(shù)至少為2.5×107/克。
25．權(quán)利要求24的生物活性菌劑組合物，其中所述的有機(jī)質(zhì)為草炭。
26．權(quán)利要求24的生物活性菌劑組合物，其中所述的有機(jī)質(zhì)為動(dòng)物糞便。
27．權(quán)利要求1或7所述的固氮菌、權(quán)利要求2-6、8-12中任一項(xiàng)所述的固氮菌劑或權(quán)利要求13-26中任一項(xiàng)所述的生物活性菌劑的組合物用于制備生物活性肥制品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了兩株新的有芽孢固氮菌,它們耐干、耐熱、耐鹽,并有很高的固氮酶活性,可用于制備生物活性菌劑及其組合物和生物活性肥制品等。
文檔編號(hào)C05F11/08GK1285401SQ99111599
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1999年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者崔宗均, 程又明, 謝光輝, 曾飛 申請(qǐng)人:中國(guó)華聯(lián)國(guó)際服務(wù)聯(lián)合公司