一種目標(biāo)根瘤菌在苜蓿植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法
【專利說(shuō)明】-種目標(biāo)根瘤菌在首清植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的巧進(jìn)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 根瘤菌與豆科植物的共生固氮作用不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，同時(shí)在在農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)中，人工接種根瘤菌來(lái)促進(jìn)作物生長(zhǎng)和提高種子產(chǎn)量也成為一種常見的農(nóng)業(yè)措施。 但由于植物種類與根瘤菌種類及外在特殊的自然環(huán)境、接種方法、與±著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)及 多種生物與非生物的脅迫均可影響接種根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，使部分根瘤菌難W高效地 進(jìn)行結(jié)瘤固氮，難W達(dá)到應(yīng)有的增產(chǎn)效果。已有研究發(fā)現(xiàn)首猜種子攜帶有的內(nèi)生根瘤菌與 ±著根瘤菌相比，在結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。種子及植株體內(nèi)的根瘤菌屬于內(nèi)生菌范 疇，內(nèi)生菌的接種方式及植物體的健康狀況對(duì)內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的成功定殖與功能發(fā)揮起 著決定性作用。但目前，對(duì)根瘤菌在首猜植株體內(nèi)運(yùn)移進(jìn)入種子的途徑和種子內(nèi)定殖機(jī)理 及影響根瘤菌在植株及種子內(nèi)運(yùn)移定殖等研究較少。研究發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期首猜由莖中部注 射接種標(biāo)記菌時(shí)，IAA對(duì)內(nèi)源菌的運(yùn)移有促進(jìn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)采用根系回接與切根浸根瘤重栽接 種根瘤菌菌液相比，切根瘤重栽接種能使更多標(biāo)記根瘤菌進(jìn)入首猜根部。由此說(shuō)明篩選促 進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期首猜體內(nèi)目標(biāo)根瘤菌的方法對(duì)導(dǎo)入目標(biāo)根瘤菌具有一定指導(dǎo)意義，但篩選的 接種方法是否同樣利于生殖生長(zhǎng)期的首猜還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。而對(duì)于首猜-根瘤菌組合體 育種的例子也只初步做了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的研究報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該育種方法的研究較 少。利用根瘤菌的運(yùn)移通道改變種子內(nèi)生根瘤菌比例的研究尚處初步階段，對(duì)如何提高種 子內(nèi)目標(biāo)根瘤菌的數(shù)量，如何將目標(biāo)根瘤菌與首猜良種精準(zhǔn)高效組合，也尚屬空白。故探索 提高首猜植株及種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量，通過外源物質(zhì)的干擾來(lái)促進(jìn)大量目標(biāo)根瘤菌運(yùn)移并 定殖于首猜植株及種子內(nèi)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良根瘤菌與優(yōu)良首猜品種的精準(zhǔn)高效組合成為必然。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植 株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法。
[000引為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植株體內(nèi) 運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法，包括W下步驟： 1)選擇菌株:選取的巧光標(biāo)記根瘤菌I^iizobium meliloti .GN5f (R.GN5f)，其原始菌株 Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)為分離自甘農(nóng)5號(hào)紫花首猜（Medicago sativa cv .Gannong No. 5)根瘤的優(yōu)良根瘤菌株;通過Ξ親本雜交獲得含有青色巧光蛋白（CFP)的內(nèi) 源巧光標(biāo)記根瘤菌R.GN5f; (原始及巧光標(biāo)記根瘤菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供， 原始菌株已由中科院微生物研究所菌種保藏中屯、鑒定，全名為草木犀劍菌（Ensifer meliloti LZgn5)，編號(hào)為 101220,2013微檢字第133號(hào)）。
[0006] 2)選取植物材料:首猜材料為甘農(nóng)5號(hào)紫花首猜； 3) 制備菌液:將步驟1)的菌株TY平板活化后轉(zhuǎn)接入50mlTY液體培養(yǎng)基，28°C、180巧m/ min振蕩培養(yǎng)至菌液光密度0〇6日血。值為0.5-1，4000巧m/min離屯、5min，拋去上清液后用等體 積的無(wú)菌水沖洗菌體，并用滿振蕩器將其打散，最后用無(wú)菌水調(diào)制成ODsQQnm為0.5的R.GN5f 巧光標(biāo)記根瘤菌液； 4) 添加苦參堿:選取的苦參堿濃度為600mg/L，含量為1.3%，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)苦參堿溶液 用0.22WI1無(wú)菌濾膜和無(wú)菌針管過濾滅菌后，添加至培養(yǎng)好的菌液中，至終濃度600mg/l; 5) 接種:分別隨機(jī)選取現(xiàn)蕾期、初花期、結(jié)芙期的首猜植株5株，根部10cm范圍內(nèi)挖深約 5cm坑，露出主根、側(cè)根、毛根，將制備好的巧光標(biāo)記根瘤菌液按50ml/株均勻誘灌于根部，爾 后覆±埋根;未添加苦參堿的R. GN5f接種為對(duì)照； 6) 檢測(cè)時(shí)期及檢測(cè)組織： a) 現(xiàn)蕾期~成熟期:檢測(cè)根、莖、葉、花、種子； b) 開花期~成熟期:檢測(cè)根、莖、葉、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱頭、花雄 蕊的花藥、花雄蕊的花絲、花瓣； C)結(jié)芙期~成熟期:檢測(cè)幼嫩種子、成熟種子、芙果皮； 7) 檢測(cè)方法： ①取樣:分別于現(xiàn)蕾期、初花期、結(jié)芙期采用添加苦參堿菌液誘灌的接種方法，接種后 的5(1、15(1、30(1、60(1取樣檢測(cè)分析，直至種子收獲，^未添加苦參堿的菌液誘灌為對(duì)照;取首 猜單株，隨機(jī)分離出5-10畑1深±層的毛根，莖、葉均隨機(jī)取自同一植株，且分離為上部莖、下 部莖、上部葉和下部葉、花絲、花瓣、胚珠、花柱、柱頭、花藥、芙果皮和種子;取樣用自來(lái)水沖 洗干凈后自然驚干； 芭手提紫外燈平板數(shù)量檢測(cè):根、莖、葉各稱取Ig，花5朵/花序、芙果皮5個(gè)/花序、種子 5粒/花序，放入50ml無(wú)菌Ξ角瓶?jī)?nèi)，加入有效艦濃度為2500mg/L的艦伏消毒液淹沒，震蕩消 毒4min后無(wú)菌水沖洗5次，至Ξ角瓶?jī)?nèi)無(wú)泡沫狀液體出現(xiàn)即可，完全消毒的組織分別置于無(wú) 菌研鉢中，加入2ml無(wú)菌水充分研磨后離屯、，離屯、轉(zhuǎn)速為4000rpm/min，離屯、時(shí)間為5min，吸 取0.2ml上清液均勻涂布于根研磨液依次稀釋1〇1-10 3的TY固體培養(yǎng)基，Ξ次重復(fù)，28°C培養(yǎng) 24-4化后，黑暗中手提紫外燈下記錄每皿內(nèi)巧光標(biāo)記根瘤菌數(shù)量，巧光標(biāo)記根瘤菌在手提 紫外燈下發(fā)青綠色光； ③體式巧光顯微鏡檢測(cè)：黑白體式巧光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測(cè) 中，含CFP標(biāo)記根瘤菌的首猜組織為白色，未檢出的組織為黑色。
[0007] 進(jìn)一步的，上述的一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法，TY培 養(yǎng)基的制備方法為:膜蛋白腺5g/L、酵母粉3g/L、CaCh ·細(xì)2〇 1.3g/L，抑至7.0，12rC滅菌 26min〇
[0008] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖 的促進(jìn)方法，其主要優(yōu)點(diǎn)有： 1) 選取的目標(biāo)根瘤菌R. GN5f通過Ξ親本雜交獲得，該菌株的遺傳穩(wěn)定性好，獲得容易， 使用方便； 2) 選取的苦參堿，在600mg/L濃度下對(duì)空氣源和±壤源微生物抑制，對(duì)根瘤菌無(wú)抑制作 用，反而促進(jìn)根瘤菌在首猜體內(nèi)的運(yùn)移和定殖;且苦參堿價(jià)格低廉，對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害； 3) 獲得含苦參堿的巧光標(biāo)記根瘤菌液容易，接種操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，適宜生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi) 可隨時(shí)接種，接種方便； 4) 添加苦參堿后明顯促進(jìn)了目標(biāo)根瘤菌由根部向地上莖、葉、花、種子內(nèi)運(yùn)移和定殖， 為獲得攜帶有大量目標(biāo)根瘤菌種子奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為添加苦參堿接種R.GN5f在種子內(nèi)定殖數(shù)量:A-紫外燈(336nm)下平板檢測(cè)； B-體式巧光顯微鏡下觀察。C-未添加苦參堿接種R. GN5f種子內(nèi)未檢測(cè)R. GN5f。
[0010]圖2為紫外燈(336nm)下檢測(cè)花期胚珠內(nèi)R.GN5f數(shù)量:A-單獨(dú)接種;B-添加苦參堿 后接種。
[0011]圖3為體式巧光顯微鏡觀察添加苦參堿接種R.GN5f在根內(nèi)定殖狀況:A-毛根;C-側(cè) 根中柱;E-側(cè)根皮層;及未添加苦參堿接種R. GN5f在根內(nèi)定殖狀況:B-毛根;D-側(cè)根中柱;F-側(cè)根皮層。
【具體實(shí)施方式】 [001引實(shí)施例1: 一種目標(biāo)根瘤菌在首猜植株體內(nèi)運(yùn)移和定殖的促進(jìn)方法，包括W下步驟： 1) 選擇菌株:選擇通過Ξ親本雜交獲得含有青色巧光蛋白（CFP)的內(nèi)源巧光標(biāo)記根瘤 菌R.GN5f。（原始及巧光標(biāo)記菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供， 原始菌株已由中科院微生物研究所菌種保藏中屯、鑒定生化特性并測(cè)定16SRNA序列） 2) 選取植物材料:植物材料為甘農(nóng)5號(hào)紫花首猜； 3) 制備菌液:將步驟1)的菌株TY平板活化后轉(zhuǎn)接入50mlTY液體培養(yǎng)基，28°C、180巧m/ 111；[]1振蕩培養(yǎng)至菌液光密度0〇6日血111值為0.5-1，4000巧111/111；[]1離屯、5111；[]1，拋去上清液后用 等體積的無(wú)菌水沖洗菌體，并用滿振蕩器將其打散，最后用無(wú)菌水調(diào)制成0化OOnm為0.5的 R.GN5f巧光標(biāo)記根瘤菌液； 4) 添加苦參堿:選取的苦參堿濃度為600mg/L，含量為1.3%，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)苦參堿溶液 用0.22WI1無(wú)菌濾膜和無(wú)菌針管過濾滅菌后，添加至培養(yǎng)好的菌液中，至終濃度600mg/l; 5) 接種:分別隨機(jī)選取現(xiàn)蕾期、初花期、結(jié)芙期的首猜植株5株，根部10cm范圍內(nèi)挖深約 5cm坑，露出主根、側(cè)根、毛根，將制備好的巧光標(biāo)記根瘤菌液按50ml/株均勻誘灌于根部，爾