專(zhuān)利名稱：一種抗污染根瘤菌劑及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物肥料，具體地，涉及一種抗污染根瘤菌劑及其制作方法。
背景技術(shù)：
目前，根瘤菌劑作為豆科作物和牧草的微生物促生肥料，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中，無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，增產(chǎn)作用明顯，增產(chǎn)幅度達(dá)10%-30%，用于新墾或低產(chǎn)田的增 產(chǎn)效果更達(dá)71. 2%-241%。國(guó)內(nèi)外都在積極研究和應(yīng)用。我國(guó)的微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用已 有近50年的歷史。近幾年來(lái)不但生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大，數(shù)量增加，還發(fā)展了一些新的品種和劑型。但是，在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，設(shè)計(jì)人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)根瘤菌劑生產(chǎn)和應(yīng)用中面臨 的主要問(wèn)題有(1)菌劑的污染菌劑中有著適宜微生物繁衍的營(yíng)養(yǎng)和溫度濕度等條件，在生產(chǎn)、 運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中，任何微小的疏忽和破損都極易造成自然環(huán)境中雜菌的侵入，往往引起 整批次或整包裝菌劑的嚴(yán)重污染。某些雜菌污染后憑肉眼無(wú)法識(shí)別，只有在施用后才發(fā)現(xiàn) 失去增產(chǎn)效應(yīng)甚至造成減產(chǎn)，產(chǎn)生不可挽回的損失，嚴(yán)重地?fù)p害了菌劑生產(chǎn)廠家的聲譽(yù)和 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)利益。國(guó)家微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)(GBNY227-1994)中對(duì)菌劑的雜菌率限制在 10%以下，但目前的根瘤菌劑面臨著8% -32%的高污染率，故尋求降低污染率的生產(chǎn)工藝 和方法成為菌劑生產(chǎn)中的核心問(wèn)題。目前低污染率菌劑制作中的防污染措施主要采取嚴(yán)格控制生產(chǎn)和存儲(chǔ)環(huán)境凈度， 提高封裝質(zhì)量，菌劑低營(yíng)養(yǎng)化(低碳源)及以用海藻酸鈉或其它包埋材料對(duì)菌種進(jìn)行固定 化包埋的方法，取得了較為明顯的結(jié)果。這些方法對(duì)于生產(chǎn)的無(wú)菌條件要求苛刻，對(duì)生產(chǎn)設(shè) 備和工藝有很高的要求，菌劑生產(chǎn)成本高，難以為中小型菌劑生產(chǎn)廠家所接受，不便于大范 圍的推廣和應(yīng)用。(2)根瘤菌劑中的根瘤菌株與土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)由于土著根瘤菌完全適應(yīng)當(dāng)?shù)?的土壤環(huán)境，競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，故新接種的根瘤菌難以形成優(yōu)勢(shì)群落，使得占瘤率低下，高效固氮 根瘤的比率減少，增產(chǎn)效應(yīng)受到限制和弱化。因此如何提高引入菌株在土壤菌落環(huán)境中的 競(jìng)爭(zhēng)能力，一直都是科研機(jī)構(gòu)和菌劑研發(fā)部門(mén)研究的重點(diǎn)。目前提高目的根瘤菌株占瘤率的措施多集中在上游篩選研究階段，多以基因工程 的途經(jīng)提高菌株結(jié)瘤因子的表達(dá)強(qiáng)度，由此來(lái)提高目的菌株對(duì)土著菌株的結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)力。但 由于根瘤菌株種類(lèi)繁多，作物生境變化多樣，不可能就每一種作物在每一個(gè)生境下進(jìn)行相 應(yīng)根瘤菌株的基因改良。因此多年以來(lái)難以利用于實(shí)際生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)根瘤菌劑生產(chǎn)和應(yīng)用中存在的上述缺陷，提出一種 抗污染根瘤菌劑及其制作方法，以達(dá)到降低菌劑污染率、提高目的菌株競(jìng)爭(zhēng)力和有效活菌 數(shù)，有效降低菌劑的保存和運(yùn)輸成本等作用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種抗污染根瘤菌劑，包括耐抗
3生素根瘤菌菌株的發(fā)酵菌液及相應(yīng)的抗生素，所述的相應(yīng)的抗生素在發(fā)酵菌液中的終濃度 為 100 250mg/L。進(jìn)一步地，所述的耐抗生素根瘤菌菌株是耐抗生素紅豆草根瘤菌菌株或耐抗生素 苜蓿根瘤菌菌株。為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種抗污染根瘤菌劑的制備 方法，其特征在于，包括如下步驟(1)根瘤菌的輻照誘變利用微波輻照處理根瘤菌發(fā)酵菌液，進(jìn)行菌種的誘變；(2)抗藥突變菌株的篩選將上述處理后的根瘤菌菌液涂布于含抗生素300mg/L 400mg/L的YMA固體培養(yǎng) 基上，將在含抗生素培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)的根瘤菌進(jìn)行相應(yīng)根瘤菌植株的回接試驗(yàn)，對(duì) 結(jié)瘤能力和促生效果均強(qiáng)于出發(fā)菌株的突變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)，最終選擇耐藥特性遺傳穩(wěn) 定的菌株作為生產(chǎn)用耐抗生素根瘤菌菌株；(3)抗污染根瘤菌劑的生產(chǎn)將上述生產(chǎn)用耐抗生素根瘤菌菌株接入YMA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至菌液活菌含 量達(dá)到0.8X101(I UXliTcfu/ml時(shí)緩慢加入抗生素并逐漸攪拌，使菌液中的抗生素終 濃度達(dá)到100 250mg/L，即可制成抗污染根瘤菌劑。進(jìn)一步地，所述的根瘤菌是紅豆草根瘤菌或苜蓿根瘤菌。進(jìn)一步地，所述的抗污染根瘤菌劑可在10°C 15°C的溫度范圍內(nèi)保存，或在其中 加入滅菌泥炭。下面具體闡述本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步加以證 明。1、有效降低菌劑的污染率由于該方法在菌劑中添加抗生素，在生產(chǎn)和運(yùn)輸途中即使有少量雜菌接觸到菌 劑，也會(huì)由于抗生素的作用無(wú)法生存或受到抑制而使雜菌無(wú)法大量繁殖。降低了菌劑的污 染機(jī)率和污染程度。試驗(yàn)證明在高雜菌污染環(huán)境下放置90d后，普通固體菌劑的平均雜菌含量為 2. 27X 108cfu/g,雜菌率達(dá)19. 53%,而含抗生素的菌劑中雜菌污染率較低，如含200mg/L氨 芐青霉素的防污染固體菌劑平均雜菌率僅為0. 3% 1. 7%，雜菌中真菌和細(xì)菌的含量比 普通菌劑分別降低14. 5倍和11. 12倍，能夠有效降低雜菌的污染。2、活菌數(shù)高根瘤菌株經(jīng)過(guò)誘變和篩選后，具備抗生素耐藥性，不管在有無(wú)抗生素的環(huán)境下均 生長(zhǎng)良好，性質(zhì)穩(wěn)定。防污染菌劑在貯藏過(guò)程中，隨著菌劑水分的散失，抗生素的濃度略有 增大，對(duì)菌株產(chǎn)生微弱的代謝抑制，可促使菌株快速進(jìn)入休眠狀態(tài)，減少了在儲(chǔ)存過(guò)程中由 于菌株代謝旺盛，營(yíng)養(yǎng)過(guò)度消耗而逐漸增大的菌株死亡率，提高了活菌數(shù)量。試驗(yàn)證明紅豆草和苜?？刮廴竟腆w根瘤菌劑在保存65d后活菌含量分別達(dá) 到6. 26X 109cfu/g和2. llX1010cfu/g,分別是其普通固體菌劑活菌含量的302. 41 %和 418. 65%，統(tǒng)計(jì)分析表明差異極顯著(P <0.01)。3、抑制土著根瘤菌，提高占瘤率
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抗污染菌劑在使用時(shí)，其中的抗生素在稀釋后濃度降低，但仍可對(duì)土著根瘤菌起 到抑制的作用，為目的菌株創(chuàng)造利于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的環(huán)境，使占瘤率增大，菌劑肥效作用更為明
Mo試驗(yàn)證明將篩選出的菌株制備成普通菌劑和添加了 200mg/L氨芐青霉素的抗 污染菌劑，通過(guò)含抗生素平板檢測(cè)法分別對(duì)使用普通菌劑和抗污染菌劑處理的苜蓿(或紅 豆草)植株上的根瘤進(jìn)行檢測(cè)，普通菌劑目的菌株的平均占瘤率為58.07% (紅豆草)和 73.12% (苜蓿)，而抗污染菌劑處理的植株，目的菌株的占瘤率為68. 67% (紅豆草)和 89. 33% (苜蓿)，差異顯著(P < 0. 05)。4、抑制土壤群落中的有害菌，減少農(nóng)藥使用量抗生素對(duì)很多的土壤病原菌有很好的抑制作用。由于根瘤菌劑多用于拌種和苗期 使用，菌劑中抗生素的降解過(guò)程與植物的生長(zhǎng)過(guò)程同步，在降解完成、藥效失去作用之前， 可以為幼苗期植株根系提供保護(hù)，減少農(nóng)藥的使用量，降低了土壤的農(nóng)藥污染。5、降低菌劑生產(chǎn)過(guò)程對(duì)無(wú)菌環(huán)境的要求該技術(shù)通過(guò)菌劑本身的抗污染特性，能夠降低菌劑生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)無(wú)菌環(huán)境的嚴(yán)格 要求，使菌劑生產(chǎn)廠家在設(shè)備和廠房上減少了投入，在保證品質(zhì)的前提下降低了菌劑的生 產(chǎn)成本。6、使用簡(jiǎn)便，易于掌握該技術(shù)涉及的耐藥性菌株選育方法便于操作，能夠適應(yīng)一般的生產(chǎn)和研發(fā)環(huán)境。7、適宜于規(guī)模推廣和應(yīng)用該方法可直接利用現(xiàn)有常規(guī)菌劑的生產(chǎn)設(shè)備，不需要進(jìn)行設(shè)備的改造和更新，僅 需在工藝流程上做相應(yīng)的調(diào)整，菌株的誘變方法簡(jiǎn)便易行，抗生素和泥炭等原料易于獲得。 因此降低了企業(yè)的技術(shù)改造和生產(chǎn)成本，適宜于規(guī)?；a(chǎn)和大范圍的推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1通過(guò)利用微波照射(800W，lmin, 200ml菌液，菌液600nm光吸收值為0. 5)處理 高效促生紅豆草根瘤菌(Rhizobium Onobrychis vicilfolia)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)的發(fā)酵菌液，將處理后的紅豆草根瘤菌和苜蓿根瘤菌菌液分別涂布于含氨芐青 霉素300mg/L和400mg/L的YMA培養(yǎng)基上，將在含藥培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)的根瘤菌株進(jìn) 行紅豆草(苜蓿)植株的回接試驗(yàn)以測(cè)定其結(jié)瘤能力和促生效果。對(duì)結(jié)瘤能力和促生效果 均強(qiáng)于出發(fā)菌株的突變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)，最終選擇耐藥特性遺傳穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)用 耐抗生素根瘤菌菌株；誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受氨芐青霉素環(huán)境(300mg/L)的紅豆草根瘤菌突變菌株和耐受氨芐 青霉素環(huán)境(400mg/L)的苜蓿根瘤菌突變菌株。這一微波誘變條件的正突變率最高，獲得 的根瘤菌突變菌株性狀優(yōu)良，遺傳穩(wěn)定的正突變菌株數(shù)量最多。將兩種突變菌株接入YMA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至菌液活菌含量達(dá)到1 X IO10Cfu/ mL時(shí)緩慢加入氨芐青霉素并逐漸攪拌，使菌液中的氨芐青霉素終濃度達(dá)到200mg/L，將此菌液在10°C 15°c的溫度范圍內(nèi)保存，或?qū)⒃摼禾砑尤霚缇嗵考纯芍瞥煞牢廴揪鷦?00mg/L氨芐青霉素濃度對(duì)環(huán)境雜菌的抑制效果達(dá)到800mg/L濃度下的97 %，而 抗性菌株的生長(zhǎng)正常，菌株繁殖速度與無(wú)抗生素培養(yǎng)條件相同，加入滅菌泥炭制成防污染 菌劑在儲(chǔ)藏120d后的雜菌率僅為市面上購(gòu)得的普通根瘤菌劑雜菌率的11. 89% 4.7%， 統(tǒng)計(jì)分析表明差異極顯著(P < 0. 01)。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種抗污染根瘤菌劑，其特征在于，包括耐抗生素根瘤菌菌株的發(fā)酵菌液及相應(yīng)的抗生素，所述的相應(yīng)的抗生素在發(fā)酵菌液中的終濃度為100～250mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗污染根瘤菌劑，其特征在于，所述的耐抗生素根瘤菌菌株 是耐抗生素紅豆草根瘤菌菌株或耐抗生素苜蓿根瘤菌菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗污染根瘤菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)根瘤菌的輻照誘變利用微波輻照處理根瘤菌發(fā)酵菌液，進(jìn)行菌種的誘變；(2)抗藥突變菌株的篩選將上述處理后的根瘤菌菌液涂布于含抗生素300mg/L 400mg/L的YMA固體培養(yǎng)基 上，將在含抗生素培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)的根瘤菌進(jìn)行相應(yīng)根瘤菌植株的回接試驗(yàn)，對(duì)結(jié) 瘤能力和促生效果均強(qiáng)于出發(fā)菌株的突變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)，最終選擇耐藥特性遺傳穩(wěn)定 的菌株作為生產(chǎn)用耐抗生素根瘤菌菌株；(3)抗污染根瘤菌劑的生產(chǎn)將上述生產(chǎn)用耐抗生素根瘤菌菌株接入YMA液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至菌液活菌含量達(dá) 到0.8 X IOltl 1.2 X IOltlCfuAil時(shí)緩慢加入抗生素并逐漸攪拌，使菌液中的抗生素終濃度 達(dá)到100 250mg/L，即可制成抗污染根瘤菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗污染根瘤菌劑的制備方法，其特征在于，所述的根瘤菌是 紅豆草根瘤菌或苜蓿根瘤菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的抗污染根瘤菌劑的制備方法，其特征在于，所述的抗污染 根瘤菌劑可在10°c 15°c的溫度范圍內(nèi)保存，或在其中加入滅菌泥炭。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗污染根瘤菌劑，包括耐抗生素根瘤菌菌株的發(fā)酵菌液及相應(yīng)的抗生素，所述的相應(yīng)的抗生素在發(fā)酵菌液中的終濃度為100～250mg/L。同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)了一種抗污染根瘤菌劑的制備方法，包括根瘤菌的輻照誘變，抗藥突變體的篩選，及抗污染根瘤菌劑的生產(chǎn)等步驟，本發(fā)明的一種抗污染根瘤菌劑，可以克服現(xiàn)有技術(shù)中根瘤菌劑高污染率、目的菌株與土著根瘤菌的低競(jìng)爭(zhēng)力等缺陷，以實(shí)現(xiàn)在降低菌劑污染率、提高菌株競(jìng)爭(zhēng)力、增大有效活菌數(shù)的同時(shí)可有效降低菌劑的保存和運(yùn)輸成本。
文檔編號(hào)C05F11/08GK101935238SQ20091015722
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者劉建榮, 師尚禮, 張淑卿, 曹文俠, 李劍峰, 祁娟 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)