一株根瘤菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株根瘤菌及其應(yīng)用，它涉及一株根瘤菌及其應(yīng)用。本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有大豆接種的根瘤菌在長期連作的條件下競爭結(jié)瘤能力和固氮酶活性差的問題，本發(fā)明一株根瘤菌，它為海倫慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?hailunense）S-S20131G64，已于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年1月10日，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8693。本發(fā)明的應(yīng)用是指在長期大豆連作的土壤上的應(yīng)用。本發(fā)明的根瘤菌具有高效結(jié)瘤的特性，能夠提高大豆生物量，改善大豆氮素營養(yǎng)，適用于黑龍江省長期大豆連作土壤區(qū)。本發(fā)明應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。
【專利說明】一株根瘤菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株根瘤菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是大豆生產(chǎn)和消費(fèi)大國，由于人口的不斷怎加導(dǎo)致大豆的消費(fèi)量也在不斷地增長，供需矛盾十分緊張。為了滿足人們對大豆產(chǎn)品的需求，農(nóng)民不得不在有限的耕地上連續(xù)種植大豆，目前大豆連作面積已達(dá)35%以上,而大豆又是典型的不耐連作的作物,長期的連作會(huì)導(dǎo)致大豆結(jié)瘤、固氮能力下降、生長發(fā)育受阻，多種病蟲害連年發(fā)生、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至絕產(chǎn)。目前用于大豆接種的根瘤菌大多來自于非長期連作條件下分離的根瘤菌，其抗逆能力、定殖能力、競爭結(jié)瘤能力、固氮酶活性等都不理想，影響了大豆的生產(chǎn)。因此篩選出能夠在長期大豆連作土壤上與大豆根系建立有效共生關(guān)系的高效根瘤菌對于大豆生產(chǎn)具有重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有大豆接種的根瘤菌在長期連作的條件下競爭結(jié)瘤能力和固氮酶活性差的問題，而提供一株根瘤菌及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明一株根瘤菌，它為海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobium hai Iunense )S-S20131G64，已于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年I月9日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8693。
[0005]本發(fā)明一株根瘤菌的應(yīng)用是指根瘤菌在長期大豆連作的土壤上的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明從黑龍江海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站長期大豆連作實(shí)驗(yàn)地選取地上部生長旺盛的大豆植株分離篩選出一株根瘤菌，菌落為圓形，乳白色半透明，粘質(zhì)較多，邊緣整齊，菌落表面光滑，培養(yǎng)5-7d后菌落直徑達(dá)0.8-2.0mm。挑取菌苔涂片，油鏡下觀察，根瘤菌為(0.5-0.8)X (1.1-0.3) μπι的小桿菌。內(nèi)含β -羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個(gè)或成對。對本發(fā)明所分離的菌株的recA序列進(jìn)行測序，將獲得的recA基因序列輸入GenBank，通過Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的recA基因序列與慢生根瘤菌屬的已有模式菌株具有較高的相似性，其中與B.1iaoningense的序列相似性為95.5%，從而確定分離出來的根瘤固氮菌S-S20131G64為慢生根瘤菌屬的新菌株系，并命名為海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobium hailunense) S-S20131G64。
[0007]本發(fā)明具有如下有益效果:1.本發(fā)明的根瘤固氮株系S-S20131G64具有高效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌至少能夠提高大豆生物量20-32%，可用于生產(chǎn)實(shí)踐中；2.通過接種本發(fā)明的根瘤固氮株系S-S20131G64，能夠改善大豆氮素營養(yǎng)，從而達(dá)到大豆高產(chǎn)且培肥土壤的目的；3.本發(fā)明的根瘤固氮菌株系S-S20131G64適用于黑龍江省長期大豆連作土壤區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為根瘤菌S-S20131G64在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0009]圖2為根瘤菌S-S20131G64在革蘭氏染色后在顯微鏡下的觀察圖像；
[0010]圖3為根瘤菌S-S20131G64的recA部分序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0012]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式一株根瘤菌為海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumhai lunense) S-S20131G64,已于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年I月9日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8693。
[0013]本實(shí)施方式的海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobium hai lunense) S-S20131G64應(yīng)用在長期大豆連作的土壤上。
[0014]本實(shí)施方式從黑龍江海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站長期大豆連作實(shí)驗(yàn)地選取地上部生長旺盛的大豆植株分離篩選出一株根瘤菌，菌落為圓形，乳白色半透明，粘質(zhì)較多，邊緣整齊，菌落表面光滑，培養(yǎng)5-7d后菌落直徑達(dá)0.8-2.0mm。挑取菌苔涂片，油鏡下觀察，根瘤菌為(0.5-0.8)X (1.1-0.3) μπι的小桿菌。內(nèi)含β -羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個(gè)或成對。對本發(fā)明所分離的菌株的recA序列進(jìn)行測序，將獲得的recA基因序列輸入GenBank，通過Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的recA基因序列與慢生根瘤菌屬的已有模式菌株具有較高的相似性，其中與B.1iaoningense的序列相似性為95.5%，從而確定分離出來的根瘤固氮菌S-S20131G64為慢生根瘤菌屬的新菌株系，并命名為海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobium hai lunense) S-S20131G64。
[0015]本實(shí)施方式具有如下有益效果:1.本實(shí)施方式的根瘤固氮株系S-S20131G64具有高效結(jié)瘤的特性，接種該根瘤菌至少能夠提高大豆生物量20-32%，可用于生產(chǎn)實(shí)踐中；
2.通過接種本實(shí)施方式的根瘤固氮株系S-S20131G64，能夠改善大豆氮素營養(yǎng)，從而達(dá)到大豆高產(chǎn)且培肥土壤的目的；
[0016]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式一株根瘤菌的應(yīng)用是指根瘤菌在長期大豆連作的土壤上的應(yīng)用。
[0017]本實(shí)施方式的根瘤固氮菌株系S-S20131G64適用于黑龍江省長期大豆連作土壤區(qū)，作為大豆常規(guī)栽培的措施之一。
[0018]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式根瘤菌S-S20131G64的分離按以下步驟進(jìn)行:一、從黑龍江海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站長期大豆連作實(shí)驗(yàn)地選取地上部生長旺盛的大豆植株，觀察其根部著生的根瘤，摘取顏色為粉紅色的根瘤置于小采樣瓶中，瓶子底部放入無水硫酸鈉作為干燥劑。二、將采取的根瘤帶回實(shí)驗(yàn)室后，用無菌水清洗三次，使用3%次氯酸鈉消毒5min,并用無菌水洗滌消過毒的根瘤7次，保留最后一次的洗滌水用于YMA平板涂布檢測根瘤消毒徹底與否。三、 用無菌的鑷子，將單個(gè)的消毒洗滌的瘤子轉(zhuǎn)移到無菌的EP管內(nèi)，并用滅菌的槍頭搗碎瘤子，然后，直接用該槍頭在YMA培養(yǎng)基平板上劃線。YMA培養(yǎng)基平板在28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，每日觀察，直至長出單菌落，選擇邊緣整齊，乳白色半透明的單菌落接種到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基上。
[0019]根瘤菌S-S20131G64在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(如圖1所示):菌落為圓形，乳白色半透明，粘質(zhì)較多，邊緣整齊，菌落表面光滑，培養(yǎng)5-7d后菌落直徑達(dá)0.8-2.0mm0挑取菌苔涂片，油鏡下觀察，根瘤菌為(0.5-0.8)X (1.1-0.3) μπι的小桿菌。內(nèi)含β-羥基丁酸，即折射強(qiáng)的似空洞的顆?；蚴咕w呈環(huán)節(jié)狀革蘭氏陰性(G-)，無芽孢，菌體單個(gè)或成對，根瘤菌S-S20131G64革蘭氏染色后在顯微鏡下的圖像如圖2所示。
[0020]YMA固體培養(yǎng)基(即酵母汁甘露醇瓊脂培養(yǎng)基)的組成為:甘露醇10g/l，酵母粉3g/l, K2HPO40.25g/l, KH2PO40.25g/l, MgS04-7H200.2g/l, NaCl0.lg/1, CaC033g/l,瓊脂粉10g/l,其余為蒸懼水，pH調(diào)節(jié)至7.0o
[0021]本實(shí)施方式菌株S-S20131G64 (保藏編號(hào)為CGMCC N0.8693)具有固氮能力強(qiáng)，固氮量大，抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn)。當(dāng)菌體被釋放到自然環(huán)境中時(shí)，對人、動(dòng)物和植物無害，不會(huì)污染環(huán)境，反而能夠增加土壤間根瘤菌的群體，對豆科植物的結(jié)瘤固氮有促進(jìn)作用。
[0022]對本實(shí)施方式的根瘤菌S-S20131G64的recA序列進(jìn)行測序:
[0023]為了鑒定根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，對所分離的菌株的recA序列進(jìn)行測序。首先提取菌株總的DNA，然后采用持家基因recA的引物recA41F/recA640R擴(kuò)增其recA基因，將PCR產(chǎn)物直接測序，將獲得的recA基因序列輸入GenBank，通過Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)施方式海倫慢生根瘤菌的recA基因序列與慢生根瘤菌屬的已有模式菌株具有較高的相似性，其中與B.1iaoningense的序列相似性為95.5%，從而確定分離出來的根瘤固氮菌S-S20131G64為慢生根瘤菌屬的新菌株系，并命名為海倫根瘤菌Bradyrhizobium haiIunense0 recA基因與多重學(xué)列比對的結(jié)果相似，因此采用recA即能定種。根瘤菌S-S20131G64的recA部分序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖如圖3所
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[0024]對本實(shí)施方式的根瘤菌(Bradyrhizobium hai lunense) S-S20131G64進(jìn)行接種試驗(yàn):
[0025]本試驗(yàn)所取土壤為黑龍江省海倫市不同大豆連作年限，包括玉米/大豆輪作、大豆連作I年，連作5年及連作15年的耕作土壤。供試土壤為中厚層黑土。將采集的土壤風(fēng)干過篩后放在高壓滅菌鍋中滅菌。本試驗(yàn)選用我們分離出來的根瘤菌:S-S20131G64，廣譜分布的模式菌株Bradyrhizobium USDA6T,另設(shè)不接種處理作為對照。營養(yǎng)液(營養(yǎng)液配方如下(/L):Ca (NO3)2.4Η200.03g, MgSO4.7Η200.12g, CaCl2.2Η200.10g, KH2PO40.10g,Na2HPO4.12Η200.15g，檸檬酸鐵 0.05g，微量元素 lmL。微量元素的配方(/L) =H2MoO40.02g,MnSO4L 81g，H2B032.86g，CuSO4.5Η200.8g，ZnSO4.7Η200.22g)與土混合時(shí)，土(kg)與營養(yǎng)液(mL)的比例為1:32，將土與營養(yǎng)液充分混合均勻后，裝盆。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4個(gè)重復(fù)。把經(jīng)過消毒、催芽的大豆種子播種于塑料盆土壤中。每盆播種3棵，播種一周后進(jìn)行間苗，每盆只保留一棵長勢健 壯的幼苗。間苗后，把培養(yǎng)好的根瘤菌菌液接種到幼苗的根部，每棵種苗加入菌液l_2mL，保證每棵種苗的接菌量達(dá)到1.0X IO9個(gè)以上。植株生長45d后收獲，取大豆植株地上生物量，觀察大豆的結(jié)瘤情況并測定根瘤的固氮酶活性。
[0026]表1不同連作年限土壤接種根瘤菌后大豆的生物量、結(jié)瘤固氮情況
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一株根瘤菌，其特征在于它為海倫慢生根瘤菌(Bradyrhizobium haiIunense)S-S20131G64，已保藏中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年I月9日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8693。
2.如權(quán)利要求1所述的一株根瘤菌的應(yīng)用，其特征在于根瘤菌在長期大豆連作的土壤上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C05G3/00GK103898009SQ201410083001
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】嚴(yán)君, 韓曉增, 冀照君, 郭愛雪 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所