后覆上埋根； 6) 檢測時期及檢測組織： a) 現(xiàn)蕾期~成熟期:檢測根、莖、葉、花、種子； b) 開花期~成熟期:檢測根、莖、葉、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱頭、花雄 蕊的花藥、花雄蕊的花絲、花瓣； C)結芙期~成熟期:檢測幼嫩種子、成熟種子、芙果皮； 7) 檢測方法： ①取樣：分別于現(xiàn)蕾期、初花期、結芙期采用添加苦參堿菌液誘灌接種方法接菌后的 5(1、15(1、30(1、60(1取樣檢測分析，直至種子收獲;取首猜單株，隨機分離出5-10畑1深±層的毛 根，莖、葉均隨機取自同一植株，且分離為上部莖、下部莖、上部葉和下部葉、花絲、花瓣、胚 珠、花柱、柱頭、花藥、芙果皮和種子;取樣用自來水沖洗干凈后自然驚干； 芭手提紫外燈平板數(shù)量檢測:根、莖、葉各稱取Ig，花5朵/花序、芙果皮5個/花序、種子 5粒/花序，放入50ml無菌Ξ角瓶內，加入有效艦濃度為2500mg/L的艦伏消毒液淹沒，震蕩消 毒4min后無菌水沖洗5次，至Ξ角瓶內無泡沫狀液體出現(xiàn)即可，完全消毒的組織分別置于無 菌研鉢中，加入2ml無菌水充分研磨后離屯、，離屯、轉速為4000rpm/min，離屯、時間為5min，吸 取0.2ml上清液均勻涂布于根研磨液依次稀釋1〇1-10 3的TY固體培養(yǎng)基，Ξ次重復，28°C培養(yǎng) 24-4化后，黑暗中手提紫外燈下記錄每皿內巧光標記根瘤菌數(shù)量，巧光標記根瘤菌在手提 紫外燈下發(fā)青綠色光； ③體式巧光顯微鏡檢測：黑白體式巧光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測 中，含CFP標記根瘤菌的首猜組織為白色，未檢出的組織為黑色。
[0013] 本發(fā)明采用Ξ親本雜交方法獲得攜帶青色巧光(CFP)特性的，具有安全、穩(wěn)定和傳 代性好W及可實時原位監(jiān)測等優(yōu)點的內源巧光標記根瘤菌R.GN5f菌液，添加600mg/L (1.3%)的天然植物源抑菌劑苦參堿混合接種生殖生長期的甘農(nóng)5號紫花首猜(Medicago sativacv.Gannong No . 5)根部；與不添加苦參堿接種方法相比，可提高根、上部莖、花、種 子、芙果皮內該巧光標記根瘤菌數(shù)量。蕾期菌液單獨誘灌，毛根內R.GN5f數(shù)量最高僅為 76.1943 cfu/g，而添加苦參堿后可促進R. GN5f向毛根內運移，數(shù)量高達1.29 X 105cfu/g， 顯著高于菌液單獨接種處理(P<〇. 05);花期5加寸毛根內R. GN5f數(shù)量最高為34.30c化/g，但 后期檢測不到巧光標記根瘤菌;而添加苦參堿后可促進R.GN5f向毛根內運移，60d數(shù)量高達 488cfu/g，顯著高于菌液單獨接種處理13.23倍(p<0.05)，在毛根內的定殖時間長于單獨接 種處理的時間。該時期R.GN5f主要定殖于花器即為種子的形成的通道內。根部單獨接種只 在胚珠內檢測到，數(shù)量為1.30/花序;添加苦參堿后的菌液接種，花器內可定殖的部位和數(shù) 量分別為胚珠1.60cfu/花序，花柱和柱頭1.50 cfu/花序，花藥3. OOcfu/花序，且接種60d 后，芙果皮內其數(shù)量為1.20cfu/g。結芙期種子和結果皮內R.GN5f數(shù)量分別為2.10cfu/粒和 2.00cfu/粒，而單獨接種未檢出。
[0014] 圖1-圖3為紫外燈(336nm)及體式巧光顯微鏡下觀察首猜部分器官內巧光標記根 瘤菌R.GN5f的定殖狀況。
[0015] 由于所使用的苦參堿抑菌劑價格低廉，在大自然中分解后無殘留，且與菌液混合 接種技術簡便，檢測方便，易于實驗者操作。因此本發(fā)明具有很好的實用性和可靠性。
[0016] 最后應說明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 W對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種目標根瘤菌在苜蓿植株體內運移和定殖的促進方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 選擇菌株:選取的熒光標記根瘤菌Rhizobium meliloti.GN5f(R.GN5f)，其原始菌株 Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)為分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿（Medicago sativa cv .Gannong No. 5)根瘤的優(yōu)良根瘤菌株;通過三親本雜交獲得含有青色熒光蛋白（CFP)的內 源熒光標記根瘤菌R.GN5f; 2) 選取植物材料:苜蓿材料為甘農(nóng)5號紫花苜蓿； 3) 制備菌液:將步驟1)的菌株TY平板活化后轉接入50mlTY液體培養(yǎng)基，28°C、180rpm/ min振蕩培養(yǎng)至菌液光密度0D6Q()nm值為0.5-1，4000rpm/min離心5min，拋去上清液后用等體 積的無菌水沖洗菌體，并用渦振蕩器將其打散，最后用無菌水調制成〇D 6QQnmS〇. 5的R. GN5f 熒光標記根瘤菌液； 4) 添加苦參堿:選取的苦參堿濃度為600mg/L，含量為1.3%，無菌操作臺內苦參堿溶液 用0.22μπι無菌濾膜和無菌針管過濾滅菌后，添加至培養(yǎng)好的菌液中，至終濃度600mg/L; 5) 接種:分別隨機選取現(xiàn)蕾期、初花期、結莢期的苜蓿植株5株，根部10cm范圍內挖深約 5cm坑，露出主根、側根、毛根，將制備好的熒光標記根瘤菌液按50ml/株均勻澆灌于根部，爾 后覆土埋根;未添加苦參堿的R. GN5f接種為對照； 6) 檢測時期及檢測組織： a) 現(xiàn)蕾期~成熟期:檢測根、莖、葉、花、種子； b) 開花期~成熟期:檢測根、莖、葉、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱頭、花雄 蕊的花藥、花雄蕊的花絲、花瓣； c) 結莢期~成熟期:檢測幼嫩種子、成熟種子、莢果皮； 7) 檢測方法： ①取樣:分別于現(xiàn)蕾期、初花期、結莢期采用添加苦參堿菌液澆灌的接種方法，接種后 的5(1、15(1、30(1、60(1取樣檢測分析，直至種子收獲，以未添加苦參堿的菌液澆灌為對照;取苜 蓿單株，隨機分離出5-lOcm深土層的毛根，莖、葉均隨機取自同一植株，且分離為上部莖、下 部莖、上部葉和下部葉、花絲、花瓣、胚珠、花柱、柱頭、花藥、莢果皮和種子;取樣用自來水沖 洗干凈后自然晾干； 蒙手提紫外燈平板數(shù)量檢測:根、莖、葉各稱取lg，花5朵/花序、莢果皮5個/花序、種子5 粒/花序，放入50ml無菌三角瓶內，加入有效碘濃度為2500mg/L的碘伏消毒液淹沒，震蕩消 毒4min后無菌水沖洗5次，至三角瓶內無泡沫狀液體出現(xiàn)即可，完全消毒的組織分別置于無 菌研缽中，加入2ml無菌水充分研磨后離心，離心轉速為4000rpm/min，離心時間為5min，吸 取0.2ml上清液均勻涂布于根研磨液依次稀釋lOllO 3的TY固體培養(yǎng)基，三次重復，28°C培養(yǎng) 24-48h后，黑暗中手提紫外燈下記錄每皿內熒光標記根瘤菌數(shù)量，熒光標記根瘤菌在手提 紫外燈下發(fā)青綠色光； ③體式熒光顯微鏡檢測：黑白體式熒光顯微鏡視野下，綠光激發(fā)cfp顯示白色，在檢測 中，含CFP標記根瘤菌的苜蓿組織為白色，未檢出的組織為黑色。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種目標根瘤菌在苜蓿植株體內運移和定殖的促進方法，其 特征在于，TY培養(yǎng)基的制備方法為:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl 2 ·6Η20 1.3g/L，pH至 7 · 0，121°C 滅菌 26min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種目標根瘤菌在苜蓿植株體內運移和定殖的促進方法，是采用三親本雜交方法獲得攜帶青色熒光CFP特性的內源熒光標記根瘤菌<i>R</i>.GN5f菌液，添加的天然植物源抑菌劑苦參堿混合接種生殖生長期的甘農(nóng)5號紫花苜蓿根部。本發(fā)明的有益效果為：1）目標根瘤菌<i>R</i>.GN5f通過三親本雜交獲得，遺傳穩(wěn)定性好，獲得容易，使用方便；2）苦參堿，對空氣源和土壤源微生物抑制，對根瘤菌無抑制作用，促進根瘤菌在苜蓿體內的運移和定殖；且價格低廉，對環(huán)境無毒無害；3）獲得含苦參堿的熒光標記根瘤菌液容易，接種操作簡單，耗時短，適宜生長時期內可隨時接種；4）添加苦參堿后促進了目標根瘤菌的運移和定殖，為獲得攜帶有大量目標根瘤菌種子奠定基礎。
【IPC分類】C12R1/41, G01N21/64, C12N1/20, A01G7/06, A01G1/00
【公開號】CN105453923
【申請?zhí)枴緾N201510892098
【發(fā)明人】師尚禮, 苗陽陽
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月8日