一株中華根瘤菌SCAUs65及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株中華根瘤菌SCAUs65及其應用，該菌株是從新鮮的大豆根瘤中分離純化得到的。該菌株已于2014年3月14日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO:M2014084，分類命名為費氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）。該菌株應用于四川大豆的生產(chǎn)。本發(fā)明的中華根瘤菌SCAUs65是一株共生固氮能力強，對四川大豆品種適應范圍廣，兼具有溶無機磷、有機磷和溶鉀能力、抗逆性較強的優(yōu)良廣譜大豆根瘤菌菌株。并且與四川的主栽豆品種匹配親和性好，在不同生態(tài)區(qū)不施氮肥、接種SCAUs65使大豆增產(chǎn)38.9%以上，與不接種對照的差異達極顯著水平。CCTCC NO: M 20140842014.03.14
【專利說明】-株中華根瘤菌SCAUs65及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域，尤其涉及的是一株中華根瘤菌SCAUs65及其應用。

【背景技術】
[0002] 化學氮肥為提高農(nóng)作物產(chǎn)量作出了巨大貢獻，但生產(chǎn)成本高、利用率低、污染生態(tài) 環(huán)境。生物固氮則成本低、固氮量大、固氮過程持續(xù)、無污染，有利于生態(tài)環(huán)境的保護和農(nóng)業(yè) 的可持續(xù)發(fā)展，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)本增效的有效手段。在糧食生產(chǎn)中需要下大力氣開發(fā)對環(huán)境 有益的生物固氮技術。根瘤菌-豆科植物固氮體系是生物固氮中效率最高的。豆科植物人 工接種根瘤菌是提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，改善生態(tài)環(huán)境的一項重要農(nóng)業(yè)措施。接種根瘤菌是 國際上公認的生物固氮技術。大豆與大豆根瘤菌的共生體系是生物固氮中的典型代表。大 豆與大豆根瘤菌之間的共生作用，是在長期進化中相互作用、互相選擇的結果，也是與環(huán)境 相適應的結果。世界其他種植大豆的國家在應用大豆根瘤菌的技術上有很大的優(yōu)勢。然而， 我國是大豆的起源地，種植大豆的歷史悠久，根瘤菌與大豆協(xié)同進化，使土壤中固氮效率低 的土著根瘤菌與大豆品種具有較強的匹配親和性，從而大大降低了高效固氮根瘤菌接種劑 的作用效果。因此研究根瘤菌和大豆品種匹配性具有重要的實踐價值。
[0003] 要提高共生固氮作用，可見菌株和大豆品種應是兩個根本因素。而根瘤菌的群體 分布具有地理局限性，在根瘤菌的篩選中，需要注意其對應用地區(qū)環(huán)境的適應能力。一般來 說，在某個區(qū)域內(nèi)最為有效的根瘤菌往往來自本地區(qū)或者與本地區(qū)條件相似地區(qū)的菌株。 因此在根瘤菌選種時，不僅要開展根瘤菌與大豆品種的匹配性組合研究，還必須重視菌劑 應用的地域性。
[0004] 大豆是中國第四大農(nóng)作物，深受中國人民的喜愛，食用方式多種多樣，用途廣泛， 是我國重要的糧食作物和油料作物。因此在我國開展優(yōu)良大豆根瘤菌株篩選和應用技術研 究工作非常有意義。東北大豆產(chǎn)區(qū)為我國最大大豆產(chǎn)區(qū)，黃淮海地區(qū)是我國大豆第二大產(chǎn) 區(qū)，與這最大的兩大產(chǎn)區(qū)的主栽大豆品種和生態(tài)環(huán)境匹配的優(yōu)良菌株的研究相對較多。針 對干旱的西北大豆產(chǎn)區(qū)，優(yōu)良大豆根瘤菌的篩選也有報道。針對我國大豆的第一產(chǎn)區(qū)：東北 產(chǎn)區(qū)，杜迎輝等人從黑龍江分離獲得一株與東北大豆品種匹配性好且適合東北地區(qū)的優(yōu)良 菌株，于2012年6月獲準發(fā)明專利。針對我國華南酸性土壤，曹桂芹等人為華南缺磷酸性 紅壤選育了耐酸、耐鋁的3個根瘤菌株系，于2007年12月申請了 3個發(fā)明專利。但針對南 方大豆產(chǎn)區(qū)的四川大豆產(chǎn)區(qū)的大豆品種和生態(tài)環(huán)境相匹配的優(yōu)良根瘤菌研究鮮見報道。
[0005] 四川大豆以前一直屬小宗作物，種植零散，產(chǎn)量較低，種植面積較小。近年來，四 川大豆生產(chǎn)發(fā)展迅猛，出現(xiàn)規(guī)?；⒋竺娣e連片種植，產(chǎn)量水平大幅度提高，已經(jīng)成為四川 省主要糧食作物之一，播種面積在全國排名第6位。農(nóng)業(yè)部在《種植業(yè)發(fā)展第十二五規(guī)劃》 (2011- 2015 )中將四川及西南間套食用大豆列入全國三大優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一，國家發(fā)改委又將 川渝大豆納入國家十二五主要糧食作物，四川大豆引起了國家及四川省各級政府的重視。 四川大豆栽培方式主要是與玉米間、套作種植，占全省大豆種植面積的90%以上。因此，在 四川大豆生產(chǎn)中接種匹配的優(yōu)良根瘤菌，四川大豆的間套作體系對根瘤菌固氮酶活性的 "氨阻遏"還能起緩解作用。四川套作大豆主導品種是"南豆12"和"貢選1號"。又四川間 套作的大豆主要種植在四川丘陵區(qū)，光熱資源豐富的攀西地區(qū)主要以春大豆或鮮食大豆為 主。目前還沒有篩選出與四川主栽大豆品種匹配，適合四川不同生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良大豆根瘤 菌。為此，針對四川的主栽品種和種植大豆的主要生態(tài)環(huán)境進行大豆優(yōu)良菌株的篩選，充分 發(fā)揮生物固氮作用，提高生物固氮在生產(chǎn)實踐中的應用效果，從而減少化肥的施用，這對于 保護生態(tài)環(huán)境，節(jié)約能源資源，推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實踐價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一株中華根瘤菌 SCAUs65及其應用。
[0007] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0008] -株中華根瘤菌SCAUs65,其分類命名為費氏中華根瘤菌SCAUs65Sinorhizobium fredii SCAUs65,已于2014年3月14日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏 編號為 CCTCC N0:M2014084。
[0009] 所述的中華根瘤菌SCAUS65應用于四川大豆的生產(chǎn)。
[0010] 本發(fā)明的中華根瘤菌SCAUs65是一株共生固氮能力強，對四川大豆品種適應范圍 廣，兼具有溶無機磷、有機磷和溶鉀能力、抗逆性較強的優(yōu)良廣譜大豆根瘤菌菌株。并且與 四川主栽大豆品種匹配親和性好，在不同生態(tài)區(qū)不施氮肥、接種SCAUs65使大豆增產(chǎn)38. 9% 以上，與不接種對照的差異達極顯著水平。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為中華根瘤菌SCAUS65在YMA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
[0012] 圖2為中華根瘤菌SCAUs65的16rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育圖。
[0013] 圖3為中華根瘤菌SCAUs65的glnII、atpD、reCA三個持家基因聯(lián)合構建的系統(tǒng)發(fā) 育圖。

【具體實施方式】
[0014] 以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0015] 實施例1中華根瘤菌SCAUs65的分離、純化和保存
[0016] 從四川省德陽市旌陽區(qū)丘陵地區(qū)紫色土上種植的大豆中，選擇健壯植株主根上大 且飽滿紅色的根瘤，將根瘤擦洗干凈，帶部分根皮采下，用紙吸干并將其放在裝有無水氯化 鈣并覆有脫脂棉的小管中。在實驗室將采集的根瘤用無菌水浸泡吸脹后，用95%的乙醇浸 泡30s以消除表面張力，接著用0. 1% (m/v)的升萊表面消毒5min，再用無菌水沖洗6次， 在無菌操作的情況下，將單個根瘤夾破后在加有剛果紅的YAM培養(yǎng)基(甘露醇10g，酵母粉 0· 8g，KH2PO4O. 25g，MgSO4. 7Η200· 2g，CaCl2. 6Η200· lg，NaClO. lg，1% (m/v)鑰酸鈉 2ml，1% (m/v)硼酸 2ml，1% (m/v)剛果紅 2. 5ml，pH6. 8-7. 0,瓊脂 18 ?20g，水 1000ml)上劃線，在 28 °C的恒溫箱中培養(yǎng)。
[0017] 待長出菌落后，從平板上挑選不吸紅、形態(tài)上像根瘤菌的菌落在平板上稀釋劃線 培養(yǎng)。3d左右觀察菌落形態(tài)，一直觀察到15d左右，因慢生根瘤菌需6?15d出現(xiàn)菌落。重 復稀釋劃線反復分離，直到純化為止。根據(jù)以下兩方面進行初步判定是否為根瘤菌：（1)加 剛果紅的YM培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：不吸紅，菌落圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表 面光滑、較粘稠、較濕潤。培養(yǎng)3?5d就長出菌落的為快生根瘤菌，培養(yǎng)6?IOd長出菌落 的為慢生根瘤菌。（2)細胞形態(tài)：對確認的根瘤菌菌落作標記，制片進行革蘭氏染色，根瘤 菌的鏡檢結果為細胞呈小桿狀且形態(tài)一致，無芽孢，細胞內(nèi)常含β-羥基丁酸而呈環(huán)節(jié)狀， 革蘭氏陰性（G-)。如果上述標記菌落具有上述兩方面特征，則將該菌落接入YMA培養(yǎng)基的 試管斜面培養(yǎng)保存。
[0018] 本實施例的分離純化得到的中華根瘤菌SCAUs65為快生根瘤菌，在加剛果紅的 YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌體不吸紅，菌落較大、圓形、乳白色、隆起度較高、濕潤、稍透明，4d左 右長出菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為G-，呈小桿狀。
[0019] 實施例2中華根瘤菌SCAUs65的回接及匹配性試驗
[0020] 中華根瘤菌SCAUs65的回接試驗用水培法，試驗中用的大豆品種是四川的主導品 種"南豆12"，在光照室(控溫22?24°C，光照強度2700?3000勒克斯，日照時間14h)進 行，種植46d收獲。與"南豆12"回接成功后再與其他的主栽大豆品種進行匹配性試驗，也 用水培法進行，試驗中用的大豆品種：間套作的另一主栽大豆品種"貢選1號"、春大豆主栽 品種"南豆8號"、主栽的鮮食大豆品種"春豐早"。在上述光照室培養(yǎng)1周后，放置在正常 光照及溫度條件下培養(yǎng)，種植41d收獲。定期補充無菌微氮營養(yǎng)液。將中華根瘤菌SCAUs65 與上述大豆品種形成不同組合，水培器采用250ml的細頸瓶(醫(yī)院用的玻璃輸液瓶)，以不接 種中華根瘤菌SCAUs65的同品種大豆植株為對照。收獲后用大豆植株的根瘤數(shù)及植株干重 來評價中華根瘤菌SCAUs65的接種效果。回接試驗與匹配性試驗的菌液培養(yǎng)、種子的催芽、 水培器的制作及種植方法是一致的。
[0021] (1)菌液培養(yǎng)：將上述中華根瘤菌SCAUS65接種于YMA液體培養(yǎng)基中，放置搖床上 用120rpm/min轉(zhuǎn)速，28°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約4d左右）。
[0022] (2)種子的催芽：選擇粒大、飽滿的無損傷的大豆種子，用95%酒精浸5min，倒去酒 精，加入0. 1% (m/v)的升萊溶液表面消毒5min。最后用無菌水清洗4?6次，每次5min。 28°C催芽，待主根長到2?3cm左右，須根未長出時播種。
[0023] (3)水培器的制作：用250ml的細頸瓶（醫(yī)院用的玻璃輸液瓶）作水培器。先制作 無菌微氮營養(yǎng)液，微氮營養(yǎng)液配方：〇. 46g硫酸興，0. 075g氯化鉀，0. 06g硫酸鎂，0. 03g硝 酸鈣，0. 075g檸檬酸鐵，0. 136g磷酸氫二鉀，IOOOml蒸餾水，Iml微量元素（2. 86g硼酸， 0. 02g鑰酸，0. 8g硫酸銅，0. 22gZnS04硫酸鋅，I. 81g硫酸錳，加蒸餾水至IOOOml )。將配制 好的微氮營養(yǎng)液注入清洗后的瓶內(nèi)，瓶口覆蓋一層牛皮紙，在瓶口正中央開一小孔(直徑約 0. 6cm)，小孔塞上棉花，外罩一層耐高溫的塑料薄膜，在121°C溫度下滅菌備用。
[0024] (4)種植及測定指標：將催芽種子置于無菌培養(yǎng)皿中用菌液浸泡15min，用無菌鑷 子將種苗的根插入水培器小孔內(nèi)，每瓶1株，然后每棵種苗再加入菌液lml，種子周圍用原 來孔內(nèi)的棉花塞好，防止塵埃落入瓶內(nèi)，造成污染。另設不接種處理的同品種植株為對照 (CK)。種植時先種CK。各處理重復3次。水培試驗結果列于表1。
[0025] 表1結果表明，所述中華根瘤菌SCAUs65與4個供試大豆品種的匹配親和性均好， 均表現(xiàn)出較好的結瘤能力和共生固氮能力；與不接種根瘤菌的對照相比，SCAUs65能顯著 提高每個品種大豆的植株干重，比不接中華根瘤菌SCAUs65的對照提高24%?55%?？梢?， 所述中華根瘤菌SCAUs65是與四川大豆品種匹配性好的優(yōu)良廣譜菌株。
[0026] 表1中華根瘤菌SCAUs65的水培試驗結果

【權利要求】
1. 一株中華根瘤菌SCAUS65,其特征在于，其保藏編號為CCTCC N0:M2014084。
2. 根據(jù)權利要求1所述的中華根瘤菌SCAUs65的應用，其特征是，應用于四川大豆的生 產(chǎn)。
【文檔編號】C12R1/41GK104277994SQ201410150296
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權日:2014年4月16日
【發(fā)明者】徐開未, 陳遠學, 鄒蘭, 王科, 張勇, 陳曉輝, 劉靜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學