專利名稱：一種編碼維生素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型維生素B6磷酸磷酸酶(VB6P磷酸酶)基因，采用攜帶該基因的載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化獲得的重組微生物，以及具有VB6P磷酸酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及一種采用重組微生物或多肽從VB6P中制備維生素B6的方法。
本發(fā)明中采用的“維生素B6”包括吡哆醇(pyridoxol)(在下文中稱作PN)、吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是一種人和動(dòng)物的必需維生素，它可作為藥物的原料和飼料添加劑來(lái)使用。
本發(fā)明提供了一種采用從苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中克隆得到的新的VB6P磷酸酶基因(稱作pdxP)轉(zhuǎn)化獲得的重組微生物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種從VB6P中制備維生素B6的方法，其通過(guò)采用微生物的無(wú)細(xì)胞(cell-free)提取物(下文中稱作CFE)，并將VB6P與(i)CFE、或(ii)在存在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+，或Ni2+的條件下從上述CFE中進(jìn)一步純化獲得的酶制劑相接觸，并從反應(yīng)混合物中分離獲得的維生素B6。
本發(fā)明提供一種能編碼VB6P磷酸酶的分離的脫氧核糖核酸(DNA)，以及一種能通過(guò)導(dǎo)入攜帶該分離的DNA的載體從而從VB6P中生產(chǎn)維生素B6的重組微生物。
本文中所述的VB6P磷酸酶基因(pdxP)是指一種編碼VB6P磷酸酶的基因，所述的磷酸酶能催化VB6P脫磷酸化成為維生素B6，并對(duì)吡哆醇磷酸鹽(phosphate)和吡哆醛磷酸鹽具高度底物特異性。
當(dāng)術(shù)語(yǔ)“分離的”應(yīng)用于DNA時(shí)，是指DNA被從天然的遺傳環(huán)境中分離，從而其不含其他的無(wú)關(guān)的或不需要的編碼序列，并且其呈適合在遺傳工程蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。術(shù)語(yǔ)“一種分離的DNA”也可選的被稱作“一種克隆的DNA”。
本文中所采用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指一種線性或環(huán)狀的DNA分子，它通常來(lái)源于質(zhì)?；虿《綝NA，或該兩者的元件兼而有之。所述的載體可以是一種獨(dú)立于染色體復(fù)制的形式，或者也可以是一種當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合至宿主細(xì)胞基因組并與所整合的染色體一起復(fù)制的形式。
術(shù)語(yǔ)“重組微生物”是指采用包含了感興趣的分離DNA的載體轉(zhuǎn)化的任何微生物。本發(fā)明的重組微生物表達(dá)編碼用于從VB6P中制備維生素B6的VB6P磷酸酶的基因。
VB6P磷酸酶基因的克隆采用適當(dāng)?shù)牡鞍酌溉缫鹊鞍酌竵?lái)消化苜蓿根瘤菌的VB6P磷酸酶純化蛋白，并采用高壓液相色譜(HPLC)來(lái)分級(jí)收集獲得的肽段。采用蛋白質(zhì)測(cè)序儀來(lái)確定肽的氨基酸序列，并且根據(jù)氨基酸序列來(lái)合成簡(jiǎn)并引物。通過(guò)簡(jiǎn)并引物PCR來(lái)合成VB6P磷酸酶基因的部分片段。通過(guò)采用合成的部分片段作為探針來(lái)篩選基因組文庫(kù)從而獲得全長(zhǎng)VB6P磷酸酶基因。
合適的DNA片段的一個(gè)例子是來(lái)源于苜蓿根瘤菌的，如SEQ ID NO9所示的核酸序列。
在苜蓿根瘤菌的情況中，完整的基因組序列已公布(EMBL登記號(hào)為NO.AL591688)，并且BLAST檢索結(jié)果表明SEQ ID NO9所示的苜蓿根瘤菌S.meliloti的pdxP的DNA序列與登記號(hào)為No.AL591688中的472329-473036區(qū)域——開放閱讀框SMc0l730互補(bǔ)對(duì)應(yīng)，除了一個(gè)核苷酸的取代之外，即位置163上的核苷酸；但是開放閱讀框SMc0l730中所示的多肽功能以前并未被確定。
可從任何生物體中分離苜蓿根瘤菌的pdxP的功能等價(jià)物，例如，但不僅限于百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)，其他細(xì)菌，酵母和植物。
本發(fā)明提供了如SEQ ID NO9所示的編碼VB6P磷酸酶的DNA序列，和在標(biāo)準(zhǔn)條件下與SEQ ID NO9所示的序列雜交的DNA序列或其片段。
本文所述的術(shù)語(yǔ)“在標(biāo)準(zhǔn)條件下雜交的DNA序列”是指通過(guò)利用菌落雜交、噬菌斑雜交或Southern雜交獲得的DNA，其中SEQ ID NO9所示的任何DNA序列均可作為探針使用。
雜交的“標(biāo)準(zhǔn)條件”在本文的上下文中是指本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)采用的用于檢測(cè)特異性雜交信號(hào)的條件，或優(yōu)選被稱作嚴(yán)謹(jǐn)雜交和非嚴(yán)謹(jǐn)漂洗的條件，或更優(yōu)選被稱作中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，或者更進(jìn)一步優(yōu)選被稱作嚴(yán)謹(jǐn)雜交和嚴(yán)謹(jǐn)漂洗的條件，上述條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。因此一個(gè)具體的實(shí)例為通過(guò)將DNA采用地高辛(在下文中稱作DIG)DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Roche Diagnostics，東京，日本)，按照制造商提供的說(shuō)明書進(jìn)行雜交的方式來(lái)檢測(cè)DNA。所述的雜交溶液含有50％甲酰胺，5×SSC(10×SSC由87.65g的NaCl和44.1g的檸檬酸鈉配制成1升體積來(lái)構(gòu)成)，2％封閉試劑(RocheDiagnostics，東京，日本)，0.1％N-十二烷基肌氨酸鈉(lauroylsarcosine)，和0.3％十二烷基硫酸鈉(在下文中稱作SDS)?？稍?2℃下過(guò)夜進(jìn)行雜交，并在室溫下采用含有0.1％SDS的2×SSC漂洗兩次，每次5分鐘；并在50℃到68℃下采用含有0.1％SDS的0.1×SSC漂洗兩次，每次15分鐘?？筛鶕?jù)制造商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明還包括與SEQ ID NO9所示的DNA序列具有至少70％的同源性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選超過(guò)90％的同源性的DNA序列或其片段。
宿主細(xì)胞和載體從VB6P中通過(guò)表達(dá)VB6P磷酸酶來(lái)重組生產(chǎn)維生素B6的合適的宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞，其選擇僅受到其表達(dá)活性酶能力的限制。在一種具體實(shí)施例方式中，本發(fā)明采用了重組大腸桿菌(Escherichia coli)。作為宿主菌株，屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的任何菌株均可采用，并且屬于埃希氏菌屬的微生物可從天然來(lái)源中分離，或者從培養(yǎng)中心購(gòu)買。優(yōu)選的，E.coli JM109(Takara，Shiga，日本)可被用于本發(fā)明。可在E.Coli中存在并用于表達(dá)E.Coli中的重組DNA的合適的載體包括，但不僅限于，pUC系列的質(zhì)粒，pBR322和其衍生物如pKK223-3。
在另一具體實(shí)施例方式中，本發(fā)明采用了重組苜蓿根瘤菌(S.meliloti)。作為宿主菌株，屬于根瘤菌屬(Sinorhizobium)的任何菌株均可采用，并且屬于根瘤菌屬的的微生物可從天然來(lái)源中分離，或從培養(yǎng)中心購(gòu)買。優(yōu)選的，苜蓿根瘤菌(S.meliloti)IFO 14782(DSM 10226)可被用于本發(fā)明。作為在苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中表達(dá)重組DNA的載體，宿主范圍廣泛的載體，如pVK100，pRK290，pLAFR1或RSF1010均可采用。通過(guò)插入編碼在苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中具有功能的啟動(dòng)子，如ptac，plac，ptrc，pS1(苜蓿根瘤菌小核糖體亞單位啟動(dòng)子)，或pNm(新霉素抗性基因啟動(dòng)子)的DNA片段。
通過(guò)按如下方式進(jìn)行的三親雜交方法可將用于整合pdxP的重組質(zhì)粒導(dǎo)入苜蓿根瘤菌IFO 14782中。分別培養(yǎng)作為受體菌株的苜蓿根瘤菌，作為輔助菌株的攜帶輔助質(zhì)粒的大腸桿菌，和作為供體菌株的攜帶供體質(zhì)粒的大腸桿菌并進(jìn)行混合。在平板上混合培養(yǎng)后，可在含有適當(dāng)抗生素的瓊脂平板上篩選接受了重組質(zhì)粒的苜蓿根瘤菌?？赏ㄟ^(guò)從平板上生長(zhǎng)的克隆中制備質(zhì)粒并經(jīng)核酸內(nèi)切酶消化檢測(cè)來(lái)篩選攜帶質(zhì)粒的重組菌株。
根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施構(gòu)建重組載體的方法。本發(fā)明中，將pdxP置于ptac啟動(dòng)子調(diào)控下的pkk 223-3中以構(gòu)建E.Coli中作為表載體的pKKpdxp。在另一實(shí)施方案中，將pdxP置于受ptac啟動(dòng)子調(diào)控的pVK100中以構(gòu)建S.meliloti中作為表達(dá)載體的pVKptacpdxP。
多肽本發(fā)明還提供了具有VB6P磷酸酶活性的多肽和所述多肽的功能性衍生物。這類功能性衍生物被定義為在本發(fā)明的氨基酸序列的基礎(chǔ)上通過(guò)添加、缺失和/或取代該序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，其中所述的衍生物仍具有VB6P磷酸酶活性。這種功能性衍生物既可通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)肽合成方法，又可通過(guò)在如本文所公開的DNA序列的基礎(chǔ)上采用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行的重組途徑來(lái)制備。本領(lǐng)域已知那些在蛋白和肽中通常不改變所述分子活性的氨基酸替換。最常見的替換為Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Ala/Glu，Asp/Gly及其反向替換。
此外，本發(fā)明的多肽還包括如SEQ ID NO10所示的多肽，特別是那些具有VB6P磷酸酶生物活性的，以及那些與SEQ ID NO10所示多肽具有至少70％同源性，優(yōu)選至少80％，特別優(yōu)選超過(guò)90％同源性的并且具有所述活性的多肽。
從VB6P中制備維生素B6本發(fā)明中獲得的重組微生物可在含有可同化碳源、可消化氮源、無(wú)機(jī)鹽、和生長(zhǎng)所需的其他營(yíng)養(yǎng)元素。作為碳源，例如，葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、糊精、或甘油均可采用。作為氮源，例如，蛋白胨、玉米浸泡液、大豆粉、酵母提取物、肉浸液、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿素、或其混合物均可采用。此外，對(duì)于微量元素，鈣、鎂、鋅、錳、鈷、和鐵的硫酸鹽、水合氯化物、或磷酸鹽均可采用。并且，如果需要，傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)因子，作為捕獲劑的磷酸鐵、或止泡劑，如碳酸鎂、氧化鋁、水鋁英石、動(dòng)物油、植物油、或礦物油也可補(bǔ)充添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基pH的為約5.0至約9.0。培養(yǎng)溫度為約5℃至約45℃的范圍。培養(yǎng)時(shí)間為約1天至約15天。在培養(yǎng)過(guò)程中，通風(fēng)和攪拌常常能獲得良好的效果。
具有VB6P磷酸酶活性的蛋白可以按照上述方法制備得到的培養(yǎng)物本身、培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞提取物(CFE)、從CFE中分離的蛋白、或固定酶的形式來(lái)使用，用于從VB6P中制備維生素B6。整合至質(zhì)粒的pdxP在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達(dá)可通過(guò)從重組微生物的培養(yǎng)物中制備CFE和將其進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來(lái)進(jìn)行分析。從VB6P中制備維生素B6的酶生產(chǎn)可通過(guò)將酶活性蛋白與水性培養(yǎng)基中的VB6P相接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述的水性培養(yǎng)基可以是水性溶液，如果需要的話可以為緩沖液。將VB6P溶于水并加入至水性培養(yǎng)基中。從VB6P中制備維生素B6的生產(chǎn)可在pH介于5.5-9.0范圍內(nèi)的水性培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選7.0-8.0，其溫度范圍為15℃至45℃，優(yōu)選30℃至40℃，并在存在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+的條件下培養(yǎng)15分鐘至5小時(shí)。
在從VB6P中制備維生素B6后，可從反應(yīng)混合物中分離和純化生產(chǎn)的維生素B6。為了這個(gè)目的，可利用維生素B6的各種特性，采用常規(guī)用于從反應(yīng)混合物中提取特定產(chǎn)物的方式來(lái)進(jìn)行。例如，通過(guò)加熱或加入變性劑如甲醇或乙醇來(lái)使蛋白質(zhì)變性，并通過(guò)過(guò)濾從反應(yīng)混合物中分離。濾液中的目的物質(zhì)將被吸收至活性碳上，并隨后經(jīng)離子交換樹脂進(jìn)一步洗脫和純化。可選的，可將濾液直接加樣至離子交換樹脂上，并且在洗脫后，目的產(chǎn)物可從乙醇和水的混合物中重結(jié)晶析出?？赏ㄟ^(guò)HPLC對(duì)反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的維生素B6的量進(jìn)行定量分析。
通過(guò)參考下述實(shí)施例，將有助于本發(fā)明更詳細(xì)的說(shuō)明。
常規(guī)方法苜蓿根瘤菌IFO 14782可用作基因克隆實(shí)驗(yàn)中的染色DNA來(lái)源，和作為通過(guò)轉(zhuǎn)化結(jié)合從VB6P中制備維生素B6的宿主菌株。大腸桿菌K-12的衍生物也可作為分子克隆實(shí)驗(yàn)和從VB6P中制備維生素B6的宿主菌株。大腸桿菌菌株在LB培養(yǎng)基(在下文中稱作LB)中培養(yǎng)，所述的LB培養(yǎng)基含有1％的細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)，和0.5％NaCl；同時(shí)，苜蓿根瘤菌在添加有0.061％的MgSO4·7H2O和0.036％的CaCl2·2H2O的LB培養(yǎng)基(在下文中稱作LBMC)中培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中添加細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(1.5％)用于制備瓊脂平板。采用QIAGENMidi(QIAGEN GmbH，德國(guó))試劑盒或采用自動(dòng)DNA分離系統(tǒng)PI-50(KuraboIndustry Ltd.，日本)從大腸桿菌或苜蓿根瘤菌中分離質(zhì)粒DNA。
采用QIAGEN genomic-tips分離染色體DNA。
按照制造商的說(shuō)明來(lái)使用限制性酶、堿性磷酸酶、連接酶、大腸桿菌JM109和HB101感受態(tài)細(xì)胞(Takara Bio.Inc，Shiga，日本)，TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Japan K.K.，日本)。質(zhì)粒pKK223-3購(gòu)于AmershamBiosciences Corp.公司。為了進(jìn)行限制性酶切分析，在瓊脂糖凝膠中使DNA片段相互分開，并采用商業(yè)化的QIAEXII(QIAGEN GmbH)系統(tǒng)通過(guò)提取的方式從凝膠中分離得到。采用ALF DNA測(cè)序儀(Amersham Biosciences)來(lái)確定DNA序列。
實(shí)施例1VB6P磷酸酶基因的克隆(1)苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色體DNA的制備將苜蓿根瘤菌IFO 14782在LBMC上，在30℃下培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并采用QIAGEN genomic-tips分離染色體DNA。
(2)VB6P磷酸酶基因部分片段的獲得為了設(shè)計(jì)用于通過(guò)采用簡(jiǎn)并PCR方法克隆VB6P磷酸酶基因的PCR引物，采用蛋白質(zhì)測(cè)序儀來(lái)確定肽的N-末端和內(nèi)部的氨基酸序列，得到了肽Fr60(SEQ ID NO1)，F(xiàn)r64(SEQ ID NO2)，F(xiàn)r70(SEQ ID NO3)和N-末端(SEQ ID NO4)。
通過(guò)簡(jiǎn)并PCR方法獲得了編碼苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶的DNA。采用了相應(yīng)于苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO4)的CN02(SEQ ID NO5)作為正向引物。采用了相應(yīng)于苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶內(nèi)部氨基酸序列(SEQ ID NO2)的C642(SEQ ID NO6)作為反向引物。
根據(jù)Takara Shuzo的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。取苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色體DNA(0.1μg)作為模板，ExTaq聚合酶作為PCR聚合酶。PCR反應(yīng)條件如下94℃5分鐘，94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒共30個(gè)循環(huán)，72℃7分鐘。反應(yīng)后，取部分樣品在1.5％(w/v)的凝膠上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用QIAEXII純化一0.5-kb大小的產(chǎn)物，并將其克隆至pCR2.1TOPO。取3個(gè)不同獨(dú)立的具有預(yù)期插入片段的克隆子來(lái)進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果證實(shí)3個(gè)克隆子的插入片段的DNA序列幾乎完全相同，并且從DNA序列推測(cè)得到的氨基酸序列包含SEQ ID NO1，2，3和4的全部氨基酸序列。將克隆子之一，phoC28用作下一步的研究。隨后，根據(jù)phoC28的插入片段的DNA序列合成PCR引物C101(正義引物)(SEQ ID NO7)和C102(反義引物)(SEQ ID NO8)，并通過(guò)PCR引物獲得VB6P磷酸酶基因的部分片段。PCR反應(yīng)條件如下94℃5分鐘，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒共30個(gè)循環(huán)，72℃7分鐘。分別采用苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色體DNA(0.1μg)和ExTaq聚合酶作為模板和PCR聚合酶。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的一預(yù)期約0.5-kb的產(chǎn)物被克隆至pCR2.1TOPO。作為DNA序列分析的結(jié)果，證實(shí)了獲得了許多與phoC28序列完全一致的克隆子。將克隆子之一，攜帶苜蓿根瘤菌IFO 14782的VB6P磷酸酶基因部分片段的pC1用作下一步的實(shí)驗(yàn)。
(3)苜蓿根瘤菌染色體消化物的Southem雜交分析采用DIG DNA標(biāo)記試劑盒，利用DIG-11-dUTP標(biāo)記pC1的0.5-kb EcoRl片段，并將其作為Southern雜交分析的探針來(lái)確定適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，從而用于?gòu)建基因組文庫(kù)。按照如下方法來(lái)進(jìn)行Southern雜交分析。采用限制性酶來(lái)消化染色體DNA(3.4μg)，并取反應(yīng)物在0.8％(w/v)的凝膠上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。采用真空印跡裝置(Model 785 Bio-Rad)將DNA轉(zhuǎn)移至浸于10×SSC中的尼龍膜上。該膜在雜交緩沖液中(50％甲酰胺，5×SSC，2％的封閉試劑，0.1％N-十二烷基肌氨鈉，和0.3％SDS)先預(yù)雜交6小時(shí)，并隨后在加入變性探針的緩沖液中42℃下過(guò)夜預(yù)雜交。在室溫下采用含0.1％SDS的2×SSC漂洗印跡兩次，每次5分鐘；并在68℃下采用含0.1％SDS的0.1×SSC漂洗印跡兩次，每次15分鐘。采用DIG檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)與探針雜交的DNA片段。結(jié)果是，在苜蓿根瘤菌染色體消化Southern雜交分析中，所述探針與2.3-kbSal I，3.5-kb EcoR I和7.0-kb Kpn I DNA片段雜交。
(4)苜蓿根瘤菌IFO 14782基因組文庫(kù)的構(gòu)建將EcoRI部分消化的染色體DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。從凝膠中回收15-至30-kb DNA片段，并將其與經(jīng)EcoRI消化和經(jīng)細(xì)菌堿性磷酸酶去磷酸化的pVK100連接。將連接產(chǎn)物用于體外包裝反應(yīng)，并將噬菌體顆粒用于感染處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的大腸桿菌8767細(xì)胞。將細(xì)胞懸液涂布于含10μg/ml四環(huán)素(在下文中稱作Tc)的LB平板上。獲得抗Tc的克隆子并將其保存作為苜蓿根瘤菌IFO 14782的基因組文庫(kù)。
(5)篩選苜蓿根瘤菌IFO 14782的基因組文庫(kù)為了從如實(shí)施例1-(4)所制備的文庫(kù)中篩選具有苜蓿根瘤菌VB6P磷酸酶基因的克隆子，將生長(zhǎng)于10μg/ml Tc的LB平板上的克隆子轉(zhuǎn)移至尼龍轉(zhuǎn)移膜上(HybondTM-N+-Amersham Pharmacia Biotech)，并采用如實(shí)施例1-(3)所制備的探針進(jìn)行菌落雜交。在苜蓿根瘤菌IFO 14782基因組文庫(kù)的3000個(gè)克隆子中篩選獲得了7個(gè)陽(yáng)性克隆子。采用Q1AGEN-midi tip從陽(yáng)性克隆子中制備得到質(zhì)粒，并分別經(jīng)限制性酶EcoR I和SalI消化。將消化后的質(zhì)粒在1.0％(w/v)的凝膠上進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并按照如實(shí)施例1-(3)所述的方法進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果證實(shí)探針與消化的質(zhì)粒的2.3-kb SalI片段和3.5-kb EcoR I片段雜交。將陽(yáng)性克隆子的攜帶有約24-kb EcoR I片段的質(zhì)粒之一命名為pVEC1。
(6)VB6P磷酸酶基因測(cè)序?qū)VEC1的2.3-kb Sal I和3.5-kb EcoR I片段連接至pUC19，并分別將獲得的質(zhì)粒命名為pUCEC1和pUCEC19。pUCEC1和pUCEC19插入片段的核酸序列采用ALF DNA測(cè)序儀來(lái)確定。DNA測(cè)序結(jié)果表明，可觀察到一編碼包含SEQ ID NO1，2，3和4全部氨基酸序列的、由235個(gè)氨基酸組成的ORF的708-bp的序列。該結(jié)果表明，如SEQ ID NO9所示的708-bp序列相應(yīng)于VB6P磷酸酶基因，并將該基因命名為pdxP。pdxP附近的染色體DNA限制性酶切圖譜如

圖1所示。
實(shí)施例2pdxP的表達(dá)和從VB6P中生產(chǎn)維生素B6(1)大腸桿菌中pdxP的表達(dá)為了在大腸桿菌中表達(dá)在tac啟動(dòng)子下調(diào)控的pdxP基因，構(gòu)建了pKKpdxP質(zhì)粒。利用advantage-HF PCR試劑盒(Clontech，USA)，采用10-pmol的引物，引物P101(SEQ ID NO11)和引物P102(SEQ ID NO12)，從100ng的苜蓿根瘤菌IFO 14782的染色體DNA中擴(kuò)增得到pdxP基因。反應(yīng)條件如下在94℃持續(xù)15秒后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃15秒，68℃4分鐘。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用QIAEXII從凝膠中回收得到0.86-kb的DNA片段。利用TOPO TA克隆試劑盒將獲得的0.86-kb片段克隆至CRII-TOPO載體中，并且檢測(cè)獲得的5個(gè)不同的候選克隆子的插入片段的DNA序列。結(jié)果是，候選者之一，攜帶準(zhǔn)確的插入序列的TOPOpdxP105被用于進(jìn)一步的研究。
將TOPOpdxP105中的0.86-kb Sma I片段按照允許pdxP在tac啟動(dòng)子調(diào)控下轉(zhuǎn)錄的方向連接至pKK223-3的Sma I位點(diǎn)中，并將獲得的質(zhì)粒命名為pKKpdxP(圖2)。
隨后，將兩個(gè)不同的攜帶pKKpdxP的克隆JM109(即，JM109/pKKpdxP-1和JM109/pKKpdxP-7)接種于含有100μg/ml的氨芐青霉素(Amp)和1mg/ml維生素B6的LB培養(yǎng)基中。經(jīng)1.5-小時(shí)培養(yǎng)后，通過(guò)加入1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷吡喃糖(IPTG)來(lái)誘導(dǎo)pdxP表達(dá)。在接著培養(yǎng)4.5小時(shí)后，收獲細(xì)胞并將其懸浮于20mM Tris-HCl，pH7.5的緩沖液中，所述緩沖液含有15％蔗糖，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，1mM MnCl2，1-mM MgCl2和0.1mM苯基甲磺?；?PMSF)。將細(xì)胞懸浮物在800kg/cm2的壓強(qiáng)下進(jìn)行細(xì)胞擠壓破碎(French press)，并將獲得的裂解物在4℃下35000×g離心60分鐘從而除去細(xì)胞碎片。在采用同種緩沖液透析后，將上清液作為CFE使用。為了證實(shí)PdxP的表達(dá)，將CFE在12.5％(w/v)的凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析，并采用考馬斯亮藍(lán)染色(快速染色CBB試劑盒，nacalai tesque日本)。在大腸桿菌JM109/pKKpdxP-1中檢測(cè)到預(yù)期分子量大小(29.0KDa)的多肽的過(guò)度表達(dá)，但是在大腸桿菌JM109/pKKpdxP-7中卻沒有觀察到。隨后，大腸桿菌JM109/pKKpdxP-1的CFE被用于進(jìn)一步的研究。
(2)在重組大腸桿菌CEF中從VB6P中制備維生素B6通過(guò)采用如實(shí)施例2-(1)所述的方法制備的CFE，可進(jìn)行從VB6P中制備維生素B6的生產(chǎn)。反應(yīng)混合物含有50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5，2mM吡哆醇5’-磷酸鹽(PNP)，1mM MnCl2和125μl的CFE(0.5mg蛋白)。在37℃下反應(yīng)15分鐘，并通過(guò)HPLC采用4’-脫氧吡哆醇按下述的內(nèi)標(biāo)法來(lái)定量測(cè)定PN的量。為了制備HPLC的樣品，200μl的100mg/l的4’-脫氧吡哆醇作為內(nèi)標(biāo)物，將50μl的60％高氯酸，和950μl的去離子水加入50μl的吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液或反應(yīng)混合物中，并隨后將混合物置于冰上10分鐘。隨后在15000rpm下離心混合物，并將上清液加樣于如下層析柱中。分析條件如下層析柱Capcell pak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，日本)；移動(dòng)相0.1M高氯酸鈉，0.1M磷酸鉀，和2％乙腈(pH3.5)；層析柱溫度30℃；流動(dòng)速率，1.0ml/分鐘；和檢測(cè)器紫外線儀(292nm)。結(jié)果如表5所示。在含有JM109/pKKpdxP CFE的反應(yīng)混合物中形成的PN的濃度為0.50mM，并且其比JM109/pKK223-3的濃度(0.37mM)高1.4倍。
表5JM109/pKKpdxP CFE中形成的PN的量
ND沒有檢測(cè)到(3)苜蓿根瘤菌中pdxP的表達(dá)采用Bgl II消化可移動(dòng)粘粒pVK100，隨后回收約21.3-kb的片段。在采用細(xì)菌堿性磷酸酶處理片段后，將來(lái)源于pKKpdxP的1.1-kb BamH I片段與BglII消化和去磷?；芜B接產(chǎn)生質(zhì)粒pVKPtacpdxP(圖3)。隨后通過(guò)三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)獲得攜帶pVKPtacpdxP的苜蓿根瘤菌IFO 14782，并將所述細(xì)胞接種于含有1％葡萄糖，0.5％多聚蛋白胨，0.2％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O，和0.001％FeSO4·7H2O的種子培養(yǎng)基中；并將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含4％葡萄糖，2％多聚蛋白胨，0.2％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O，和0.001％FeSO4·7H2O的葡萄糖-多聚蛋白胨培養(yǎng)基中，并在30℃下培養(yǎng)3天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并采用鹽溶液洗滌，并懸浮于20mM Tris-HCl，pH7.5的緩沖液中，所述緩沖液含有15％蔗糖，1mM(DTT)，1mM MnCl2，1-mMMgCl2和0.1mM PMSF。將細(xì)胞懸浮物在800kg/cm2的壓強(qiáng)下進(jìn)行細(xì)胞擠壓破碎(French press)，并將獲得的裂解物在4℃下35000×g離心60分鐘從而除去細(xì)胞碎片。在采用同種緩沖液透析后，上清液作為CFE使用。
(4)通過(guò)重組苜蓿根瘤茵CFE進(jìn)行的從VB6P中制備維生素B6通過(guò)采用如實(shí)施例2-(3)中所制備的CFE來(lái)檢測(cè)從VB6P中制備維生素B6的生產(chǎn)。反應(yīng)混合物含有50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5，2mM PNP，1mMMnCl2和125μl的CFE(0.4mg蛋白)。在37℃下反應(yīng)30分鐘，并通過(guò)如實(shí)施例2-(2)所述的HPLC來(lái)定量測(cè)定PN的量。結(jié)果如表6所示。在含有苜蓿根瘤菌IFO14782/pVKPtacpdxP CFE的反應(yīng)混合物中，形成的PN的濃度為1.66mM，并且其比苜蓿根瘤菌IFO 14782中的濃度(0.41mM)高4倍。
表6苜蓿根瘤菌IFO14782/pVKPtacpdxP CFE中形成的PN的量
ND沒有檢測(cè)到序列表<110>羅奇維生素股份公司(Roche vitamins AG)<120>一種編碼維生素B6磷酸磷酸酶的基因及其應(yīng)用<130>NDR5234<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>1Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly1 5 10 15Glu Ala Ile Lys20<210>2<211>14<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>2Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Met Phe Glu Asp Leu Pro Arg1 5 10<210>3<211>23<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>3Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly Ile Asp1 5 10 15Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg20<210>4<211>10<212>PRT
<213>Sinorhizobium meliloti<400>4Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His1 5 10<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物CN02<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n是肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是肌苷<400>5atgaaraary tagaymgaat g 21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n是a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是a，g，c或t<400>6tcytcraaca tncangcrtt20<210>7<211>21<212>DNA
<213>人工的<400>7gccgaattcg cccatgtcac c21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工的<400>8cgccgtgtcg atgcggtgaa g21<210>9<211>708<212>DNA<213>Sinorhizobium meliloti<220>
<221>CDS<222>(1)..(708)<223>
<400>9atg aag aag ctc gac cgc atg ccg acc cac gcc gaa ttc gcc cat gtc 48Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His Ala Glu Phe Ala His Val1 5 10 15acc gac tgg gtc ttc gac ctc gac aac acg ctc tat ccg cat cac gtc 96Thr Asp Trp Val Phe Asp Leu Asp Asn Thr Leu Tyr Pro His His Val20 25 30aat ctg ttc tca cag atc gac cgc aac atg acg gcc tat gtt gcc gaa 144Asn Leu Phe Ser Gln Ile Asp Arg Asn Met Thr Ala Tyr Val Ala Glu35 40 45ctc ctg tcg ctg gag cct gcg gag gcg aag aag ctg cag aag gaa tac 192Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Glu Ala Lys Lys Leu Gln Lys Glu Tyr50 55 60tac cgc gac cac ggc acc acg ctt cag ggc ctg atg ctt cat cac ggc 240Tyr Arg Asp His Gly Thr Thr Leu Gin Gly Leu Met Leu His His Gly65 70 75 80atc gat ccc aat gat ttc ctc gaa aga gcc cac gcc atc gac tat agc 288Ile Asp Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser85 90 95gtg gtg ccg gcc gat ccg gcg ctc ggc gag gcg atc aag gcg ctg ccc 336Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Lys Ala Leu Pro100 105 110gga cgc aag ttc atc ttc acc aac ggc agc gtc gcc cat gcg gag atg 384Gly Arg Lys Phe Ile Phe Thr Asn Gly Ser Val Ala His Ala Glu Met115 120 125
acc gcg cgg gcg ctc ggc att ctc gag cat ttc aac gac atc ttc gac 432Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ile Leu Glu His Phe Asn Asp Ile Phe Asp130 135 140atc gtc gcc gcc ggc ttc ata ccg aag ccc gcc ggc gac acc tac gac 480Ile Val Ala Ala Gly Phe Ile Pro Lys Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Asp145 150 155 160aag ttc atg ggc ctt cac cgc atc gac acg gcg aat gag gtg atg ttc 528Lys Phe Met Gly Leu His Arg Ile Asp Thr Ala Asn Glu Val Met Phe165 170 175gag gat ctg ccg cgc aac ctg gtc gtc cct aag gcg ctc ggc atg aag 576Glu Asp Leu Pro Arg Asn Leu Val Val Pro Lys Ala Leu Gly Met Lys180 185 190acg gtg ctg ctc gtg ccg cgc aat ctc gaa tac gag ttc gcc gag gcc 624Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Glu Phe Ala Glu Ala195 200 205tgg gaa acg tcg agc gac gcg gac gat cag atc gac tac gtc acg gaa 672Trp Glu Thr Ser Ser Asp Ala Asp Asp Gln Ile Asp Tyr Val Thr Glu210 215 220gac ctg gcg ggt ttc ctg cgc agt gtg att gtt tag 708Asp Leu Ala Gly Phe Leu Arg Ser Val Ile Val225 230 235<210>10<211>235<212>PRT<213>Sinorhizobium meliloti<400>10Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His Ala Glu Phe Ala His Val1 5 10 15Thr Asp Trp Val Phe Asp Leu Asp Asn Thr Leu Tyr Pro His His Val20 25 30Asn Leu Phe Ser Gln Ile Asp Arg Asn Met Thr Ala Tyr Val Ala Glu35 40 45Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Glu Ala Lys Lys Leu Gln Lys Glu Tyr50 55 60Tyr Arg Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly65 70 75 80Ile Asp Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser
85 90 95Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly Glu Ala Ile Lys Ala Leu Pro100 105 l10Gly Arg Lys Phe Ile Phe Thr Asn Gly Ser Val Ala His Ala Glu Met115 120 125Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ile Leu Glu His Phe Asn Asp Ile Phe Asp130 135 140Ile Val Ala Ala Gly Phe Ile Pro Lys Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Asp145 150 155 160Lys Phe Met Gly Leu His Arg Ile Asp Thr Ala Asn Glu Val Met Phe165 170 175Glu Asp Leu Pro Arg Asn Leu Val Val Pro Lys Ala Leu Gly Met Lys180 185 190Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Glu Phe Ala Glu Ala195 200 205Trp Glu Thr Ser Ser Asp Ala Asp Asp Gln Ile Asp Tyr Val Thr Glu210 215 220Asp Leu Ala Gly Phe Leu Arg Ser Val Ile Val225 230 235<210>11<211>32<212>DNA<213>人工的<400>11gaagcttccc gggccgtgtc ataaacccgc cc 32<210>12<211>32<212>DNA<213>人工的<400>12caagcttccc gggatcatcg ccgggtttta cg 3權(quán)利要求
1.一種選自如下組的編碼維生素B6磷酸磷酸酶的分離的DNA(a)如SEQ ID NO9所示的DNA序列；(b)一種編碼具有維生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并且所述DNA在標(biāo)準(zhǔn)條件下能與(a)中所定義的DNA序列或其片段雜交；(c)一種編碼具有維生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，其中所述多肽與SEQ ID NO10所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性；(d)一種編碼具有維生素B6磷酸磷酸酶活性的多肽的DNA序列，其中所述DNA序列與SEQ ID NO9所示的DNA序列具有至少70％的同一性；(e)一種(a)至(c)中任意一項(xiàng)的簡(jiǎn)并DNA序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的分離DNA的載體或質(zhì)粒。
3.由權(quán)利要求1所述的分離的DNA編碼的多肽。
4.一種能從維生素B6磷酸鹽中制備維生素B6的Sinorhizobium或埃希氏菌屬的重組微生物，其中所述微生物采用權(quán)利要求1所述的DNA或權(quán)利要求2所述的載體或質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求4所述的微生物，其中所述的微生物為攜帶有pVKPtacpdxP的Sinorhizobium meliloti IFO 14782(S.meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP)。
6.權(quán)利要求4所述的微生物，其中所述的微生物為攜帶pKKpdxP的大腸桿菌JM 109(大腸桿菌JM109/pKKpdxP)。
7.一種制備具有維生素B6磷酸磷酸酶活性的無(wú)細(xì)胞提取物的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的微生物，其中所述微生物在含有可同化碳源、可消化氮源、無(wú)機(jī)鹽、和其他微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，pH值為約5.0至約9.0，溫度為約5℃至約45℃，在需氧條件下培養(yǎng)1天至約15天，和破裂微生物細(xì)胞。
8.從維生素B6磷酸鹽中制備維生素B6的方法，其包括在反應(yīng)混合物中，將維生素B6磷酸鹽與如權(quán)利要求4所述的微生物的無(wú)細(xì)胞提取物相接觸，并從反應(yīng)混合物中回收獲得的維生素B6。
9.權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述的微生物為攜帶pVKPtacpdxP的Sinorhizobium meliloti IFO 14782(S.meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP)。
10.權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述的微生物為攜帶pKKpdxP的大腸桿菌JM 109(大腸桿菌JM109/pKKpdxP)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選自如下組的編碼維生素B
文檔編號(hào)C12P17/12GK1685044SQ03823204
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者星野達(dá)雄, 長(zhǎng)橋喜惠, 田副正明 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)公司