專利名稱：N－11端截短的β－淀粉樣蛋白的單克隆抗體、組合物、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的抗體包括特定的部分或變體，其特異性針對至少是人β-淀粉樣蛋白的N-末端11位點，例如Aβ11-x多肽。還提供了制備和使用所述抗體的方法，包括治療性藥劑、給藥和設(shè)備。
背景技術(shù)：
總體而言，本發(fā)明涉及控制β-淀粉樣前體蛋白發(fā)展的方法和組合物。更特別的是，本發(fā)明涉及該方法和組合物在與阿耳茨海默癥和其它β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的治療相關(guān)的診斷、預(yù)后和監(jiān)控中的應(yīng)用，以及作為治療阿耳茨海默癥和其它β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的方法，所公開的抗體在被動免疫中的應(yīng)用。
阿耳茨海默癥(AD)是一種退化性大腦紊亂，其臨床特征表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、推理、判斷和情感穩(wěn)定性持續(xù)逐漸喪失，導(dǎo)致深度的智力衰退，最終死亡。AD是造成老年人持續(xù)智力減退(癡呆)的最常見原因，在美國其被認(rèn)為是四大最常見疾病死因的代表。AD在全世界的人種和種族中都存在，是現(xiàn)今和未來的重要公眾健康問題。僅在美國，據(jù)估計這種疾病目前就影響了約二到三百萬人。目前AD是無法治愈的。已知現(xiàn)在沒有有效的預(yù)防AD或消除其癥狀和病因的治療手段。
患有AD的病人的大腦表現(xiàn)出稱之為老年(或淀粉樣)斑塊、淀粉樣血管病(在血管上的淀粉樣沉積)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的特征性損傷。在患有AD的病人的大腦中對于記憶和認(rèn)知重要的幾個區(qū)域中普遍存在大量的上述損傷，特別是淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。對未患有臨床AD的絕大多數(shù)老年人的大腦經(jīng)更嚴(yán)格的解剖檢查發(fā)現(xiàn)了少量上述損傷。淀粉樣斑塊和淀粉樣血管病也是患有21三體綜合癥(Down’s綜合癥)、彌漫性Lewy體病、伴有荷蘭型淀粉樣變性病(HCHWA-D)的遺傳性腦出血的病人的大腦的特征。
淀粉樣斑塊的主要成分是一類β-淀粉樣前體蛋白(APP)通過剪切產(chǎn)生的β-淀粉樣蛋白(Aβ)多肽。過去存在著關(guān)于斑塊和纏結(jié)是誘因或僅僅是阿耳茨海默癥的結(jié)果的激烈的科學(xué)爭論，但最近的發(fā)現(xiàn)表明淀粉樣斑塊是成的前體和因素。特別是發(fā)現(xiàn)Aβ多肽的產(chǎn)生源自編碼淀粉樣前體蛋白的基因的突變，該蛋白正常加工時不會產(chǎn)生Aβ多肽。引起家族性、早發(fā)性的阿耳茨海默癥淀粉樣前體蛋白基因突變的鑒定最有力地證明了淀粉樣代謝是這些疾病發(fā)病過程中重要的變化。目前已確信APP蛋白的加工(非致病)的正常過程是通過一種使蛋白的Aβ多肽區(qū)的16和17氨基酸之間裂解的α-分泌酶的裂解而完成的。進一步確信致病過程是通過使前體蛋白的Aβ多肽區(qū)的氨基端裂解的β-分泌酶而部分完成的。
目前已證明BACE-1是APP在+1位裂解所需的重要β-分泌酶。BACE-1的過表達(dá)導(dǎo)致Aβ在+11位的額外的裂解，產(chǎn)生較短的Aβ11-40和Aβ11-42片段，此后也稱之為Aβ11-x多肽。已經(jīng)在原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物和小鼠N2a細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基中檢測到這些Aβ多肽，表明它們是神經(jīng)元(3，4，5)中產(chǎn)生的正常的APP裂解產(chǎn)物。值得注意的是，這些較短的Aβ片段通過生化分析(6)已經(jīng)被證明是AD大腦和正常老年大腦中的主要種類，通過免疫組織化學(xué)研究(7)也證明了在具有AD病理學(xué)特征的Down’s綜合癥大腦中也是這樣。這些事實促使對Aβ11-40/42在阿耳茨海默癥發(fā)病過程中的作用重新評價，特別是考慮到由Glu11開始的Aβ種類比由1位開始的Aβ種類表現(xiàn)為更不溶的事實。
除了了解有關(guān)AD和其它Aβ相關(guān)疾病的機理之外，還需要研究診斷和治療這些疾病的方法和組合物。這樣，監(jiān)測淀粉樣前體蛋白的細(xì)胞加工的能力對于診斷、預(yù)后、治療性監(jiān)管阿耳茨海默癥具有很大意義。特別是希望能確定在容易獲得的病人的樣品，例如血清、腦脊髓液(CSF)等中篩選和評估可檢測的診斷標(biāo)記的具有最小侵害性的可重復(fù)性流程。多克隆抗體，例如Said，T.C.et al.，NeuroscienceLetters 215(1996)；173-176中所述的那些，能用于檢測生物樣品中不同的Aβ多肽，但是考慮到每批多克隆抗體是不同的這一事實，這些抗體不能作為實施在容易獲得的病人的樣品中篩選和評估可檢測的診斷標(biāo)記的可重復(fù)性流程的工具。此外，使用多克隆抗體時非特異性結(jié)合特別高，在Western印跡中的準(zhǔn)確性很低。
已經(jīng)設(shè)想了許多可能的阿耳茨海默癥的診斷性標(biāo)記。本發(fā)明特別感興趣的是APP蛋白經(jīng)β-分泌酶裂解后得到的Aβ前體蛋白的較短的羧基末端片段。這些標(biāo)記可單獨和/或與其它診斷標(biāo)記和方法一起使用。診斷性標(biāo)記優(yōu)選在例如CSF、血液、血漿、血清、尿的體液和組織等中可檢測的，以便于使用最小侵害的診斷方法。
用于Aβ11-x檢測的特別檢測方法應(yīng)能夠在非常低濃度的液體樣品中以可重復(fù)的和分步驟的方式檢測到Aβ11-x，還能夠區(qū)分樣品中可能存在的Aβ11-x多肽和其它APP片段。
這里更詳細(xì)描述本發(fā)明的各個方面。
發(fā)明概述本發(fā)明提供特異性識別較短的Aβ多肽的單克隆抗體，該較短的Aβ多肽是APP蛋白通過BACE-1在Glu-11位剪切后得到的，例如Aβ多肽片段Aβ11-40和Aβ11-42，此后稱之為Aβ11-x多肽。還提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞以及制備抗體和雜交瘤細(xì)胞的方法。以及通過競爭方法對Aβ多肽的免疫測定法或者使用抗體的夾心方法。
本發(fā)明特別提供單克隆抗體，其是使用β-分泌酶11剪切位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(6AA)-Seq Id No.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(8AA)-Seq Id No.2)或者使用β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(6AA)-Seq Id No.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(8AA)-Seq IdNo.4)作為免疫原制備的。所述抗體與Aβ11-x多肽特異性反應(yīng)，與其它APP片段無交叉反應(yīng)，其相應(yīng)的被用于評價在阿耳茨海默癥的發(fā)病過程中Aβ11-x的作用的免疫檢測中。
在一個更特別的實施方案中，單克隆抗體與人Aβ_11(6AA)免疫原反應(yīng)并由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)，它們于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供表達(dá)本發(fā)明單克隆抗體的前述雜交瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的抗體應(yīng)用于檢測Aβ11-x多肽的常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)中，其中無論什么情況都包括用于監(jiān)測β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的生物樣品和來自用于監(jiān)測APP細(xì)胞內(nèi)加工的細(xì)胞培養(yǎng)物的條件化培養(yǎng)基。適合的免疫學(xué)技術(shù)是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如ELISA、Western印跡分析、競爭性或夾心免疫檢測等。此外，被熟知的是它們都依賴于抗原-抗體免疫復(fù)合物的形成，其檢測目的在于抗體被例如放射性、酶或熒光標(biāo)記所標(biāo)記，或者被固定在不溶性載體上而能被檢測。
本發(fā)明也包括本發(fā)明的人源化抗體在藥物制備中的應(yīng)用，該藥物用于治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)阿耳茨海默癥、Down’s綜合癥、HCHWA-D、大腦淀粉樣血管病或其它β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾?。挥糜谥委?、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)臨床和潛伏期的阿耳茨海默癥、Down’s綜合癥、HCHWA-D、大腦淀粉樣血管病中的認(rèn)知衰退；或者抑制淀粉樣斑塊的形成或可溶性毒性Aβ族在人體中作用。
附圖簡述

圖1A注射了作為免疫原的β-分泌酶11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(5AA)-Seq Id No.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(7AA)-Seq Id No.2)或者β-分泌酶11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(5AA)-Seq IdNo.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(7AA)-Seq Id No.4)的小鼠的血清滴度。使用的包被抗原為2.0μg/ml的hAβ(11-40)(AmericanPeptide Company)。
表1注射EVHHQ-C(人Aβ_11(5AA)-Seq Id No.1)的小鼠的脾收集和融合的免疫過程和時間曲線。
表3顯示對AD患者腦切片中Aβ11-x多肽特異性檢測的Western印跡結(jié)果。
圖2使用純化的單克隆抗體JRF/AβN/25、J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2作為捕獲抗體，JRF/cAβ40/10-HRPO作為檢測抗體的夾心ELISA。用與人Aβ1-40和人Aβ11-40(American PeptideCompany)的反應(yīng)性來評價抗體組合。
AJRF/AβN/25和JRF/cAβ40/10-HRPO與人Aβ1-40特異性反應(yīng)，不與hAβ11-40交叉反應(yīng)(用于Aβ1-40檢測的陽性對照)。
BJ&JPRD/hAβ11/1和JRF/cAβ40/10-HRPO與hAβ11-40特異性反應(yīng)，不與人Aβ1-40交叉反應(yīng)。
CJ&JPRD/hAβ11/2和JRF/cAβ40/10-HRPO與hAβ11-40特異性反應(yīng)，不與人Aβ1-40交叉反應(yīng)。
圖3Western印跡顯示J&JPRD/hAβ11/1與被人APPswe和人BACE1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的膜提取物中的APP的β11裂解的CTF片段的特異性反應(yīng)。C6/6.1是針對APP的C末端并與APP的β1和β11裂解的CTF片段反應(yīng)。
詳細(xì)說明本發(fā)明提供特異性識別較短的Aβ多肽的單克隆抗體，該較短的Aβ多肽是APP蛋白通過BACE-1在Glu-11位裂解后得到的。本發(fā)明的抗體具有與人Aβ的β-分泌酶_11裂解位點的前5至7個氨基酸或小鼠Aβ的β-分泌酶_11裂解位點的前5至7個氨基酸上存在的一個或多個抗原決定簇的特異性。
本發(fā)明特別提供單克隆抗體，其是使用包括β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(6AA)-Seq IdNo.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(8AA)-Seq Id No.2)或者使用β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，例如EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(6AA)-Seq Id No.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(8AA)-SeqId No.4)的多肽作為免疫原制備的。
前述的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如熟知的Merrifield固相合成技術(shù)，其中氨基酸依次增加形成長鏈(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2156)。氨基酸序列可以基于上述的Aβ片段的序列，或者可以使用自然產(chǎn)生或者基因工程突變的序列。當(dāng)作為免疫原使用時，由此獲得的多肽可以單獨使用或者可以連接到適合的免疫活化的天然或合成載體上，例如馬來酰亞胺活化的例如如牛、兔和人的哺乳動物的血清白蛋白，如牛、兔、人和綿羊的哺乳動物的甲狀腺球蛋白，以及匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)或者其它例如包括苯乙烯聚合物、丙烯酸聚合物、乙烯基聚合物和丙烯聚合物的合成聚合物的適合的蛋白質(zhì)載體。在實施例中進一步詳細(xì)說明免疫化過程。
一旦獲得了有效量的免疫原，就可以通過使用包括體外或體內(nèi)技術(shù)的不同方法來制備對Aβ11-x多肽特異性的多克隆抗體。體外技術(shù)包括將淋巴細(xì)胞暴露于免疫原，而體內(nèi)技術(shù)需要將免疫原注射到適合的脊椎動物宿主中。適合的脊椎動物宿主是非人的，包括小鼠、大鼠、兔、綿羊、山羊等。根據(jù)預(yù)先決定的方案，將免疫原注射到動物中，定期給動物抽血以得到連續(xù)的具有升高的滴度和特異性的血液。注射可以采用肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射等。佐劑，例如Freund’s完全佐劑或Freund’s不完全佐劑，可用于加強抗體的產(chǎn)生能力。典型的篩選血清滴度水平的方法包括標(biāo)準(zhǔn)的ELISA或RIA檢測法。例如在ELISA篩選過程中，將血清加入用Aβ11-x多肽或者與載體(例如BSA)耦聯(lián)的Aβ11-x多肽包被的固相(例如微孔板的底)上，然后加入抗免疫球蛋白抗體(例如當(dāng)免疫發(fā)生在小鼠中時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體，例如綿羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig))，該抗體與一個可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)，例如酶，優(yōu)選辣根過氧化酶或如I125的放射性同位素。
如果希望，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，并通過上述的方法用目標(biāo)免疫原超免疫例如小鼠的脊椎動物宿主，能夠從中制備單克隆抗體。顯示高滴度抗體的脊椎動物宿主很方便地被從目標(biāo)免疫源免疫的動物中挑選出來。典型的是在最后免疫的2-5天，優(yōu)選為4天，收集其脾臟和淋巴結(jié)，使其中包含的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞永生化。使其永生化的方式不是關(guān)鍵的。目前，最常用的技術(shù)是與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶融合。融合過程根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進行，例如Kohler和Milstein(Nature，256，495-497(1975))的方法。其它技術(shù)包括EBV轉(zhuǎn)化，用例如癌基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒等的裸DNA轉(zhuǎn)化，或者任何其它提供保持細(xì)胞系穩(wěn)定和制備單克隆抗體的方法?？梢允褂冒ň垡叶?PEG)和Sendai病毒的融合增強子。特別優(yōu)選使用PEG。骨髓瘤細(xì)胞的例子包括NS-11、P3U1、SP2/0和AP-1，優(yōu)選使用SP2/0細(xì)胞。
最有效制備產(chǎn)生具有與人Aβ的β-分泌酶_11裂解位點的前5至7個氨基酸或小鼠Aβ的β-分泌酶_11裂解位點的前5至7個氨基酸上存在的表位特異的單克隆抗體的方法首先向產(chǎn)生雜交瘤的動物例如Balb/c小鼠腹腔注射存在于Freund’s佐劑中的目標(biāo)免疫原使其首先免疫化，隨后每兩周加強注射。然后使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)將分離的脾融合，優(yōu)選根據(jù)Kohler和Milstein的改良方法(Eur.J.Immunol.，6，292-295(1976))使用SP2/0細(xì)胞。為確定用于生產(chǎn)與Aβ11-x多肽具有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選可以采用前述的標(biāo)準(zhǔn)ELISA或RIA法。生產(chǎn)目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的挑選和培痛通常在動物培養(yǎng)基(例如Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)或Eagle’s最小基本培養(yǎng)基(MEM))中進行，該培養(yǎng)基中補充了10-20％胎牛血清和其它成分，例如HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷)或者ESG雜交瘤添加劑。相應(yīng)的，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2，它們于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。
抗Aβ11-x單克隆抗體的分離和純化與多克隆抗體的常規(guī)分離和純化操作相似，例如鹽沉淀、乙醇沉淀、等電點沉淀、電泳、離子交換材料(例如DEAE)的吸附和解吸附、超離心、凝膠過濾和包括抗原結(jié)合固相和蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和層析的特異性免疫親和分離技術(shù)。適合的蛋白質(zhì)純化技術(shù)在如Methods in Enzymology，Vol.182，Deutcher，ed.，Academic Press.Inc.，San Diego，1990中所述，這里將其公開的內(nèi)容作為參考。
因此本發(fā)明的目的是提供由前述的雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的分離的單克隆抗體，所述抗體能夠特異性識別Aβ11-x多肽。這些分離的單克隆抗體優(yōu)選由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)，它們于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。
無論什么情況使用本發(fā)明的抗體，以常規(guī)的免疫學(xué)技術(shù)檢測Aβ11-x多肽時，都包括用于監(jiān)測β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的生物樣品和來自用于監(jiān)測APP細(xì)胞內(nèi)加工的細(xì)胞培養(yǎng)物的條件化培養(yǎng)基。適合的免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如ELISA、Western印跡分析、競爭性或夾心免疫分析等。另外被熟知的是，它們都依賴于抗原-抗體免疫復(fù)合物的形成，其檢測目的在于抗體被例如放射性、酶、發(fā)光或熒光標(biāo)記等可檢測性標(biāo)記或者被固定在不溶性載體。因此本發(fā)明的目的是提供用于確定和檢測樣品中Aβ11-x多肽的免疫檢測方法，包括將本發(fā)明的Aβ11-x多肽的抗體與樣品相接觸，并判斷抗體和Aβ11-x多肽之間是否形成免疫復(fù)合物的方法。這些方法或者在組織樣品上實施或者在體液樣品上實施，通常包括從受試者的機體獲取樣品，將所述樣品與成像有效量的可檢測標(biāo)記的本發(fā)明抗體相接觸；檢測標(biāo)記以確定樣品中存在Aβ11-x多肽。
使用本發(fā)明的抗體的檢測方法沒有特別限制。只要與抗原的量相對應(yīng)的抗體、抗原或者抗原-抗體復(fù)合物的量，特別是待測溶液中Aβ11-x多肽的量可以通過化學(xué)或物理手段來檢測，并根據(jù)使用含有已知量的抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算，任何方法都可以使用。例如比濁法、競爭性法、免疫測量法和夾心法是適用的。考慮到靈敏性和特異性，特別優(yōu)選使用下述的夾心法。
在使用標(biāo)記物質(zhì)的測量方法中，放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等作為標(biāo)記試劑。放射性同位素的例子包括125I、131I、3H和14C。酶通常是通過與其適合的底物連接，然后催化可檢測的反應(yīng)來實現(xiàn)檢測的。其例子包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸鹽脫氫酶，優(yōu)選辣根過氧化酶。發(fā)光物質(zhì)包括例如魯光諾、魯米諾衍生物、蟲熒光素、發(fā)光蛋白質(zhì)和熒光素酶。此外，抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)也能用來標(biāo)記本發(fā)明的抗體和免疫原。
當(dāng)免疫原或抗體作不溶處理時，可以采用通常用于蛋白質(zhì)或酶不溶處理或固定化的物理吸附或化學(xué)結(jié)合。載體的例子包括例如瓊脂糖、右旋糖苷和纖維素的不溶性多糖、例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷聚合物的合成樹脂以及玻璃。
在夾心方法中，受試溶液與不溶的抗Aβ11-x多肽抗體反應(yīng)(第一反應(yīng))，標(biāo)記的Aβ11-x多肽抗體進一步反應(yīng)(第二反應(yīng))，然后測試不溶的載體上標(biāo)記試劑的活性，由此能確定受試溶液中Aβ11-x多肽的量。第一反應(yīng)和第二反應(yīng)可以同時進行或依次進行。
在進一步的情況中，為了診斷β-淀粉樣蛋白相關(guān)疾病，將得到的生物樣品，包括組織、體液，例如CSF、血液、血漿、血清、尿等，與適量的第一抗體接觸形成免疫復(fù)合物。典型的接觸包括將樣品加入被第一抗體包被的固體基質(zhì)中。將樣品與第一抗體接觸而形成的復(fù)合物通過洗脫從樣品中分離。然而其它的恢復(fù)方法也可以使用。回收的復(fù)合物與至少一種對應(yīng)于抗原上的抗原決定簇的第二抗體相接觸，來結(jié)合復(fù)合物中的抗原。由于抗原實體的多表位性，第二抗體針對的抗原決定簇可以與第一抗體針對的相同。應(yīng)用上述任何標(biāo)記可以使第一或第二抗體可以被檢測。與由抗原與第一和第二抗體結(jié)合組成的復(fù)合物相結(jié)合的可檢測抗體可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)容易的檢測。通過將生物樣品中獲得的結(jié)果與對照樣品中獲得的結(jié)果相比較，可以確定Aβ11-x多肽的水平發(fā)生改變。
相應(yīng)的本發(fā)明的目的是提供一種夾心檢測法，其中第一抗體包被固體基質(zhì)，此后稱之為包被抗體，由識別Aβ11-x多肽和全長的Aβ40或Aβ42的抗體組成，第二抗體特異性識別Aβ11-x多肽其是可檢測的。優(yōu)選，包被抗體識別人Aβ11-x多肽和全長的Aβ40或Aβ42。在更優(yōu)選的實施方案中，包被抗體由特異性識別Aβ11-40和全長的Aβ40的單克隆抗體JRF/cAβ40/10組成，所述單克隆抗體的特征在于包括至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.5的重鏈可變區(qū)和/或至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.6的輕鏈可變區(qū)(此后稱之為單克隆抗體JRF/cAβ40/10)，或者可選擇的是，包被抗體由特異性識別Aβ11-42和全長的Aβ42的單克隆抗體JRF/cAβ42/12組成，所述單克隆抗體的特征在于包括至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.7的重鏈可變區(qū)和/或至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.8的輕鏈可變區(qū)(此后稱之為單克隆抗體JRF/cAβ42/12)。相應(yīng)的在一個優(yōu)選的實施方案中，第二抗體是由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1或J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)的單克隆抗體之一，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。本發(fā)明的目的是還提供一種確定Aβ11-x多肽與全長的Aβ40或Aβ42比例的夾心測定法。在這種實施方案中，還使用了識別全長的Aβ40和Aβ42，但是與Aβ11-x多肽沒有交叉反應(yīng)性的另一種第二抗體。優(yōu)選這種第二抗體，由JRF/AβN25組成，其特征在于包括至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.9的重鏈可變區(qū)和/或至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.10的輕鏈可變區(qū)。相應(yīng)的本發(fā)明的目的是提供一種夾心檢測法，其中包被抗體由特異性識別Aβ11-x多肽，但是不具有與全長的Aβ40和Aβ42多肽的交叉反應(yīng)性的抗體組成，例如由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1或J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)的單克隆抗體，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB，以及特異性識別Aβ11-40或Aβ11-42的第二抗體，例如具有前述特征的JRF/cAβ42/12或JRF/cAβ40/10。在一種特別的實施方案中，包被抗體由J&JPRD/hAβ11/1組成，第二抗體由特異性識別Aβ11-42和全長的Aβ42的JRF/cAβ42/26組成。所述單克隆抗體特征在于包括至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.11的重鏈可變區(qū)和/或至少一個具有氨基酸序列SEQ ID No.12的輕鏈可變區(qū)(此后稱之為單克隆抗體JRF/cAβ42/26)。
在確定Aβ11-x多肽與全長的Aβ40或Aβ42的比例的備選的夾心測定法中，包被抗體由特異性識別Aβ11-x多肽的抗體組成，優(yōu)選人Aβ11-x多肽，可檢測的第二抗體特異性識別多肽Aβ11-40或Aβ11-42，優(yōu)選人Aβ11-40或人Aβ11-42。在該備選夾心法中，包被抗體由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)的單克隆抗體之一組成，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。第二可檢測的標(biāo)記的抗體由具有前述特征的單克隆抗體JRF/cAβ42/10或單克隆抗體JRF/cAβ40/12組成。
本發(fā)明的單克隆抗體也可以用于夾心法以外的其它檢測系統(tǒng)，例如，競爭性方法和比濁法。在競爭性方法中，測試溶液中的抗原和標(biāo)記的免疫原競爭性與抗體反應(yīng)。隨后，將與抗體結(jié)合的標(biāo)記的免疫原(B)與未反應(yīng)的標(biāo)記的免疫原(F)分離(B/F分離)。然后測定B或F的標(biāo)記量以決定測試溶液中免疫原的量。這些反應(yīng)方法包括可溶性抗體被用做抗體，以及聚乙二醇和上述抗體的第二抗體被用于B/F分離的液相方法，以及固相化的抗體被用作第一抗體，或者可溶性抗體被用作第一抗體和固相化抗體被用作第二抗體的固相化方法。
在比濁法中，測定抗原-抗體在凝膠或溶液中反應(yīng)得到的不溶性沉淀產(chǎn)物的量。既使當(dāng)抗原的量很少，只獲得少量的沉淀，也適合使用激光散射的比濁法。
在另外的方面，本發(fā)明涉及一種治療和預(yù)防以在人體中形成含有β-淀粉樣蛋白的斑塊為特征的病癥的方法，該方法包括給予，優(yōu)選外周給予，需要這種治療的人以治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的人源化單克隆抗體或者其免疫學(xué)反應(yīng)片段，其中抗體特異性結(jié)合人或小鼠Aβ多肽的β分泌酶_11裂解位點的前5到7個氨基酸上存在的一個或多個表位。在另一個方面，本發(fā)明涉及抑制淀粉樣斑塊形成和清除人體中淀粉樣斑塊的方法，該方法包括給予需要這種抑制的人類對象以有效量的人源化抗體，該抗體將Aβ多肽在血液循環(huán)中隱藏起來，誘導(dǎo)大腦的流出物以及改變血漿和大腦中Aβ的清除。在其它方面，發(fā)明涉及這些人源化抗體，包括其免疫學(xué)有效的部分，以及它們的制備方法。
“人源化抗體”是指包括部分或全部衍生自人抗體種系的氨基酸序列的抗體，這種衍生是指改變具有非人互補決定區(qū)(CDR)的抗體的序列?！癈DRs”被定義為作為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)域的抗體的互補決定區(qū)的氨基酸序列，參見例如Kabat et al.，Sequenceof protein of immunological interest，4thEd.，U.S.Department of Healthand Human Services，National Institute of Health(1987)。在免疫球蛋白的可變部分中有三個重鏈和三個輕鏈CDRs(或CDRs區(qū))。這里使用的“CDRs”是指所有三個重鏈CDRs或所有三個輕鏈CDRs(或者如果需要的話，包括重鏈和輕鏈CDRs)。
最簡單的這種改變包括用鼠的恒定區(qū)替換人抗體的恒定區(qū)，從而形成具有有效地適于醫(yī)藥用途的低免疫原性的人/小鼠嵌合體。然而，優(yōu)選將抗體的可變區(qū)和甚至是CDR也通過現(xiàn)在本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行人源化。用相應(yīng)的人的框架區(qū)取代可變區(qū)的框架區(qū)，非人的CDR不做任何處理或者甚至由人類基因組衍生的序列代替CDR。全人抗體由免疫系統(tǒng)已經(jīng)改變?yōu)橄鄳?yīng)的人的免疫系統(tǒng)的基因改造的小鼠來制備。正如上述方法所述，本發(fā)明的方法有效地用于制備抗體的免疫特異性片段，其中包括呈單鏈形式的片段。
人源化抗體也指包括人框架和至少一種來自非人抗體的CDR的抗體，其中存在的任何恒定區(qū)與人免疫球蛋白的恒定區(qū)基本相同，即至少約85-90％，優(yōu)選至少95％相同。因此，人源化抗體的所有部分，除可能的CDRs之外，與一個或多個天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本上是相同的。例如，典型的人源化免疫球蛋白不包括嵌合的小鼠可變區(qū)/人恒定區(qū)抗體。
與非人和嵌合抗體相比，人源化抗體在用于人類治療時具有至少三個潛在的優(yōu)勢1)由于效應(yīng)器部分是人的，它能夠與人免疫系統(tǒng)的其它部分較好的相互作用(例如通過補體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)或者抗體依賴的細(xì)胞毒性(ACDC)更有效地破壞靶細(xì)胞)。
2)人免疫系統(tǒng)不會將人源化抗體的框架或C區(qū)域認(rèn)定為外源性的，因此對抗這種注射的抗體的抗體反應(yīng)要比對抗完全的外源的非人抗體或者部分外源性的嵌合抗體的抗體反應(yīng)小。
3)已經(jīng)有報道注射的非人抗體在人體循環(huán)中的半衰期要比人抗體的半衰期短得多。注射的人源化抗體具有與天然形成的人抗體基本相同的半衰期，可以較小和較低頻率劑量給藥。
在治療和預(yù)防以形成包含β-淀粉樣蛋白的斑塊為特征的病癥的方法中，使用常規(guī)的給藥技術(shù)，優(yōu)選通過靜脈、腹膜、皮下、肺部、透皮、肌肉、鼻腔、口腔、舌下或者栓劑給藥的外圍給藥方式(即不給藥到中樞神經(jīng)系統(tǒng))，向潛在的或表現(xiàn)為Aβ相關(guān)癥狀或病理學(xué)特征，例如臨床或者潛在的阿耳茨海默癥、Down’s綜合癥或臨床或者潛在的淀粉樣血管病的對象給予抗體(包括免疫學(xué)反應(yīng)片段)。盡管抗體可以直接向心室、脊髓液或者腦實質(zhì)給藥，給這些部位定位的技術(shù)也是本領(lǐng)域所熟知的，但不一定要使用這些較為復(fù)雜的方法。當(dāng)通過依靠外周循環(huán)系統(tǒng)的較為簡單的技術(shù)給藥時，本發(fā)明的抗體是有效的。本發(fā)明的優(yōu)點包括即使抗體本身不直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抗體也能夠表現(xiàn)出其有益效果。實質(zhì)上，此處已經(jīng)證明穿過血腦屏障的抗體的量為＜0.1％的血漿水平，本發(fā)明的抗體具有清除外周循環(huán)中Aβ的能力，并能夠改變CNS和血漿可溶性Aβ的清除率。
根據(jù)選擇的給藥方式設(shè)計藥物組合物，根據(jù)需要使用藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如分散劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等。最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton PA在此引入作為參考，其中介紹了從業(yè)者公知的制劑技術(shù)的概況。
改變本發(fā)明抗體的溶解特性，使其更親脂，例如將其包封在脂質(zhì)體中或者封閉極性基團，尤其有用。
優(yōu)選通過靜脈、腹膜或皮下注射的外周系統(tǒng)給藥。適合這些注射的器械為筆直的。此外，給藥也可以通過鼻腔氣溶膠或栓劑經(jīng)粘膜起效。適合這種給藥方式的制劑是公知的，其中典型的包括促進跨膜轉(zhuǎn)運的表面活性劑。這些表面活性劑通常是由甾體衍生而來的或是陽離子脂質(zhì)，例如N-[1-(2，3-二油酰)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)或者例如膽固醇半琥珀酸鹽、磷脂酰甘油等不同的化合物。
制劑中人源化抗體的濃度按重量計算，從低至約0.1％到高達(dá)15或20％，主要根據(jù)液體的體積、粘度等，特別是選用的特定的給藥方式來選擇。因此，典型的注射用藥物組合物的組成包含1mL磷酸緩沖生理鹽水配制的無菌緩沖水和1-100mg的本發(fā)明的人源化抗體。制劑制成后可以經(jīng)無菌過濾，或者以其它方式達(dá)到可接受的微生物標(biāo)準(zhǔn)。典型的靜脈輸液組合物的液體體積為250mL，例如無菌Ringer’s溶液，抗體濃度為每mL 1-100mg或更高。
本發(fā)明的治療劑能夠被冷凍或凍干儲存，使用前用適合的無菌載體配制。凍干和配制能導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失(例如在常規(guī)的免疫球蛋白中，IgM抗體比IgG抗體將損失更多的活性)。必須調(diào)整劑量來彌補損失。選擇制劑的pH值以平衡抗體的穩(wěn)定性(化學(xué)的和物理的)，使給藥時病人感到舒適。
通?？赡褪艿膒H在4至8之間。
盡管前述的方法對于例如人源化抗體的蛋白質(zhì)給藥而言是最方便、最適宜的，但是通過適當(dāng)?shù)母淖?，其它給藥技術(shù)，例如透皮給藥和口服給藥也可以使用，只要制劑設(shè)計適當(dāng)。
此外，也可以使用生物可降解膜和基質(zhì)、或者微型滲透泵、或者基于葡聚糖珠、藻酸鹽或膠原的傳遞系統(tǒng)的控釋制劑達(dá)到效果。
總而言之，可用于本發(fā)明的抗體給藥的制劑是本領(lǐng)域熟知的，可以有多種選擇。利用常規(guī)的臨床技術(shù)能夠優(yōu)化典型的劑量水平，典型的劑量水平還依賴于給藥的方式和病人的身體條件。
本發(fā)明還提供在上述方法中使用的試劑盒，在一個實施方案中，試劑盒在一個或多個容器中包含本發(fā)明的抗體，優(yōu)選純化的抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，甚至更優(yōu)選由雜交瘤細(xì)胞J&LPRD/hAβ11/1和J&LPRD/hAβ11/2表達(dá)的分離的單克隆抗體，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。在一個特別的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含基本上分離的多肽，該多肽包含與包括在試劑盒中的抗體特異性反應(yīng)的抗原決定簇。在進一步的實施方案中，該抗原決定簇選自作為免疫原的β-分泌酶11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(6AA)-Seq Id No.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(8AA)-Seq IdNo.2)或者β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(6AA)-Seq Id No.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(8AA)-Seq Id No.4)。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒用于夾心測定法中，其進一步包含不與目標(biāo)多肽特異性反應(yīng)的包被抗體。在一個特別的實施方案中，該包被抗體識別Aβ11-x多肽和全長的Aβ40或Aβ42，優(yōu)選該包被抗體識別人Aβ11-x多肽和全長的人Aβ40或Aβ42，在更優(yōu)選的情況下，包被抗體由特異性識別Aβ11-40和全長的Aβ42的單克隆抗體JRF/cAβ42/10(此前表征的)或由特異性識別Aβ11-42和全長的Aβ42的單克隆抗體JRF/cAβ42/12(此前表征的)組成的包被抗體。在本發(fā)明備選的夾心測定法中，試劑盒包括特異性識別Aβ11-x多肽，優(yōu)選人Aβ11-x多肽的包被抗體，還包括特異性識別Aβ40或Aβ42的C末端，優(yōu)選人Aβ40或Aβ42的C末端的抗體。在更優(yōu)選的情況下，試劑盒包括由雜交瘤細(xì)胞J&LPRD/hAβ11/1和J&LPRD/hAβ11/2表達(dá)的分離的單克隆抗體作為包被抗體，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。單克隆抗體JRF/cAβ42/10(此前定義的)和單克隆抗體JRF/cAβ42/12(此前定義的)作為第二抗體，后者與可檢測的標(biāo)記、底物連接。
在另一個特殊實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括檢測抗體與目標(biāo)多肽結(jié)合(例如抗體可以與例如熒光化合物、酶的底物、放射性化合物或發(fā)光化合物的可檢測底物結(jié)合，識別第一抗體的第二抗體可以與可被檢測的底物結(jié)合)的工具。特別的是，試劑盒包括檢測抗體與Aβ11-x多肽結(jié)合的工具，該工具優(yōu)選檢測與選自β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(6AA)-Seq IdNo.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(8AA)-Seq Id No.2)或者β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(6AA)-Seq Id No.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(8AA)-Seq IdNo.4)的抗原決定簇結(jié)合。在前述的夾心法中，與可檢測的底物偶聯(lián)的抗體不是包被抗體。
在另外的情況下，本發(fā)明包括用于篩選包括組織、體液例如CSF、血液、血漿、血清、尿等的生物樣品的診斷試劑盒。所述生物樣品包含Aβ11-x多肽。診斷試劑盒包含基本上分離的與Aβ11-x多肽特異性免疫反應(yīng)的抗體，特別是與具有選自由β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即EVHHQ-C(人Aβ_11(6AA)-Seq Id No.1)和EVHHQKI-C(人Aβ_11(8AA)-Seq Id No.2)或者β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即EVRHQ-C(小鼠Aβ_11(6AA)-Seq Id No.3)和EVRHQKL-C(小鼠Aβ_11(8AA)-Seq Id No.4)組成的組中的抗原決定簇免疫反應(yīng)，以及檢測抗體與免疫原結(jié)合的手段。在一個實施方案中，抗體粘附于固體支持物上。在特別的實施方案中，抗體可以是單克隆抗體，特別是由雜交瘤細(xì)胞J&LPRD/hAβ11/1和J&LPRD/hAβ11/2表達(dá)的單克隆抗體，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，各自的保藏號為LMBP5896CB和LMBP5897CB。
試劑盒的檢測手段可以包括標(biāo)記的第二單克隆抗體，優(yōu)選該標(biāo)記的第二抗體包括JRF/cAβ42/10或JRF/cAβ42/12，其中前述的固相化的單克隆抗體與特異性識別Aβ11-40而與Aβ1-40無交叉反應(yīng)的JRF/cAβ40/10結(jié)合，前述的固定化的單克隆抗體與特異性識別Aβ11-42，而與Aβ1-42無交叉反應(yīng)的JRF/cAβ42/12結(jié)合。備選地，或者檢測工具另外可以包括標(biāo)記的競爭性抗原。
上述檢測方法中用于將蛋白質(zhì)材料粘附于固體支持物的固體表面劑是根據(jù)公知技術(shù)制備的，例如聚合物小珠、試紙條(dip stick)、96孔板或者過濾材料。這些粘附的方法通常包括蛋白質(zhì)非特異性吸附于支持物上或者蛋白質(zhì)，典型的通過游離的氨基，與固體支持物上的例如活化的羧基、羥基或醛基的化學(xué)反應(yīng)基團共價結(jié)合。備選地，鏈霉親合素包被的孔板能夠被用于與生物素化的抗原連接。
這樣本發(fā)明提供一種實施該診斷方法的檢測系統(tǒng)或試劑盒。試劑盒通常包括表面結(jié)合了本發(fā)明的抗體的支持物，以及用于檢測抗體與免疫原結(jié)合的報告分子標(biāo)記的抗體。
參考下述的實施例的細(xì)節(jié)將更好的理解本發(fā)明。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，這些實施例是對在后面的權(quán)利要求中有更充分闡述的本發(fā)明的示例性說明。此外，本申請中引用了多種出版物。這些出版物的內(nèi)容在此作為本申請的參考，以充分說明本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的狀態(tài)。
實施例原料和方法單克隆抗體的制備將Balb/c小鼠用四種不同的存在于完全Freund’s佐劑中的多肽免疫。前兩種合成多肽包括β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個人類氨基酸(AA)EVHHQ(KI)-C(人Aβ_11(6或8AA))。其它兩個用于免疫的多肽包含小鼠Aβ_11氨基酸序列EVRHQ(KL)-C。使用例如Pierce的Imjeet Maleimide mcKLH/BSA試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明(Pierce，Rockford，IL)，利用COOH末端的半胱氨酸將多肽與馬來酰亞胺活化的mc(Megathura crenulata)KLH，或者馬來酰亞胺活化的牛血清白蛋白偶聯(lián)來制備所有的多肽。每兩周小鼠加強注射100μg的KLH偶聯(lián)的多肽，第一次多肽存在于完全的Freund’s佐劑中，后面的存在于不完全Freund’s佐劑中。
將所有的小鼠的脾臟分離，除經(jīng)人Aβ_11(6AA)多肽免疫的小鼠的脾臟外都在液氮中冷凍。選擇顯示最高血清滴度的小鼠，并因此將其選擇用來融合。在融合或脾臟提取前的第四天，所有的小鼠腹腔注射100μg的與mcKLH偶聯(lián)的Aβ_11多肽的生理鹽水溶液進行加強。根據(jù)改良的Kohler和Milstein(8)方法，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。在30×96孔板中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，10天后通過使用BSA偶聯(lián)的6AA的hAβ_11多肽的直接ELISA進行篩選，再通過非偶聯(lián)的Aβ11-40多肽來驗證。針對游離hAβ_11多肽的陽性細(xì)胞立即進行亞克隆，在液氮中保存陽性克隆。
在Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有的雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基中補充了10％的胎牛血清(Hyclone，Europe)，2.5％的ESG雜交瘤細(xì)胞添加劑(Elscolab，Kruibeke，Belgium)，2％的HT(Sigma，USA)，1mM的丙酮酸鈉，2mM的L-谷氨酸，青霉素(100U/ml)和鏈霉素(50mg/ml)。所有成分的都是商業(yè)上可獲得的，從Life-Technologies(Payseley，U.K.)購買。細(xì)胞在增濕的8％CO2空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
ELISA抗體的選擇用于檢測抗Aβ_11抗體的篩選ELISA是一種直接的ELISA，，其中將1μg/ml游離的人/小鼠Aβ11-40或BSA偶聯(lián)的人/小鼠Aβ_11在具有50μl/孔包被緩沖液(10mM Tris、10mM NaCl和10mM NaN3，pH8.5)的NUNC(Life Technologies)的U形底高結(jié)合96孔微滴度孔板中在4℃下包被過夜。第二天，將孔板用具有85μl/孔的0.1％的酪蛋白PBS溶液在37℃下包被60分鐘以減少非特異性結(jié)合。然后，加入50μl雜交瘤細(xì)胞上清液，在37℃下培養(yǎng)1小時。清洗后，結(jié)合的單克隆抗體用50μl/孔的與辣根過氧化酶在37℃下培養(yǎng)偶聯(lián)1小時的綿羊抗小鼠Ig(Amersham-Pharmacia Biotech)來檢測。所有的試劑用0.1％的酪蛋白/PBS稀釋。清洗孔板，加入50μl溶液作為底物，該溶液中含有0.42mM的3，5，3’，5’-四甲基聯(lián)苯胺，0.003％(體積/體積)H2O2的100mM檸檬酸溶液，100mM的磷酸氫二鈉溶液(pH4.3)。反應(yīng)在室溫下在孔板搖床上進行，最長時間為15分鐘。隨后用50μl/孔的2N的H2SO4終止顏色變化，將孔板放在微滴度孔板讀數(shù)器(Thermomax，Molecular Device)上在450nm下讀數(shù)。采用直接ELISA檢測選擇的單克隆抗體與全長的人游離的Aβ1-40多肽的交叉反應(yīng)，其中除了使用全長人游離的Aβ1-40多肽代替BSA偶聯(lián)的hAβ_11(6AA)多肽之外，都與篩選檢測方法相同。在第二個驗證ELISA中，選擇的陽性培養(yǎng)物用游離的Aβ11-40多肽再檢測。
用于檢測β淀粉樣蛋白的夾心ELISA檢測hAβ(1-40)或hAβ(11-40)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液(American PeptideCompany)的ELISA按下述方法進行簡單的說，將5μg/ml的單克隆抗體JRF/AβN/25、J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2在具有100μl/孔包被緩沖液的NUNC平底高結(jié)合96孔微滴度板中4℃下包被過夜。第二天，孔板用125μl/孔的0.1％的酪蛋白PBS溶液在37℃下過夜包被30分鐘，以減少非特異性結(jié)合，再用100μl/孔的hAβ(1-40)或hAβ(11-40)多肽稀釋樣品在37℃下孵育90分鐘。清洗孔板，隨后用100μl/孔的HRP標(biāo)記的JRF/cAβ40/10-HRPO孵育。清洗孔板，加入100μl溶液作為底物，溶液中含有0.42mM的3，5，3’，5’-四甲基聯(lián)苯胺，0.003％(體積/體積)H2O2的100mM檸檬酸溶液，100mM的磷酸氫二鈉溶液(pH4.3)。反應(yīng)在孔板搖床上在室溫下進行，最長時間為15分鐘。隨后用50μl/孔的2N的H2SO4終止顏色變化，將孔板置于微滴度孔板讀數(shù)器(Thermomax，Molecular Device)上在450nm下讀數(shù)。
APP CTF的免疫檢測為了免疫檢測CTF(STUBS)片段，將HEK細(xì)胞用人APPswe和人BACE1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在75cm2培養(yǎng)瓶(Life，Techologies，Paisly，U.K.)中培養(yǎng)直到融合，然后將細(xì)胞消化，在50mM的TrispH＝7.0，0.15MNaCl，1％的Triton X-100和商用的蛋白酶抑制劑Cocktail(Roche，Boehringer Mannheim，Germany)中超聲處理。粗消化產(chǎn)物在4℃下以10000g離心10min以除去細(xì)胞核和碎片。提純的細(xì)胞消化產(chǎn)物根據(jù)蛋白質(zhì)含量而經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，樣品在95℃下在2x TricineLaemmli緩沖液中變性5分鐘，轉(zhuǎn)入預(yù)先制備的10-20％的TrisTricine SDS梯度凝膠(NOVEX，Introvigen，Groningen，TheNetherlands)，在1.5mA/cm2的條件下，經(jīng)過45分鐘半干轉(zhuǎn)入0.22μm的Hybond-ECL尼龍膜(APB)上。小分子量的蛋白質(zhì)梯度被用作分子量標(biāo)準(zhǔn)(MagicMark Western標(biāo)準(zhǔn)，Introvigen)。將膜用10％(w/v)脫脂奶粉(BioRad)的PBS溶液封閉1小時。然后，將其與5μg/ml適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w在4℃下孵育過夜(單克隆抗體C1/6.1針對APP的C末端抗原決定簇，來自Dr.Mathews，Nathan，S.KlineInstitute，Orangeburg的慷慨贈送)。然后將膜在0.1％的Tween20的PBS溶液中清洗5分鐘，其中換5次緩沖液。與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠(Sigma)1∶2000的稀釋液在室溫下(RT)孵育1小時。清洗后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明(Roche，Boehringer Mannheim，Germany)，通過化學(xué)發(fā)光將目標(biāo)條帶可視化。使用Lumi-Imager(BoehringerMannheim，Germany)進行掃描。
AD病人大腦切片中APP的免疫測定將大腦切片用10％(w/v)的脫脂奶粉(BioRad)的PBS溶液封閉1小時。然后將其與5μg/ml適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w在4℃下孵育過夜。然后將膜在0.1％的Tween20的PBS溶液中清洗5分鐘，其中換5次緩沖液。用HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠(Sigma)1∶2000的稀釋液在室溫下(RT)孵育1小時。清洗后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明(Roche，BoehringerMannheim，Germany)，通過化學(xué)發(fā)光將目標(biāo)條帶可視化。使用Lumi-Imager(Boehringer Mannheim，Germany)進行掃描。
結(jié)果與討論“融合小鼠”的挑選向小鼠注射一組4種不同mcKLH偶聯(lián)的多肽。對于每個多肽，免疫3只不同的小鼠。在第一次加強免疫后，給每只小鼠抽血，分離血清，用直接包被的BSA人hAβ(6AA)的ELISA方法檢測。用hAβ_11(6AA)免疫小鼠的方法與所有被注射的小鼠一樣，如表1所示。在圖1a中，清楚的證明了用KLH_hAβ_11(6AA)(SEQ ID No.1)免疫的小鼠1顯示很高的對游離的人Aβ11-40多肽的血清滴度。因此，用hAβ_11(6AA)免疫的小鼠1被選擇用來融合。
hAβ_11(6aa)的融合，脾臟1由于該超免疫的小鼠的脾細(xì)胞數(shù)量很大(共計6.5×108脾細(xì)胞)，使用半數(shù)脾細(xì)胞進行兩次融合過程。所有的細(xì)胞在添加了ESG的培養(yǎng)基中增殖，十天后用30×96雜交瘤孔板篩選。
在這些雜交瘤中，最初65個培養(yǎng)孔在應(yīng)用BSA偶聯(lián)多肽的篩選ELISA檢測法中顯示明顯的陽性信號。所有這些呈陽性的上清液用IgG特異性ELISA檢測其游離的多肽。只有5個培養(yǎng)物被證實為陽性，或者最初顯示陽性的孔中不足10％為陽性。所有這些培養(yǎng)物對全長的人Aβ1-40為陰性，表現(xiàn)出具有與hAβ11-40/42末端存在AA的反應(yīng)性。
立即將培養(yǎng)物克隆，將母體培養(yǎng)物冷凍。這5個之中，2個被命名為29B5(J&JPRD/hAβ11/1)和5C4(J&JPRD/hAβ11/2)的雜交瘤細(xì)胞被成功克隆，冷凍在液氮中。這兩個雜交瘤每個有4個不同亞克隆被培養(yǎng)并冷凍。在表2中，總結(jié)了陽性的亞克隆。
表2
在非AD的人對照、小獵犬和豚鼠的CSF樣品中Aβ1-40/42以及截短的Aβ11-40的確定用于測定CSF樣品中的Aβ1-40/42和截短的Aβ11-40的ELISA如下操作簡單的說，將5μg/ml單克隆抗體J&JPRD/hAβ11/1或者特異性Aβx-40和Aβx-42單克隆抗體(Vandermeeren M.et al.2001；Pype S.，et al.2003)JRF/cAβ40/10和JRF/cAβ43/26在具有100μl/孔包被緩沖液的NUNC平底高結(jié)合微滴度96孔板中包被過夜。第二天，孔板用150μl/孔的0.1％的酪蛋白PBS溶液在37℃下過夜包被30分鐘，以減少非特異性結(jié)合，再與100μl/孔的PBS緩沖液稀釋的CSF樣品在37℃下孵育90分鐘。清洗孔板，隨后用100μl/孔的HRP標(biāo)記的JRF/cAβN/25-HRPO或JRF/cAβ40/28-HRPO孵育。清洗孔板，加入100μl溶液作為底物，溶液中含有0.42mM的3，5，3’，5’-四甲基聯(lián)苯胺，0.003％(體積/體積)H2O2的100mM檸檬酸溶液，100mM的磷酸氫二鈉溶液(pH4.3)。反應(yīng)在孔板搖床上在室溫下進行，最長時間為15分鐘。隨后用5μl/孔的2N的H2SO4終止顏色變化，將孔板放在微滴度孔板讀數(shù)器(Thermomax，MolecularDynamics)上在450nm下讀數(shù)。
使用本發(fā)明的單克隆抗體，可以定量檢測(ng/ml±stdev)非AD人對照、小獵犬和豚鼠的CSF樣品(n＝6)中截短的11-40β淀粉樣蛋白同型體。
結(jié)論在總數(shù)超過30,000的雜交瘤中，我們選擇了兩個不同的特異性識別人Aβ11-40多肽的游離N末端的雜交瘤細(xì)胞克隆。這些單克隆抗體對于全長的人Aβ1-40呈陰性。為了評價抗體的特異性，將其用蛋白G親和色譜純化，用于特異性抗人cAβ40和cAβ42mAbs的夾心ELISA中。JRF/AβN/25作為Aβ1-40的特異性單克隆抗體和JRF/cAβ40/10-HRPO一起作為檢測抗體使用。后者特異性識別Aβ的C末端部分，相應(yīng)的與特異性識別Aβ11-x多肽的抗體JRF/cAβN/25、J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2一起被用作檢測抗體。圖2A證實了JRF/cAβN/25與Aβ1-40特異性反應(yīng)，不與Aβ11-40交叉反應(yīng)。從圖2B和2C可以看出，抗體J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2特異性識別hAβ11-40，不與人Aβ1-40交叉反應(yīng)。
本發(fā)明的抗體特異性標(biāo)記生物樣品中Aβ11-x多肽的能力由應(yīng)用人APP和人BACE-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的膜提取物(圖3)和AD病人淀粉樣斑塊的大腦切片的Western印跡來驗證(表3)。相應(yīng)地，在夾心ELISA中使用這些抗體和特異性抗人cAβ40和抗人cAβ42的單克隆抗體，就形成了在包括生物體液和大腦勻漿的不同生物樣品中特異性檢測人Aβ11-x多肽的靈敏的檢測法。
參考文獻(xiàn)1.Jarrett，J.T.，Berger，E.P.，Lansbury，P.T.，The carboxy terminus of the beta amyloidprotein is critical for the seeding of amyloid formationimplications for thepathogenesis of Alzheimer′s disease.Biochem.32(1993)4693-4697.
2.Selkoe，DJ.，Alzheimer′s diseasegenes，proteins，and therapy.Physiol.Rev.81(2001)741-7663.Gouras，G.K.，Xu，H.，Jovanovic，J.N.，Buxbaum，J.D.，Wang，R.，Relkin，N.R.，Gandy，S.，Generation and regulation of beta-amyloid peptide variants by neurons，J.Neurochem.，71(1998)1920-1925.
4.Wang，R.，Sweeney，D.，Gandy，S.E.，Sisodia，S.S.，The profile of soluble amyloidbeta protein in cultured cell media.Detection and quantification of amyloid beta proteinand variants by immunoprecipitation-mass spectrometry，J.Biol.Chem.，271(1996)31894-31902.
5.Vandermeeren，M.，Geraerts，M.，Pype，S.，Dillen，L.，Van Hove，C.，Mercken，M.，The functional inhibitor DAPT prevents production of amyloid β1-34 in human andmurine cell lines.Neurosci.Lett.315(2001)145-148.
6.Naslund，J.，Schierhorn，A.，Hellman，U.，Lannfelt，L.，Roses A.D，Tjernberg，L.O.，Silberring，J.，Gandy，S.E.，Winblad，B.，Greengard，P.，Nordstedt，C.，Terenius，L.，Relative abundance of Alzheimer A beta amyloid peptide variants in Alzheimer diseaseand normal aging，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91(1994)8378-8382.
7.Iwatsubo，T.，Saido，T.C.，Mann D.M.，Lee，V.M.-Y.，Trojanowski，J.Q.Full-lengthamyloid-beta(1-42(43))and amino-terminally modified and truncated amyloid-beta42(43)deposit in diffuse plaques.Am.J.Pathol.149(1996)1823-1830.
8.Kohler，G.，Howe，S.C.，Milstein，C，.Fusion between immunoglobulin-secreting andnonsecreting myeloma cell lines.Eur J Immunol 6(1976)292-295.
9.Pype，S.，Moechars，D.，Dillen，L.，Mercken，M.，Characterization of amyloid betapeptides from brain extracts of transgenic mice overexpressing the London mutant ofhuman amyloid precursor protein，J.Neurochem.84(3)602-609.
表1
表3
序列表<110>Janssen Pharmaceutica N.V.
<120>β-淀粉樣蛋白單克隆抗體、組合物、方法和用途<130>PRD 32<150>PCT/EP02/11062<151>2002-09-27<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由人β淀粉樣蛋白BACE1裂解位點的前5個氨基酸組成的免疫原<400>1Glu Val His His Gln1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由人β淀粉樣蛋白BACE1裂解位點的前7個氨基酸組成的免疫原<400>2Glu Val His His Gln Lys Ile1 5
<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由小鼠β淀粉樣蛋白BACE1裂解位點的前5個氨基酸組成的免疫原<400>3Glu Val Arg His Gln1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由小鼠β淀粉樣蛋白BACE1裂解位點的前7個氨基酸組成的免疫原<400>4Glu Val Arg His Gln Lys Leu1 5<210>5<211>136<212>PRT<213>Mus sp.
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<400>12Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro20 25 30
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權(quán)利要求
1.特異性識別Aβ11-x多肽的單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特異性識別作為免疫原的β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個人類氨基酸，即Seq Id No.1和Seq IdNo.2，或者β-分泌酶_11裂解位點的前5-7個小鼠氨基酸，即Seq IdNo.3和Seq Id No.4。
3.權(quán)利要求1或2所述抗體，其被可檢測性地標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3所述抗體，其中可檢測性標(biāo)記為放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
5.權(quán)利要求1至4中任何一項所述的抗體，其被固定在載體上。
6.權(quán)利要求1至5中任何一項所述的單克隆抗體，其由雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2表達(dá)，這些細(xì)胞于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，保藏號分別為LMBP5896CB和LMBP5897CB。
7.雜交瘤細(xì)胞J&JPRD/hAβ11/1和J&JPRD/hAβ11/2，它們于2002年8月19日保藏在比利時微生物保藏協(xié)會，保藏號分別為LMBP5896CB和LMBP5897CB。
8.確定或檢測樣品中Aβ11-x多肽的免疫檢測方法，該方法包括將樣品與權(quán)利要求1至3中任何一項所述的Aβ11-x多肽的抗體接觸，并確定抗體和Aβ11-x多肽之間是否形成了免疫復(fù)合物。
9.檢測組織樣品中存在Aβ11-x多肽的方法，該方法包括從受試者機體獲得組織樣品；將組織樣品與成像有效量的權(quán)利要求3或4所述的可檢測性標(biāo)記的抗體相接觸；以及檢測標(biāo)記以確定組織樣品中Aβ11-x多肽的存在。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中抗體被可檢測性標(biāo)記，由至少一種權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞表達(dá)。
11.檢測體液樣品中存在Aβ11-x多肽的方法，該方法包括從受試者的機體獲得體液樣品；將體液樣品與成像有效量的權(quán)利要求3或4所述的可檢測性標(biāo)記的抗體相接觸；以及檢測標(biāo)記以確定體液樣品中Aβ11-x多肽的存在。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中抗體被可檢測性標(biāo)記，由至少一種權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞表達(dá)。。
13.權(quán)利要求1至6中任何一項所述的單克隆抗體在權(quán)利要求9或10所述的方法中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1至6中任何一項所述的抗體在β淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的診斷中的用途。
15.診斷組合物，其包含權(quán)利要求1至6中任何一項所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
16.用于診斷β淀粉樣蛋白相關(guān)疾病的免疫檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求2至5中任何一項所述的抗體和用于抗體的載體工具。
全文摘要
本發(fā)明涉及的抗體包括特定的部分或變體，其特異性針對至少是人β－淀粉樣蛋白的N－末端11位點，例如Aβ11－x多肽。還提供了制備和使用所述抗體的方法，包括治療性藥劑、給藥和設(shè)備。
文檔編號C12N5/18GK1685236SQ03823116
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者M·H·默肯, M·M·P·P·范德梅倫 申請人:詹森藥業(yè)有限公司