專利名稱：四氫嘧啶合成酶基因、重組載體、重組工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及涉及一種四氫嘧啶合成酶基因、重組載體、重組工程菌及其應用，屬于酶的基因工程領域。
背景技術：
四氫嘧啶作為相容性溶質于1粥5年在極端嗜鹽菌to thiorhodospirahalochloris 中被(ialinski等所發(fā)現(xiàn)并且鑒定結構，1988年hbar等又在革蘭氏陽性土壤細菌 Streptomycesparvulus中發(fā)現(xiàn)了四氫嘧啶的羥基化衍生物羥基化四氫嘧啶。四氫嘧啶類相容性溶質(ectoinesEcs)是嗜鹽菌中最普遍存在的相容性溶質之一，能夠為處于外界高溫、冷凍、射線、干燥等極端條件刺激下的細胞、蛋白質、細胞膜、和核酸提供保護作用，因此受到各國研究者的廣泛關注。此外Ecs對阿爾茲海默氏癥、帕金森病等神經(jīng)性疾病均有一定的療效，并且最新研究發(fā)現(xiàn)Ecs能夠提高皮膚的再生能力和延緩皮膚的老化。因此，Ecs 在精細化工、生物醫(yī)藥及生物制造等行業(yè)將具有廣泛的應用前景。目前處理高鹽廢水常用的是物化法+生化法的水處理工藝，該工藝流程繁瑣，工藝參數(shù)要求嚴格，操作困難，處理效率低，運行成本高，廢水處理過程中產(chǎn)生大量有毒有害固廢很難處理。經(jīng)過該工藝處理后的廢水很難達到國家的直排標準。據(jù)現(xiàn)有報道來看，對高鹽廢水直接采用生物法處理，在企業(yè)的實際應用中少有成功案例。生物法處理雖然在工藝流程以及成本投入方面有很大優(yōu)勢，但由于此種廢水的高鹽以及極強的殺菌抑制能力， 使得其對微生物的殺傷力極大，因此，尋找一種能應用于工業(yè)生產(chǎn)的處理高鹽廢水的微生物是目前高鹽廢水處理行業(yè)所關注的焦點。近幾年，國內外學者對微生物四氫嘧啶合成酶的基因工程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。斯圖加特大學根據(jù)ES的基因序列、蛋白質結構等的研究情況整理了一個ES酶工程數(shù)據(jù)庫對ES酶相關信息進行了不同的分類。目前為止已克隆了包括微生物和動植物在內的眾多ES酶基因，在NCBI中已報道的ES酶基因已達1000余個(包括假單胞菌、酵母菌、葡萄球菌、鏈霉菌和枯草桿菌等眾多微生物來源的)；而且仍在迅猛增加。由于ES酶基因氨基酸序列具有較低相似性，即不同種甚至同種不同屬的微生物之間的ES酶基因序列也存在較大的差異，所以ES酶基因的克隆存在較大難度。目前關于 ES酶基因的克隆策略有以下幾種(1)通過構建DNA/mRNA文庫克隆ES酶基因直接將待克隆基因的基因組酶切后回收帶有ES酶的基因片段，轉化到五coli中構建基因組文庫，在羅丹明B平板上篩選陽性克隆。( RACE的方法。分別通過3' RACE和5' RACE，經(jīng)過兩輪 PCR，獲得基因全長；(3)直接從已知序列設計引物PCR克隆ES酶基因根據(jù)序列同源性比較，參考已報道出發(fā)菌株ES酶基因序列設計引物，以基因組DNA為模板直接進行PCR擴增目的ES酶基因片段。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種四氫嘧啶合成酶基因、含有該基因的重組載體和重組工程菌。本發(fā)明的另一個目的是提供該重組工程菌的應用，本發(fā)明所述基因為耐鹽基因， 將該基因轉入菌株制得的工程菌耐鹽性大大提高，在處理高鹽廢水中具有重要應用。本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的
一種四氫嘧啶合成酶基因，具有SEQ NO 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明四氫嘧啶合成酶基因的得到方法與常規(guī)方法略有不同，以前期篩選到的耐鹽菌株芽孢桿菌(Bacillaceae)基因組為模板，通過簡并引物PCR與反向PCR(IPCR)相結合的方法，擴增得到了編碼完整的ES酶基因的ORF框，該基因全長414bp，編碼137個氨基酸，序列如SEQ NO :1所示。具體方法如下
1、根據(jù)四氫嘧啶合成酶的氨基酸序列，設計簡并引物序列上游引物 5’ -GGNTTYWSNTTYCAYATHACN-3 ‘
下游引物 5，-NGGRTTRAANACRCA-3，
2、以芽孢桿菌(Bacillaceae)基因組為模板，進行PCR擴增獲取ES酶基因，其反應體系為
10X buffer5. 0 MLdNTPs (2. 5 mM)4.0 yL上游引物(50 mM)1.0 yL下游引物(50 mM)1.0 yLTaq DNA polymerase0. 5 μ L芽孢桿菌(Bacillaceae)基因組1.0 μΗ,Ο37. 5 μ L
反應條件為預變性94°C，5min ；變性溫度94°C，Imin ；退火溫度57°C，Imin ； 延伸溫度72°C，1. 5min，循環(huán)32次。根據(jù)上述四氫嘧啶合成酶基因，可編碼四氫嘧啶合成酶，其氨基酸序列如SEQNO 2所示。本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體(即重組表達載體，下同)，重組載體的構建方法為將以芽孢桿菌基因組為模板擴增得到的含有限制性內切酶(EcoRI與NotI)酶切位點的ES酶基因與T載體pBST相連得到pBST-ES，然后將表達載體pIC9K與pBST_ES分別進行雙酶切，酶切后的基因片段與質粒PIC9K進行連接并轉化進大腸桿菌，提取質粒然后用Bg II線性化處理，得到重組載體，命名為PIC9K-ES。將上述線性化的重組載體pIC9K-ES轉入目的降解菌株中，可以得到含有ES酶的重組工程菌，本發(fā)明所用的降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-IO是從工廠廢水車間的生物處理池及工廠生產(chǎn)車間周邊土樣中富集、篩選得到的，發(fā)明人已經(jīng)將降解菌株和重組工程菌進行了保藏，降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-10，保藏號為CGMCC NO. 4328，保藏日期為2010年11月12日；重組工程菌Oceanobacillus sp. CJ-10-1的保藏號為CGMCC NO. M63，保藏日期為2011年11月16日，他們均保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。本發(fā)明的重組工程菌實現(xiàn)了該基因的高效表達，本發(fā)明的重組工程菌有以下特點(1)表達量高由于醇氧化酶基因啟動子很強，細胞生長速度很快，所以該表達系統(tǒng)表達的外源蛋白產(chǎn)量很高；( 穩(wěn)定性好由于該系統(tǒng)的表達載體不是以自主復制的質粒形式存在，而是整合在染色體上，所以構建的菌株十分穩(wěn)定；C3)分泌量大分泌信號和先導序列(如α因子)使其分泌表達可達10g/L，這在ES酶的生產(chǎn)過程中十分少見；(4)容易放大；( 成本較低重組蛋白在目的降解菌株中的表達比在昆蟲和哺乳動物中表達成本要低，生產(chǎn)和表達基質不需要象牛血清白蛋白那樣昂貴的添加物，也不需要(X)2培養(yǎng)箱和組織培養(yǎng)箱等昂貴的設備。本發(fā)明還提供了含有該基因的重組工程菌的應用，具體的是在處理高鹽廢水中的應用，所述廢水含鹽量在12wt%以下，酚含量在2500mg/L以下，COD在10000mg/L以下，廢水中含有苯酚、2，4-二氯苯酚、氯乙酸和2，4-D酸中的至少一種。經(jīng)重組的菌株具有很高的耐鹽性和穩(wěn)定性，大大降低了廢水處理成本，大大提高了廢水處理效率。采用重組工程菌處理高鹽廢水的工藝流程如圖5所示，方法為
(1)含鹽含酚廢水進入調配池，調節(jié)廢水中的C0D、N和P的含量，同時將廢水溫度調節(jié)至15-35°C，pH調節(jié)至7. 5-9. 5，鹽含量調節(jié)為l_12wt% ；
(2)廢水進入生物處理設備進行生物降解，處理后廢水中COD< 200mg/L，.< OJmg/ L，所述生物處理設備包括依次連接的一級厭氧生物濾池、二級厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級好氧生物濾池，所述一級厭氧生物濾池、二級厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級生物濾池中均固定有權利要求5所述的重組工程菌，重組工程菌的固定量均為 l-5g/L 廢水；
(3)生物處理后廢水進一步采用磁性大孔離子交換樹脂進行吸附，吸附后廢水中TOC < 20mg/L ；
(4)步驟C3)后的廢水進入氯堿精制工藝或進入鹽場晾曬后回收固體鹽。上述生物處理設備中，固定重組工程菌所用的載體為陶粒、火山石、聚氨酯懸浮填料、顆粒活性炭或高溫竹炭，優(yōu)選活性炭，固定時間為M-4 !。上述生物處理設備中，一級和二級厭氧生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15-;35°C、時間20-24h ；—級好氧生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15_;35°C、 時間20-24h、溶氧2-%ig/L ；二級生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15_35°C、時間 20-24h、溶氧 2-4mg/L。上述步驟(1)中，加入尿素調節(jié)廢水中N含量，加入KH2PO4調節(jié)廢水中P含量，使廢水中C0D:N:P的濃度比為100-300:2-6:0. 6-1. 2，以為菌種提供環(huán)境條件。上述步驟(3)中，生物處理后廢水PH6-9，流速為15-30mL/min，吸附溫度為 25-；35 °C。得到的重組工程菌需要擴大培養(yǎng)才能滿足實際需要，培養(yǎng)過程為將重組工程菌按10%的接種量接入到培養(yǎng)基中，在溫度15-35°c、pH 7. 5-9. 5、溶解氧2-%ig/L的條件下對菌種進行擴大培養(yǎng)72-%h，培養(yǎng)后將培養(yǎng)基離心分離得濕菌體；所用培養(yǎng)基為葡糖糖 9-llg/L，尿素 1. 0-1. 2g/L，磷酸二氫鉀 1. 29-1. 34g/L，氯化鈉 12wt%。本發(fā)明重組工程菌不需馴化即可直接用于處理高鹽廢水，對鹽濃度在12wt%以下的廢水均有很好的處理作用，大大減少了稀釋用水的使用量；生物處理過后的廢水，酚類物質去除率在99%以上，并且出水COD保持在200mg/L以下，繼續(xù)對出水進行磁性大孔樹脂吸附處理，使廢水不僅達到了山東半島流域水污染物綜合排放標準，還可以曬出工業(yè)鹽，具有廣泛的社會效益和環(huán)境效益。本發(fā)明的重點是提供SEQ NO :1所示的核苷酸序列、SEQ NO :2所示的氨基酸序列、 具有該SEQ NO :1所示的核苷酸序列的重組載體和重組工程菌。在已知上述兩種序列的基礎上，可以通過現(xiàn)有技術得到核苷酸序列和氨基酸序列，例如PCR擴增技術。此外，相關載體、宿主細胞、內切酶、試劑的獲得，也是可以在市場中買到或者根據(jù)現(xiàn)有技術得到的，對本領域技術人員來說均為顯而易見的。本發(fā)明提供了一種四氫嘧啶合成酶基因、重組載體、重組工程菌及應用，該基因可編碼四氫嘧啶合成酶，并在宿主細胞中高效表達以生產(chǎn)四氫嘧啶合成酶，使含有該基因的工程菌結構穩(wěn)定、性能優(yōu)良、耐鹽性高，處理高鹽廢水無需馴化，降低了高鹽廢水處理成本， 簡化了生產(chǎn)工藝，可廣泛應用于日化、食品加工、皮革加工、有機合成和藥物制備等行業(yè)中高鹽廢水的處理，意義重大。保藏信息
降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-10，已經(jīng)于2010年11月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 4328 ；
重組工程菌Oceanobacillus sp. CJ-10-1，已經(jīng)于2011年11月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. M63。


圖1實施例2所得四氫嘧啶合成酶基因片段的電泳圖。圖2實施例3四氫嘧啶合成酶基因回收電泳圖。圖3實施例3pIC9K_ES重組載體純化電泳圖。圖4pIC9K質粒圖譜。圖5重組工程菌廢水處理流程圖。
具體實施例方式下面通過實施例進一步的闡述本發(fā)明并證實本發(fā)明的優(yōu)點。下述實例中，所用到的技術，例如PCR技術、引物設計技術、載體構建技術、細胞轉化技術、檢測技術、電泳技術等均為基因工程中的成熟技術，本領域技術人員可根據(jù)現(xiàn)有技術實現(xiàn)。在操作過程中所用到的設備或試劑、載體、菌株等，如無特別注明，均能在市場中得到。下述實施例所用的限制性內切酶(EcoRI內切酶、NotI內切酶)、Taq酶、T4 DNA ligase, T4 DNA ligase buffer均購于Takara公司，大腸桿菌和pIC9K質粒載體購于 Invitrogen公司,T載體購于Tiangen公司。實施例1
本發(fā)明ES酶基因的原始取得過程如下
采用上海生工的One-4-All Genomic DNA Mini-Preps Kit提取芽孢桿菌 (Bacillaceae)基因組DNA (操作步驟見試劑盒說明書)。根據(jù)四氫嘧啶合成酶的氨基酸序列，設計簡并引物序列，上游引物為GGNTTYWSNTTYCAYATHACN，下游引物為 NGGRTTRAANACRCA。然后以芽孢桿菌基因組DNA為模板，在簡并引物的作用下通過PCR的方法得到含有限制性內切酶(EcoRI與NotI)酶切位點的ES酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. 1 所示。
反應體系
IOX buffer dNTPs (2. 5 mM) 上游引物(50 mM) 下游引物(50 mM) Taq DNA polymerase 芽孢桿菌基因組DNA H9O
0. 5 μ L l.OyL 37. 5 μ L
4. 0 yL l.OyL l.OyL
5.0 ML
反應條件預變性94°C，5min ；變性溫度94°C，Imin ；退火溫度57°C，Imin ； 延伸溫度72°C，1. 5min，循環(huán)32次。實施例2
在得到本發(fā)明ES酶基因核苷酸序列的基礎上，其基因的獲得可以通過現(xiàn)有方法克隆得到，其方法如下
1、表達用ES酶基因的克隆
根據(jù)實施例1得到的SEQ NO: 1基因序列，設計并合成擴增引物Qe-I與Qe_2。Qe-I 5， -GGCCGTTCTGGCCGCAGGCGTGTCTCAAGG-3， Qe-2 5’ -GGATCCGTTCTCAACTTGTG-3’
以芽孢桿菌基因組DNA為模板，在引物的作用下進行PCR擴增，反應體系為
IOX buffer5. 0 μ L
dNTPs (2. 5 mM)4. 0 μ L
Qe-I (50 mM)l.OyL
Qe-2 (50 mM)l.OyL
Taq DNA polymerase 0. 5 μ L
芽孢桿菌基因組DNA 1.0 yL
雙蒸水37. 5 μ L
采用PCR儀，反應條件預變性94 °C 5min;變性溫度94 °C Imin ；退火溫度57°C， Imin ；72° C 延伸 1. 5min，循環(huán) 32 次。將PCR產(chǎn)物利用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為400bp左右的基因片段，結果如圖1所示。實施例3
本發(fā)明基因片段可以與質粒連接構建得重組表達載體，其方法為 將上述實施例2的基因片段回收與T載體pBST (Tiangen公司)相連，轉化進大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5 α中，抗性篩選，提取符合要求的質粒，記為pBST_ES，所得質粒與表達載體PIC9K (其質粒圖譜如圖4所示)分別進行雙酶切，雙酶切反應體系如下 PIC9K 或 pBST-ES10 μ
10ΧΗ buffer2 μ
EcoRI內切酶1 μι
Noti內切酶ι μ
7雙蒸水6 μ
反應條件37° C酶切2-4h，加入4μ 10 X loading buffer終止反應，反應液用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收酶切片段，如圖2所示。將回收的目的片段及質粒PIC9K進行連接，得重組表達載體，命名為PIC9K-ES。連接反應體系(ΙΟμυ為
pIC9K2 目的DNA片段2μιT4 DNA Iigase1μι10XT4 DNA ligase buffer1μι雙蒸水4μι
連接反應條件16°C過夜，將連接的重組質粒進行線性化處理，線性化處理體系 (20μυ 為
PIC9K-ES10 μ
IOXH buffer2 μ
Bgl II1 μ
雙蒸水6 μ
線性化條件37°C酶切2 4 h，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測線性化程度，如圖3所示， 使用核酸回收試劑盒(Takara公司，大連)回收產(chǎn)物。實施例4
將上述實施例3線性化的pIC9K-ES重組載體通過電轉化的方式轉入目的降解菌株 (JC-10)感受態(tài)細胞中，得到重組工程菌。電轉化方案
1)取80 μ 1感受態(tài)JC-10細胞至一新的無菌Eppendorf管中，加入5-10 μ 1線性化 DNA，置于0. 2cm型的電穿孔轉化杯中。2)將電轉杯置于冰上5min。3)電穿孔轉化電擊條件電壓1500V;電阻400Ω ；電容25yF;脈沖時間 IOmS ； 1-2次電擊。4)電擊后，馬上在電擊轉化杯中加入ImL 0°C預冷的IM的山梨醇溶液，用微量移液器輕輕吹打均勻，置于冰浴中。5)將電轉杯中的混合液轉移到新的無菌Eppendorf管中，30° C，靜置培養(yǎng)1_池。6)分別取10，25，50, 100和200 μ 1混合液涂布在MD平板上。下面通過具體實施例闡述本發(fā)明重組工程菌在處理含酚廢水中的應用及效果。實施例5
在處理廢水前將重組工程菌固定在生物處理系統(tǒng)中，該生物處理系統(tǒng)包括依次連接的一級厭氧生物濾池、二級厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級生物濾池，重組工程菌固定在一級厭氧生物濾池、厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級生物濾池中。固定過程為將重組工程菌按l_5g/L廢水的投加量加入到帶有載體的生物反應器中，將重組工程菌固定在載體上，固定時間為M-4 !。固定重組工程菌的載體可選自陶粒、火山石、聚氨酯懸浮填料、顆粒活性炭和高溫竹炭中的任一種，優(yōu)選和常用的為顆?；钚蕴俊１景l(fā)明所用的聚氨酯懸浮填料來自佛山市碧沃豐生物科技有限公司，所用的高溫竹炭來自徐州天正活性炭廠。在處理廢水時載體可隨意選擇。
實施例6將上述實施例4得到的重組工程菌應用到2，4-D高鹽含酚廢水的處理當中，以2，4-D 生產(chǎn)工廠的高鹽含酚廢水為例，廢水中含有苯酚、2，4- 二氯苯酚、氯乙酸、2，4-D酸等有機物，酚含量在2500mg/L以下，COD含量在10000mg/L以下，含鹽量高達12%，分別取10組 2，4-D含酚廢水，廢水中鹽、酚含量見下表
權利要求
1.一種四氫嘧啶合成酶基因，其特征是具有SEQ NO :1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的四氫嘧啶合成酶基因，其特征是其能編碼SEQN0:2所示的氨基酸序列。
3.一種含有權利要求1所述四氫嘧啶合成酶基因的重組載體。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組載體，其特征是所述重組載體是由權利要求1所述的四氫嘧啶合成酶基因和表達載體PIC9K構建而得。
5.一種用權利要求4所述的重組載體轉化得到的重組工程菌，其特征是所述重組載體轉化入Oceanobacillus sp. CJ-IO CGMCC NO. 4328中，所得重組工程菌為 Oceanobacillus sp. CJ-10-1 CGMCC NO. 5463。
6.一種權利要求5所述的重組工程菌在處理高鹽廢水中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征是包括以下步驟(1)含鹽含酚廢水進入調配池，調節(jié)廢水中的C0D、N和P的含量，同時將廢水溫度調節(jié)至 15-35°C、pH 調節(jié)至 7. 5-9. 5 ；(2)廢水進入生物處理設備進行生物降解，處理后廢水中COD< 200mg/L，.< OJmg/ L，所述生物處理設備包括依次連接的一級厭氧生物濾池、二級厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級好氧生物濾池，所述一級厭氧生物濾池、二級厭氧生物濾池、一級好氧生物濾池和二級生物濾池中均固定有權利要求5所述的重組工程菌，重組工程菌的固定量均為 l-5g/L 廢水；(3)生物處理后廢水進一步采用磁性大孔離子交換樹脂進行吸附，吸附后廢水中TOC < 20mg/L ；(4)步驟C3)后的廢水進入氯堿精制工藝或進入鹽場晾曬后回收固體鹽。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征是生物處理設備中，固定重組工程菌所用的載體為陶粒、火山石、聚氨酯懸浮填料、顆?；钚蕴炕蚋邷刂裉?，固定時間為Μ-4 !；—級和二級厭氧生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15-35°C、時間20_24h ；—級好氧生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15-35°C、時間20_24h、溶氧2-%ig/L ；二級生物濾池廢水處理條件為pH 7. 5-9. 5、溫度15-;35°C、時間20_24h、溶氧2-%ig/L。
9.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征是步驟(1)中，加入尿素調節(jié)廢水中N含量， 加入KH2PO4調節(jié)廢水中P含量，使廢水中COD:N:P的濃度比為100-300:2-6:0. 6-1. 2 ；步驟 (3)中，生物處理后廢水PH6-9，流速為15-30mL/min，吸附溫度為25_35°C。
10.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征是廢水含鹽量在12wt%以下，酚含量在 2500mg/L以下，COD在10000mg/L以下，廢水中含有苯酚、2，4-二氯苯酚、氯乙酸和2，4-D酸中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種四氫嘧啶合成酶基因、重組載體、重組工程菌及應用，該基因可編碼四氫嘧啶合成酶，并在宿主細胞中高效表達以生產(chǎn)四氫嘧啶合成酶，使含有該基因的工程菌結構穩(wěn)定、性能優(yōu)良、耐鹽性高，處理高鹽廢水無需馴化，降低了高鹽廢水處理成本，簡化了生產(chǎn)工藝，可廣泛應用于日化、食品加工、皮革加工、有機合成和藥物制備等行業(yè)中高鹽廢水的處理，意義重大。
文檔編號C12R1/01GK102517306SQ20111042074
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權日2011年12月16日
發(fā)明者凌曉光, 孫國慶, 李志清, 陳蕾 申請人:山東濰坊潤豐化工有限公司