專利名稱：一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨肽酶是一類能夠水解蛋白質(zhì)和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中。氨肽酶在許多生物加工過程中起著重要的作用，如蛋白質(zhì)的消化和分解、蛋白質(zhì)的成熟、激素分泌的調(diào)節(jié)及細(xì)胞周期的控制。毫無疑問，許多疾病的引發(fā)都與氨肽酶有關(guān)，包括炎癥、白內(nèi)障、糖尿病、中風(fēng)、囊性纖維化甚至癌癥和艾滋病等。因此，正確了解氨肽酶的催化機(jī)制以及一些影響氨肽酶發(fā)揮正常生物學(xué)功能的因素對(duì)預(yù)防和治療這些疾病有著重要的作用。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶存在產(chǎn)量低的問題，如何提高微生物法生產(chǎn)氨肽酶的產(chǎn)量成為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效表達(dá)氨肽酶的重組大腸桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌ZjOie的去除了信號(hào)肽的氨肽酶基因?qū)隕. coli BL2KDE3)得到的基因工程菌。所述枯草芽孢桿菌Zj016，詳見田亞平，須瑛敏。一種枯草芽孢桿菌氨肽酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]·食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32 (3) :7-10.所述去除了信號(hào)肽的氨肽酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供一種所述高效表達(dá)氨肽酶的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題，步驟如下1)收集枯草芽孢桿菌ZjOie分泌的純酶進(jìn)行N端氨基酸序列測(cè)定；2)將測(cè)得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，根據(jù)與其一致性最高蛋白的核苷酸序列并設(shè)計(jì)引物Pl和P2克隆氨肽酶基因，將所述氨肽酶基因轉(zhuǎn)化E. coli JM109，得到重組質(zhì)粒 PUC19-SAP ；3)分析氨肽酶核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P3和P4克隆出不含信號(hào)肽的編碼成熟氨肽酶的基因；將所述成熟氨肽酶的基因與載體pET48a(+)連接，挑選陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21(DE3)。所述引物Pl核苷序列如SEQ ID NO. 2所示。所述引物P2核苷序列如SEQ ID NO. 3所示。所述引物P3核苷序列如SEQ ID NO. 4所示。所述引物P4核苷序列如SEQ ID N0. 5所示。本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該方法簡單有效，構(gòu)建的重組大腸桿菌能高效表達(dá)氨肽酶，能為后期研究氨肽酶的特性、結(jié)構(gòu)等提供所需蛋白。


圖1 野生菌純酶N端測(cè)序結(jié)果。圖2 枯草芽孢桿菌氨肽酶基因的克隆結(jié)果(1 目的基因)。圖3 重組質(zhì)粒PUC19-SAP雙酶切結(jié)果，(1 :PUC19，2 目的基因)。圖4 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AP雙酶切結(jié)果(1 :pET_28a(+) ；2 目的基因)。圖5 重組大腸桿菌表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果(M marker ；1 未誘導(dǎo)；2 誘導(dǎo)；3 目的蛋白)。
具體實(shí)施例方式材料和檢測(cè)方法LB培養(yǎng)基胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，氯化鈉，pH 7.0。TB培養(yǎng)基1. 2 %胰蛋白胨，2. 4 %酵母提取物，0. 4 %甘油，17mM KH2PO4, 72mMK2HP04o氨肽酶活性測(cè)定方法以L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物，在50mM pH 8. 5的 Tris-HCl緩沖液中加入稀釋一定倍數(shù)的酶液和底物(ImM)，50°C水浴反應(yīng)lOmin，在405nm 下測(cè)定吸光度。酶活單位定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μ M對(duì)硝基苯胺所需的酶量為一個(gè)酶活單位(IU)。實(shí)施例1 將枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，從玻璃板上取下凝膠， 去除所有濃縮膠。將凝膠浸入電轉(zhuǎn)緩沖液(CAPS 10mM、甲醇10%、pH 11)中30min。濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)緩沖液中浸泡lmin。PVDF膜在甲醇中浸泡1 后將膜放于雙蒸水中5min，再小心放于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡lOmin。然后打開轉(zhuǎn)移夾子，黑孔板朝下，將泡沫墊子、濾紙、凝膠、膜、 濾紙、泡沫墊子按順序放入夾子中。將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽中，黑孔板面對(duì)準(zhǔn)支撐板的負(fù)極， 白孔板對(duì)準(zhǔn)支撐板的正極。在轉(zhuǎn)移槽中加入適量緩沖液至轉(zhuǎn)移槽全部浸沒。將電轉(zhuǎn)槽放在冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電流恒流85mA，2h即可。轉(zhuǎn)移完成后用鑷子從槽中取出膜，在雙蒸水中漂洗膜，然后浸入甲醇數(shù)秒，放入染色液(0. 1 %考馬斯亮藍(lán)G-250、40%甲醇、1 %乙酸) 中染色30-60s。然后放置脫色液(50%甲醇水溶液)中進(jìn)行脫色至背景無蘭色即可。用雙蒸水漂洗膜，置膜于濾紙自然干燥。剪下目的條帶，送測(cè)序。將測(cè)得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST，查找出與其一致性最高的蛋白的基因。利用同源性最高的基因設(shè)計(jì)引物，提取枯草芽孢桿菌Zjoie基因組并以其作為模板，克隆目的基因。上游引物Pl如SEQ ID NO. 2所示；下游引物P2如SEQ ID NO. 3所示。PCR 體系為10μΜ 弓I 物 Pl 禾口 P2 各 lyL，2mM dNTPS 5 μ L, 10 X KOD-Plus-Neo Buffer5 μ L, IU/ μ L 的 KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 1 μ L,模板 0. 5 μ L,加雙蒸水補(bǔ)齊 50 μ L。 PCR條件:94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin 30s，30個(gè)循環(huán)。將 PCR產(chǎn)物和載體PUC19分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109，在含有氨芐(lOOyg/mL)抗性的LB平板挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后送上海生工測(cè)序，重組質(zhì)粒即PUC19-SAP。根據(jù)測(cè)得的DNA序列分析，目的基因編碼成熟氨肽酶和一個(gè)含有31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，以重組質(zhì)粒PUC19-SAP為模板，克隆不含信號(hào)肽的目的基因，PCR體系和條件同上。上游引物P3如SEQ ID NO. 2所示；下游引物P4如SEQ ID NO. 2所示。將PCR產(chǎn)物和空載體pET48a(+)分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16°C連接過夜， 轉(zhuǎn)化E. coli JM109，在含有卡那(50yg/mL)抗性的LB平板挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后測(cè)序，重組質(zhì)粒即pET18a(+)-AP。將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21 (DE3)，在含有卡那(50 μ g/mL)抗性的LB平板挑取單菌落做表達(dá)驗(yàn)證。實(shí)施例2 挑取單菌落于5mL LB培養(yǎng)基(卡那50 μ g/mL)中，37°C 200rpm過夜培養(yǎng)，再按 1 %的接種量轉(zhuǎn)接至50mL TB培養(yǎng)基(卡那50 μ g/mL)中37°C 200rpm培養(yǎng)至OD值0. 8左右，加入IPTG至終濃度0. 4mM, 28 °C 200rpm培養(yǎng)12h后8000rpm離心5min收集菌體，再用10mL50mM pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮菌體，超聲破碎，離心收集上清液，進(jìn)行酶活和SDS-PAGE驗(yàn)證。測(cè)得發(fā)酵液的酶活為4. 8U/mL。對(duì)照組不加IPTG誘導(dǎo)，其余條件同上。 SDS-PAGE結(jié)果見圖5。
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌ZjOie的編碼成熟氨肽酶基因?qū)隕. coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述編碼成熟氨肽酶基因是去除了31 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的氨肽酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.—種權(quán)利要求1所述生產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下1)收集枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進(jìn)行N端氨基酸序列測(cè)定；2)將測(cè)得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，根據(jù)與其一致性最高蛋白的核苷酸序列并設(shè)計(jì)引物Pl和P2克隆氨肽酶基因，將所述氨肽酶基因轉(zhuǎn)化E. coli JM109，得到重組質(zhì)粒 PUC19-SAP ；3)分析氨肽酶核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P3和P4克隆出不含信號(hào)肽的編碼成熟氨肽酶的基因；將所述成熟氨肽酶的基因與載體pET48a(+)連接，挑選陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21(DE3)。
4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下1)將枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，從玻璃板上取下凝膠，去除所有濃縮膠，將凝膠浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中30min ；濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)緩沖液中浸泡Imin ；PVDF膜在甲醇中浸泡1 后將膜放于雙蒸水中5min，放于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡IOmin ；然后打開轉(zhuǎn)移夾子，黑孔板朝下，將泡沫墊子、濾紙、凝膠、膜、濾紙、泡沫墊子按順序放入夾子中；將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽中，黑孔板面對(duì)準(zhǔn)支撐板的負(fù)極，白孔板對(duì)準(zhǔn)支撐板的正極；在轉(zhuǎn)移槽中加入適量緩沖液至轉(zhuǎn)移槽全部浸沒；將電轉(zhuǎn)槽放在冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電流恒流85mA，2h即可； 轉(zhuǎn)移完成后用鑷子從槽中取出膜，在雙蒸水中漂洗膜，然后浸入甲醇數(shù)秒，放入染色液中染色30-60S ；然后放置脫色液中進(jìn)行脫色至背景無蘭色；用雙蒸水漂洗膜，置膜于濾紙自然干燥，剪下目的條帶，送測(cè)序；2)將測(cè)得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST，查找出與其一致性最高的蛋白的基因；利用同源性最高的基因設(shè)計(jì)引物，提取枯草芽孢桿菌Zj016基因組并以其作為模板，克隆目的基因；PCR體系為10 μ M引物Pl和P2各1 μ L，2mM dNTPS 5 μ L， 10 X KOD-Plus-NeoBuffer 5 μ L，IU/ μ L 的 KOD-Plus-Neo DNA 聚合酶 1 μ L,模板 0· 5 μ L，力口雙蒸水補(bǔ)齊50yL ;PCR條件94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin 30s, 30個(gè)循環(huán)；將PCR產(chǎn)物和載體PUC19分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coliJM109，在含有氨芐抗性的LB平板挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后送上海生工測(cè)序，重組質(zhì)粒即PUC19-SAP ；3)根據(jù)測(cè)得的DNA序列分析，目的基因編碼成熟氨肽酶和一個(gè)含有31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，以重組質(zhì)粒PUC19-SAP為模板，克隆不含信號(hào)肽的目的基因，PCR體系和條件同上；將PCR產(chǎn)物和空載體pET48a(+)分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，在含有卡那抗性的LB平板挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后測(cè)序，重組質(zhì)粒即pET48a(+)-AP ；將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)， 在含有卡那抗性的LB平板挑取單菌落做表達(dá)驗(yàn)證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該方法簡單有效，構(gòu)建的重組大腸桿菌能高效表達(dá)氨肽酶，為后期研究氨肽酶的特性、結(jié)構(gòu)等提供所需蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102492646SQ20111037440
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者周哲敏, 崔文璟, 高新星 申請(qǐng)人:江南大學(xué)