專利名稱：一種高產氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
一種高產氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用，生物工程技術領域。
背景技術：
氨肽酶是一類能夠水解蛋白質和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在于動植物以及微生物中。氨肽酶根據最易反應底物的不同可以分為亮氨酸氨肽酶、賴氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脫苦和蛋白質的深度水解中有著重要作用， 目前主要用于食品工業(yè)中，包括魚肉類加工工業(yè)、植物類加工工業(yè)以及以微生物為原料的加工工業(yè)等，它可以增加游離氨基酸的量，改善風味，提高營養(yǎng)價值，還可以作為醬油醬料等調味品的添加劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明第一個目的是提供一種高產氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌Zjoie的編碼成熟氨肽酶基因導入枯草芽孢桿菌得到的基因工程菌。所述枯草芽孢桿菌Zj016，詳見田亞平，須瑛敏。一種枯草芽孢桿菌氨肽酶的純化及酶學性質[J]。食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32 (3) :7-10.所述編碼成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtil is WB600,詳見 xuchu Wu, wiIson Lee, louise Tran, and suilam Wong. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases[J], JOURNAL OF BACTERIOLOGY,1991 :4952_4958。大腸-枯草穿梭載體為PMA5 詳見 EVA ZYPRIAN and HANS MATZURA. Characterization of signal promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid ρUBl10 and development of a Gram-positive expression system[J]. DNA,1986,5 :219_225。本發(fā)明第二個目的是提供一種分泌表達氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法。所述重組枯草芽孢桿菌的構建方法如下1)根據枯草芽孢桿菌氨肽酶的基因設計引物，以原始菌基因組為模板，克隆出含編碼信號肽序列的目的基因。2)將克隆出的目的基因SEQ ID NO. 1連接到載體PUC19上，轉化E. coli JM109， 涂布具有抗性的LB平板，PCR、雙酶切驗證陽性轉化子，獲取重組質粒PUC19-SAP，將鑒定后的重組質粒進行測序分析。3)將重組質粒PUC19-SAP和大腸-枯草穿梭載體PMA5分別進行雙酶切，切膠回收目的片段，連接并轉化E. coli JM109，涂布具有抗性的LB平板，挑取轉化子進行PCR、雙酶切驗證，獲取重組質粒PMA5-SAP。4)將重組質粒PMA5-SAP轉化Bacillus subtilis WB600，獲得重組菌，待做表達驗證。本發(fā)明第三個目的是提供一種利用所述的重組枯草芽孢桿菌生產氨肽酶的方法， 是將重組枯草芽孢桿菌經過種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述利用重組枯草芽孢桿菌生產氨肽酶的具體方法如下1)從保藏平板挑取重組菌單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(卡那50yg/mL)中 37°C 200rpm過夜培養(yǎng)，再按的接種量轉接至50mL TB培養(yǎng)基(卡那50 μ g/mL)中 37 °C 200rpm 培養(yǎng) 36h。2)將獲得的發(fā)酵液SOOOrpm離心5min除菌體，獲得的發(fā)酵上清液即為粗酶液。本發(fā)明提供了一種高產氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用，該方法高效安全，酶活達32U/mL，是原始菌種產酶能力的15倍，獲得的氨肽酶是胞外酶，有利于后期大規(guī)模生產的提取純化，產品符合食品要求。


圖1 氨肽酶目的基因的PCR結果(1 :目的基因)圖2 重組質粒PUC19-SAP雙酶切結果(1 :PUC19 ；2 目的基因)
圖3 重組質粒PMA5-SAP示意4 重組枯草芽孢桿菌表達SDS-PAGE結果(M :marker ；1 含PMA5空質粒的重組菌表達結果；2 含PMA5-SAP質粒的重組菌表達結果；3 氨肽酶)
具體實施例方式材料和檢測方法LB培養(yǎng)基胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，氯化鈉，pH 7.0。TB培養(yǎng)基1. 2 %胰蛋白胨，2. 4 %酵母提取物，0. 4 %甘油，17Mm KH2PO4, 72mMK2HP04o氨肽酶活性測定方法以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，在50mM pH 8. 5的 Tris-HCl緩沖液中加入稀釋一定倍數的酶液和底物(ImM)，50°C水浴反應lOmin，在405nm 下測定吸光度。酶活單位定義在50°C下，Imin分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1 μ M對硝基苯胺所需的酶量為一個酶活單位(IU)。實施例1為實現氨肽酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達，從信號肽處設計一對引物，即上游引物(包含Nde I酶切位點)5 ‘ -GGAATTCCATATGAAAAAGCTTTTGACTGT-3‘下游引物(包含BamH I酶切位點)5' -CGCGGATCCTTATTTGATATCTTCAAAAA-3'以原始菌基因組為模板，克隆含編碼信號肽序列的目的基因，PCR體系為10μΜ 弓I 物 Pl 禾口 Ρ2 各 lyL，2mM dNTPS 5 μ L, 10 XKOD-Plus-NeoBuffer 5μ L, lU/μ L 的 KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1 μ L，模板0. 5 μ L，加雙蒸水補齊50 μ L。PCR條件94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin 30s，30個循環(huán)。將PCR產物和載體 PUC19分別進行雙酶切后切膠回收，于16°C連接過夜，轉化E.coli JM109，涂布含有氨芐(100 μ g/mL)抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)10_1池，挑取3個轉化子，提取重組質粒并進行PCR 和雙酶切驗證，然后對驗證正確的重組質粒測定DNA序列，陽性克隆子即PUC-SAP。將重組質粒PUC19-SAP和大腸-枯草穿梭載體PMA5分別進行雙酶切后切膠回收，于16°C連接過夜，轉化E. coli JM109，涂布含有氨芐(100 μ g/mL)抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)10_1池，挑取 3個轉化子，提取重組質粒并進行PCR和雙酶切驗證，陽性克隆子即PMA-SAP。將獲得的重組質粒PMA-SAP轉化Bacillus subtilis WB600，轉化方法如下從保藏平板上挑取Bacillus subtilis WB600單菌落至2mL SP I培養(yǎng)基中(均用50mL離心管)， 于37°C 200rpm培養(yǎng)過夜。按10%的接種量轉接于5mL SP I培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm培養(yǎng)至對數生長末期(約4 證)，再按10 %的接種量轉接于2mL SPII培養(yǎng)基中，于37°C 200rpm 培養(yǎng)90min后加入20uL IOmM EGTA,再于37°C 200rpm培養(yǎng)IOmin。分裝成0. 5mL每管，加入質粒DNA，于37°C IOOrpm培養(yǎng)90min，取菌液涂布含卡那(50 μ g/mL)的篩選平板，37°C培養(yǎng)10h-12h，挑取3個轉化子保藏，待做表達驗證。SP 鹽0. 2% (NH4)2SO4,1. 4% K2HPO4,0. 6% KH2PO4,0. 02% MgSO4 ·7H20，0. 檸檬
酸鈉；SP I培養(yǎng)基SP鹽溶液加入體積濃度為50%葡萄糖溶液，體積100 X CAYE 溶液；SP II培養(yǎng)基SP I培養(yǎng)基加入體積50mM CaCl2溶液，體積250mM MgCl2 溶液。實施例2從保藏平板挑取重組菌單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基(卡那50yg/mL)中 37°C 200rpm過夜培養(yǎng)，再按的接種量轉接至50mL TB培養(yǎng)基(卡那50 μ g/mL)中 37°C 200rpm培養(yǎng)36h。將獲得的發(fā)酵液SOOOrpm離心5min除菌體，獲得的發(fā)酵上清液即為粗酶液。測定粗酶液的活力達到32U/mL。
權利要求
1. 一種生產重組枯草芽孢桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌ZjOie中編碼氨肽酶的基因導入枯草芽孢桿菌得到的基因工程菌。
2.如權利要求ι所述基因工程菌，其特征在于，所述編碼成熟氨肽酶基因核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
3.如權利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtil is WB600。
4.一種權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，步驟如下1)將克隆出的目的基因SEQID NO. 1連接到載體PUC19上，轉化E. coli JM109，涂布具有抗性的LB平板，PCR、雙酶切驗證陽性轉化子，獲取重組質粒PUC19-SAP，將鑒定后的重組質粒進行測序分析。2)將重組質粒PUC19-SAP和大腸-枯草穿梭載體PMA5分別進行雙酶切，切膠回收目的片段，連接并轉化E. coli JM109，涂布具有抗性的LB平板，挑取轉化子進行PCR、雙酶切驗證，獲取重組質粒PMA5-SAP。
5.一種應用權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌生產氨肽酶的方法，是將重組枯草芽孢桿菌經過種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，從發(fā)酵液中提取氨肽酶。
6.如權利要求5所述方法，其特征在于，具體步驟如下1)從保藏平板挑取重組菌單菌落接種于5mL含卡那霉素50yg/mLLB培養(yǎng)基中 370C 200rpm過夜培養(yǎng)，再按1 %的接種量轉接至50mL含卡那霉素50 μ g/mL TB培養(yǎng)基中 37 0C 200rpm 培養(yǎng) 36h ；2)將獲得的發(fā)酵液SOOOrpm離心5min除菌體，獲得的發(fā)酵上清液即為粗酶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌表達氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法及利用該重組菌生產氨肽酶的方法，屬于基因工程技術領域。該方法高效安全，獲得的氨肽酶是胞外酶，有利于后期大規(guī)模生產的提取純化，產品符合食品要求。
文檔編號C12R1/125GK102492645SQ20111037334
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權日2011年11月22日
發(fā)明者周哲敏, 崔文璟, 高新星 申請人:江南大學