專利名稱：抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因家畜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因家畜的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法，屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄類動(dòng)物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類烈性傳染病之首，一旦暴發(fā)，必須撲殺感染及接觸感染的動(dòng)物。2001年英國(guó)暴發(fā)口蹄疫損失約90億英鎊，占其國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值的1. 1%；2005年我國(guó)部分地區(qū)暴發(fā)Asia I型FMD，2009年初多個(gè)省區(qū)又發(fā)生了 A型FMD，不僅造成了巨大的直接經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)品的對(duì)外貿(mào)易，對(duì)國(guó)家的政治、 經(jīng)濟(jì)具有深遠(yuǎn)的影響。目前，大多數(shù)流行FMD的國(guó)家以計(jì)劃免疫為主的措施預(yù)防FMD。盡管新型疫苗不斷涌現(xiàn)，但傳統(tǒng)滅活疫苗仍是預(yù)防FMD的基礎(chǔ)。FMDV變異快，血清型多，且不同血清型疫苗之間沒(méi)有交叉保護(hù)，故通過(guò)疫苗免疫的單一手段很難控制和根除FMD。因此，科學(xué)家們?cè)谧⒅匾呙缪邪l(fā)的同時(shí)，開(kāi)始探索防控FMD的新策略，RNAinterference (RNAi)因快速、特異的抗病毒能力而成為新的研究熱點(diǎn)。表達(dá)針對(duì)病毒不同基因的RNAi可切斷病毒復(fù)制的源頭，進(jìn)而阻斷病毒感染及其擴(kuò)散和傳播，將打破傳統(tǒng)的通過(guò)免疫學(xué)手段預(yù)防病毒病的思維模式，為控制和消滅家畜病毒病開(kāi)辟新的途徑。RNAi是抑制病毒增殖的理想工具，其抗病毒功能在HIV(Chang等， 2005 ；Das 等；2004 ；Dave 和 Pomerantz，2004 ；Wu 等，2007)、HBV (Wu 等，2005 ；Wu 等，2007)、 埃博拉病毒(Geisbert等，2006)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Gitlin等，200 等病毒病的防控中進(jìn)行了廣泛的研究，并得到了驗(yàn)證。許多學(xué)者針對(duì)FMDV不同基因并在細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及敏感動(dòng)物豬等不同水平對(duì) RNAi抗FMDV作用進(jìn)行了探索和研究，目前的研究結(jié)果如下Liu等Q005)體外合成針對(duì)FMDV基因組5’ NCR、VP4、VPg,3D和3’ NCR保守區(qū)的siRNA可抑制同種及異種FMDV在 BHK-21細(xì)胞內(nèi)的增殖，病毒感染4 后的抑制率為10-1000倍，其特異性的抑制作用可持續(xù)6天以上；該研究以多基因交叉保護(hù)的方式抑制了 FMDV在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，為高度變異的FMDV的防控提供了新的策略。de Ios Santos等^00 構(gòu)建了針對(duì)4種血清型2B 基因保守區(qū)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染豬細(xì)胞后，可明顯抑制病毒RNA及蛋白的合成，并減少了病毒的產(chǎn)率，該shRNA抗病毒作用是其序列特異性的，并不是誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素導(dǎo)致的。 Kahana等Q004)針對(duì)FMDV所有血清型和3D基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成了 3個(gè)siRNA， 共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖被100%的抑制。Kim等Q008)在FMDV感染前，接種表達(dá)siRNA的腺病毒有效地抑制了 FMDV在豬IBRS-2細(xì)胞內(nèi)的增殖，若在FMDV感染前和感染后均使用siRNA，其抗病效果更理想。Lv等Q009)利用T7RNA聚合酶體外合成的3個(gè)siRNA可特異性地沉默VPl-EGFP融合基因在293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的siRNA可抑制FMDV在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的增殖。Pengyan等(2008)針對(duì)7個(gè)血清型的3D和2B1基因的siRNA/shRNA可減少FMDV在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)滴度；頸部皮下注射shRNA表達(dá)質(zhì)粒后，F(xiàn)MDV對(duì)乳鼠的攻擊減弱。Joyappa等Q009)將表達(dá)針對(duì)3D基因的shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，用IO2TCID5tl的FMDV攻毒，與對(duì)照組比，病毒生長(zhǎng)滴度下降3倍；用該質(zhì)粒接種豚鼠后，對(duì)IO3GPID5tl的FMDV攻毒保護(hù)率為80%。Chen等Q004)轉(zhuǎn)染針對(duì)VPl的 shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒，可使FMDV VPl在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)下降80-90%，進(jìn)而特異性地抗病毒感染，其抗病毒作用可持續(xù)48h;皮下注射該質(zhì)粒的乳鼠對(duì)FMDV的敏感性顯著下降。 Chen等Q006)利用表達(dá)針對(duì)3D基因siRNA的復(fù)制缺陷型的人5型腺病毒阻止同種和異種FMDV對(duì)豬IBRS-2細(xì)胞的感染，并顯著地降低了豚鼠及豬對(duì)FMDV感染的敏感性。Cong等 (2010a)構(gòu)建了可針對(duì)VPl基因的不同靶點(diǎn)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，在BHK-21細(xì)胞內(nèi)其對(duì)A、0 和Asia I型VPl的表達(dá)具有沉默作用，并可抑制0型和Asia I型病毒的增殖；頸部皮下注射其可明顯地降低乳鼠對(duì)0型和Asia I型病毒的敏感性。Cong等(2010b)利用BHK-21 細(xì)胞病毒感染及乳鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)，篩選出針對(duì)3D(p3D-NT56)和2B基因的抗FMDV RNAi ； 在豚鼠的攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，攜帶P3D-NT56的&ilmonella choleraesuis C500減毒疫苗株 (P3D-NT56/S. cho)對(duì)RNAi同種的FMDV的攻毒保護(hù)率為80% ；預(yù)先接種p3D_NT56/S. cho 劑量為^clO9CFU的豬，在FMDV攻毒后9天內(nèi)的保護(hù)率為100%。上述研究結(jié)果表明，RNAi 是控制高傳染性FMDV在家畜中傳播的可選擇的具有潛力的策略。轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)是比較常用的家畜轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是基因組修飾技術(shù)與動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的一種新的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作技術(shù)，它部分地克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因整合率低、大動(dòng)物生產(chǎn)成本高的技術(shù)瓶頸，代表當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作的主流方向。在該方法中，核供體細(xì)胞在核移植前要經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或重組病毒載體感染、篩選和鑒定等環(huán)節(jié)，提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的陽(yáng)性率。各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法均需先構(gòu)建目的基因的重組載體，用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因載體可分為病毒載體、質(zhì)粒載體及人工染色體等。其中Lenti-virus在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移研究中，發(fā)揮了重要作用。以人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)為代表的Lenti-virus是復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，經(jīng)改造的Lenti-virus 作為外源基因載體，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。慢病毒載體具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)(Cockrell等， 2007)，是較好的RNAi轉(zhuǎn)基因載體。Golding等Q006)利用RNAi技術(shù)針對(duì)引起牛瘋牛病和羊癢病的PRNP基因序列設(shè)計(jì)有效的siRNA，獲得1頭轉(zhuǎn)基因羊胎兒，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siRNA很好地抑制了體內(nèi)PRNP基因的表達(dá)。本發(fā)明根據(jù)Kahana 等 Q004)及 Joyappa 等 Q009)驗(yàn)證的抗 FMDV siRNA/shRNA 序列(本發(fā)明中分別為3B1、3D1和3D2)，構(gòu)建了表達(dá)抗FMDV的shRNA重組Lenti-virus載體，利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得了抗FMDV RNAi轉(zhuǎn)基因家畜。參考文獻(xiàn)1. 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發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了研究，研究表明，通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得的雜合子或純合子轉(zhuǎn)基因家畜的FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。 因此，制備抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因家畜的方法是獲得抗FMD轉(zhuǎn)基因家畜的最佳方法之一。本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜抑制FMDV在體內(nèi)的增殖，其FMDV感染率明顯下降。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于 是將攜帶shRNA堿基序列如表1及GFP報(bào)告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus 載體線性化并轉(zhuǎn)染正常家畜的胎兒成纖維細(xì)胞，利用報(bào)告基因GFP、通過(guò)流式細(xì)胞分選儀篩分轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞，將核供體細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉(zhuǎn)基因家畜。還包括以下方法雜合子轉(zhuǎn)基因公畜和雜合子轉(zhuǎn)基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉(zhuǎn)基因家畜。所述家畜為牛、羊或豬，優(yōu)選奶牛和肉牛。所述家畜胎兒成纖維細(xì)胞為35 150日齡胎兒不同組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞，包括耳成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞或卵丘細(xì)胞，優(yōu)選皮膚成纖維細(xì)胞。所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報(bào)告基因的重組Lenti-virus載體轉(zhuǎn)染家畜胎兒成纖維細(xì)胞方法為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法，優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于lyg/yL，DNA 脂質(zhì)體 LTX =1:3。所述將抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞的方法為顯微注射法。所述去核卵母細(xì)胞不帶有第一極體。本發(fā)明利用RNAi技術(shù)和體細(xì)胞克隆的方法將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi 及報(bào)告基因的重組Lenti-virus載體轉(zhuǎn)染家畜胎兒成纖維細(xì)胞，獲得抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞，將其細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉(zhuǎn)基因家畜。經(jīng)雜合子轉(zhuǎn)基因公畜和雜合子轉(zhuǎn)基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉(zhuǎn)基因家畜。用本方法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜可表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。 本發(fā)明打破了傳統(tǒng)的通過(guò)免疫學(xué)手段預(yù)防FMD的思維模式，為控制和消滅家畜FMD開(kāi)辟了新的途徑，具有較高的實(shí)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為體細(xì)胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因家畜的生產(chǎn)流程圖。圖 2Lenti-virus Hl 載體酶切結(jié)果，其中，M :DL marker 10，000 ；1 =SmaI 和 AgeI 雙酶切Hl載體；2 =XbaI和AgeI雙酶切Hl載體。圖3RNAi重組Hl載體的PCR鑒定結(jié)果，其中，M =DL marker 2，000 ；1 陽(yáng)性對(duì)照； 2 空載體陰性對(duì)照；3 :RNAi-3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 :RNAi_3D2#l ；6 :RNAi-3D2#20圖4抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒的PCR鑒定結(jié)果，其中，M :DL marker 2，000 ；1和2 轉(zhuǎn)基因胎兒，3 非轉(zhuǎn)基因奶牛胎兒對(duì)照。圖5為抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因奶牛的Southern雜交鑒定結(jié)果，其中，1.普通荷斯坦奶牛，2為轉(zhuǎn)基因奶牛。圖6反向PCR方法擴(kuò)增RNAi插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，在第一次PCR基礎(chǔ)上，做槽式 PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中，M.DNA Marker ；1.為轉(zhuǎn)基因奶牛1 ；2 為轉(zhuǎn)基因奶牛2。圖7為接種病毒后奶牛出現(xiàn)臨床體癥時(shí)間的比較結(jié)果，接種病毒的正常奶牛組奶牛全部發(fā)病(3/3)，抗病個(gè)體率為0，而接種病毒的轉(zhuǎn)基因奶牛組中抗病毒感染的奶牛(抗 FMD奶牛)1頭，發(fā)病奶牛2頭(2/3)，抗病個(gè)體率33. 3% ；接種病毒后，與正常奶牛發(fā)病時(shí)間(平均為2. 05天)比較，發(fā)病的轉(zhuǎn)基因奶牛出現(xiàn)臨床體癥時(shí)間(平均為4. 85天)明顯的滯后。其中，1.正常荷斯坦奶牛，2為轉(zhuǎn)基因奶牛。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。下述實(shí)施例中無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用試劑及藥品如無(wú)特別說(shuō)明均購(gòu)自 Sigma公司。
實(shí)施例1 體細(xì)胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)及分子生物學(xué)檢測(cè)體細(xì)胞克隆抗口蹄疫病毒RNAi雜合子轉(zhuǎn)基因奶牛的生產(chǎn)流程如圖1所示，具體過(guò)程包括如下步驟1. shRNA重組Hl表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將化學(xué)合成的RNAiIBll 和 RNAi_3B12、RNAi_3Dll 和 RNAi_3D12、RNAi_3D21 和 RNAi-3D22 (見(jiàn)表1)分別退火后，與經(jīng)XbaI和AgeI雙酶切的Hl Lenti-virus載體所獲得的12. 5kb以及經(jīng)SmaI和AgeI雙酶切Hl載體所獲得的1. 5kb片段(圖2)按照如下體系連接12. 51Λ 載體片段，IOOng ；1. 51Λ 載體片段，50ng ；shRNA oligo，50ng ；T4DNA 連接酶， 0. 5 μ L ； 10 X T4DNA連接酶buffer，2 μ L，補(bǔ)足H2O使體系至20 μ L，16°C過(guò)夜連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci株感受態(tài)細(xì)胞，挑選克隆，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)獲得了相應(yīng)的shRNA重組Hl載體，用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的方法是以小提質(zhì)粒為模板，以已知重組陽(yáng)性質(zhì)粒及空載體為對(duì)照，在引物L(fēng)T-Pl 5’ -TGTCGCTATGTGTTCTGGGA-3’和引物L(fēng)T-P2:5’ -GGTACAGTGCAGGGGAAAGA-3’的引導(dǎo)下，反應(yīng)條件如下94°C30s ；94°C 20s 57°C 20s 68°C 30s，;35 個(gè)循環(huán)；68°C 3min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，重組shRNA的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果為300bp片段，空載體的擴(kuò)增結(jié)果為250bp片段。結(jié)果如圖3所示，其中，M =DL marker2, 000 ；1 陽(yáng)性對(duì)照；2 空載體陰性對(duì)照；3 :RNAi_3Bl ；4 :RNAi_3Dl ；5 RNAi-3D2#l ；6 :RNAi_3D2#2。表1沉默F(xiàn)MDV 及3D基因的shRNA序列
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于是將攜帶shRNA堿基序列及GFP報(bào)告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus載體線性化并轉(zhuǎn)染正常家畜的胎兒成纖維細(xì)胞，利用報(bào)告基因GFP、通過(guò)流式細(xì)胞分選儀篩分轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞，將核供體細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉(zhuǎn)基因家畜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于，還包括以下方法雜合子轉(zhuǎn)基因公畜和雜合子轉(zhuǎn)基因母畜正常交配或人工授精繁殖而獲得純合子轉(zhuǎn)基因家畜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述家畜為牛、羊或豬。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述家畜為奶牛或肉牛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述家畜胎兒成纖維細(xì)胞為35 150日齡胎兒不同組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述家畜胎兒成纖維細(xì)胞為耳成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞或卵丘細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報(bào)告基因的重組 Lenti-virus載體轉(zhuǎn)染家畜胎兒成纖維細(xì)胞方法為電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有抗口蹄疫病毒RNAi及報(bào)告基因的重組 Lenti-virus載體轉(zhuǎn)染家畜胎兒成纖維細(xì)胞方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的條件為 線性化的載體DNA濃度不低于1 μ g/ μ L，DNA 脂質(zhì)體LTX = 1 3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述將抗口蹄疫病毒RNAi轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞的方法為顯微注射法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其特征在于所述去核卵母細(xì)胞不帶有第一極體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi獲得抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因家畜的方法是將攜帶shRNA堿基序列及GFP報(bào)告基因的抗口蹄疫病毒RNAi重組Lenti-virus載體線性化并轉(zhuǎn)染正常家畜的胎兒成纖維細(xì)胞，利用報(bào)告基因GFP、通過(guò)流式細(xì)胞分選儀篩分轉(zhuǎn)基因核供體細(xì)胞，將核供體細(xì)胞核導(dǎo)入家畜的去核卵母細(xì)胞中得到重構(gòu)胚，再將重構(gòu)胚移入代孕家畜子宮中，得到的子代即為抗口蹄疫病毒RNAi的雜合子轉(zhuǎn)基因家畜。雜合子轉(zhuǎn)基因公畜和雜合子轉(zhuǎn)基因母畜正常交配或人工授精繁殖即獲得純合子轉(zhuǎn)基因家畜。用本方法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜可表達(dá)抗口蹄疫病毒RNAi，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102559762SQ20111034977
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者仲躋峰, 何洪彬, 侯明海, 劉曉, 宋玲玲, 楊宏軍, 武剛, 武建明, 王洪梅, 高運(yùn)東 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心