專利名稱：能抑制口蹄疫病毒的shRNA轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)的抗口蹄疫病毒質(zhì)粒載體，并用于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因抗病育種。
背景技術(shù)：
家畜口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將口蹄疫列為A類傳染病之首。多年來(lái)，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)免疫原性，口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)有 A、0、C、SAT I、SAT II、 SAT III及Asia I等共7個(gè)血清型?？谔阋卟《靖餍椭g無(wú)交叉免疫反應(yīng)，一種類型的疫苗不能保護(hù)家畜免受另一種類型病毒的感染，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多地區(qū)會(huì)有一個(gè)以上病毒流行。如果用一個(gè)型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。為了克服這種免疫的局限性，研究具有廣譜抗口蹄疫病毒作用的制劑有重要的實(shí)踐意義。另外，由于FMDV的具有快速傳染性和強(qiáng)致病性的特點(diǎn)，給使用傳統(tǒng)的疫苗快速控制口蹄疫的流行帶來(lái)了障礙。RNAi技術(shù)是科學(xué)研究領(lǐng)域近年來(lái)取得的重大成就之一，它最大的優(yōu)點(diǎn)在于具有高度的有效性和特異性并且具有快速的防御與治療效果。它的作用在基因功能研究領(lǐng)域和各種疾病的治療領(lǐng)域尤其是病毒性疾病的治療領(lǐng)域已顯現(xiàn)出不可估量的價(jià)值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白質(zhì)炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發(fā)現(xiàn)，RNA干擾對(duì)于抑制這些病毒的復(fù)制具有較好的效果，可能為這類病毒病的治療創(chuàng)立新的、更有效的途徑。但是在自然界中，各種病毒都會(huì)存在不同突變株，口蹄疫病毒就有七種血清型和很多的變異株，這給口蹄疫病毒病的防治工作帶來(lái)了巨大的困難。另一方面，RNAi有效作用時(shí)間較短的特點(diǎn)也給其使用帶來(lái)一定的問(wèn)題。在目前已有的科研報(bào)道中，RNAi必須在實(shí)際病毒感染前1-2天內(nèi)接種動(dòng)物才能獲得較為理想的抗病毒效果。此外，siRNA/shRNA能否到達(dá)口蹄疫病毒在動(dòng)物體內(nèi)感染與復(fù)制的部位就成為RNAi是否能夠高效的干擾靶基因進(jìn)而抑制病毒的重要問(wèn)題。所以本發(fā)明選取了 FMDV基因組中高度保守的區(qū)段作為靶序列，構(gòu)建能同時(shí)表達(dá)兩種shRNA的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體。再用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞或小鼠，使可傳代細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因傳代動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV感染能力。本發(fā)明為RNAi技術(shù)用于豬、牛、羊等家畜的抗病育種，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技術(shù)路線。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能高效的抗口蹄疫病毒重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒能通過(guò)不同的方法抑制同一型中不同毒株或者不同型的口蹄疫病毒在動(dòng)物細(xì)胞和個(gè)體中的復(fù)制與感染。本發(fā)明的另一目的是提供該抗口蹄疫病毒重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提出的抗口蹄疫病毒重組質(zhì)粒，記為PB-EN3D2B，該質(zhì)粒含有兩個(gè)shRNA表達(dá)基因，能同時(shí)編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3D RNA聚合酶和2B非結(jié)構(gòu)蛋白保守區(qū)域的特異shRNA ;其中，所述兩個(gè)shRNA表達(dá)基因中一個(gè)能表達(dá)抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中3D基因；所述兩個(gè)shRNA表達(dá)基因中一個(gè)能表達(dá)抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中2B基因；兩個(gè)shRNA表達(dá)基因呈串聯(lián)狀態(tài)。本發(fā)明提供的的抗口蹄疫病毒重組質(zhì)粒，其中，在兩個(gè)shRNA表達(dá)基因之間還可插入如報(bào)告基因之類的其他基因，得到具有同樣抗口蹄疫病毒功能的衍生重組質(zhì)粒。本發(fā)明中，所選擇的保守區(qū)基因3D和2B來(lái)自任何一型的口蹄疫病毒，如0型、A型、亞洲I型等。本發(fā)明提供的PB-EN3D2B，其表達(dá)的shRNA序列是以各個(gè)血清型、各個(gè)亞型、不同毒株的基因組序列為基準(zhǔn)，選取FMDV中特異的3D和2B基因?yàn)楦蓴_靶點(diǎn)設(shè)計(jì)得到的。將該重組質(zhì)粒通過(guò)PB轉(zhuǎn)座子或者直接轉(zhuǎn)染的辦法整合入組織培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物的基因組，獲得單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家系。特定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物家系可以有 效地抵抗不同型FMDV的復(fù)制與感染，如抵抗0型、A型、亞洲I型等復(fù)制與感染。本發(fā)明提出的重組質(zhì)粒中，其表達(dá)的ShRNA干擾靶點(diǎn)分別為FMDV的3D和2B基因的保守區(qū)域(如圖1)，設(shè)計(jì)時(shí)的參考序列是口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株(GenBank登錄號(hào) AY317098)，口蹄疫病毒 Asia I 型 Jiangsu 毒株(GenBank 登錄號(hào) EF149009)。靶向 3D的shRNA長(zhǎng)56 nt，對(duì)應(yīng)口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因的1225-1280位堿基，其正義鏈序列為SEQ. ID. NOl。靶向2B的shRNA長(zhǎng)25 nt，對(duì)應(yīng)口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株2AB基因的57-81位堿基，其正義鏈序列為SEQ. ID. N02。3D基因編碼FMDV的RNA依賴性RNA聚合酶POL，F(xiàn)MDV基因組本身的復(fù)制必須由該聚合酶啟動(dòng)。2B基因其生物學(xué)功能尚未被完全闡明，但有證據(jù)證明，該蛋白與FMDV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的大融合蛋白的剪切，以及病毒粒子的裝配密切相關(guān)。選用3D和2B基因作為shRNA干擾靶點(diǎn)的另一出發(fā)點(diǎn)是，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析和實(shí)際測(cè)試毒株序列發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的3D和2B基因在不同型和不同毒株中具有很高的序列保守性，而RNAi的干擾效應(yīng)主要取決于其與靶基因序列上的匹配程度。因此，以這兩個(gè)基因?yàn)橐罁?jù)設(shè)計(jì)的shRNA具有對(duì)不同毒株交叉抑制的潛力。本發(fā)明中，靶向3D和2B基因的shRNA序列因不同型口蹄疫病毒或同型中不同毒株的結(jié)構(gòu)特征，可以根據(jù)病毒基因中靶點(diǎn)序列，前后浮動(dòng)適當(dāng)個(gè)數(shù)(一般為6個(gè)以內(nèi))的核苷酸殘基，而不影響shRNA對(duì)病毒的抑制效應(yīng)。同時(shí),設(shè)計(jì)shRNA的序列也可根據(jù)不同型口蹄疫病毒或某型中不同毒株的基因變異做相應(yīng)的改變，這樣可以保證shRNA對(duì)病毒株有最高效的抑制效果。上述所選定的靶序列中任何連續(xù)的19 - 2Ibp長(zhǎng)度的RNA序列都可制備為siRNA或shRNA，均有干擾FMDV復(fù)制和感染的效果。本發(fā)明采取了把兩個(gè)干擾shRNA基因串聯(lián)構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒載體上的策略(如圖2)，當(dāng)一個(gè)shRNA失效時(shí)，另一個(gè)shRNA可以起到補(bǔ)償作用。從理論上說(shuō)，靶向3D和2B這兩個(gè)在FMDV復(fù)制周期中起重要作用的雙shRNA將誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)、更廣譜的抑制FMDV復(fù)制的作用。本發(fā)明提出的兩種shRNA分別由RNA聚合酶III類啟動(dòng)子(pol III)小鼠U6啟動(dòng)子和人類Hl啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。前者為核糖體RNA啟動(dòng)子，后者為組蛋白R(shí)NA啟動(dòng)子，兩者均具有精確的堿基啟動(dòng)位點(diǎn)和終止信號(hào)，可以保證shRNA最高效地被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，在真核細(xì)胞中調(diào)控這兩類啟動(dòng)子的DNA依賴性RNA聚合酶含量巨大，可以保證shRNA最大量地被轉(zhuǎn)錄。這兩種啟動(dòng)子也可以根據(jù)需要更換為其他高效的啟動(dòng)子，如7SK和CMV等,而不影響其表達(dá)。本發(fā)明提出的重組質(zhì)粒中PB-EN3D2B中，還可含有EGFP與新霉素抗性(Neo-R)兩個(gè)報(bào)告基因，這兩個(gè)報(bào)告基因外端還分別克隆了一個(gè)IoxP位點(diǎn)(如圖2)。該質(zhì)粒既可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞使其獲得抑制口蹄疫病毒感染的能力，也可以借助PB轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入細(xì)胞基因組構(gòu)建抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和動(dòng)物。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的組合進(jìn)行調(diào)整，可衍生出類似的抗口蹄疫重組質(zhì)粒，記為PB-N3D2B，(如圖3)。通過(guò)Ascl/Hindlll酶切還可以將含有兩種shRNA表達(dá)元件和報(bào)告基因的片段整個(gè)切離，方便地裝載入其他載體，以適應(yīng)不同的短效(如腺病毒載體)和長(zhǎng)效(如轉(zhuǎn)基因)的傳遞方式。本發(fā)明選取了 FMDV基因組中高度保守的區(qū)段作為靶序列，構(gòu)建能同時(shí)表達(dá)兩種shRNA的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體。再用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，或小鼠或豬、牛、羊偶蹄類 哺乳動(dòng)物，使可傳代細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因傳代動(dòng)物產(chǎn)生抗FMDV感染能力。具體說(shuō)來(lái)，
本發(fā)明的重組質(zhì)粒可轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，使該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系抵抗FMDV感染。本發(fā)明的重組質(zhì)?？赊D(zhuǎn)入小鼠或豬、牛、羊偶蹄類哺乳動(dòng)物，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。本發(fā)明為RNAi技術(shù)用于豬、牛、羊等家畜的抗病育種，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技術(shù)路線。具體實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的重組質(zhì)粒適用于多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。當(dāng)使用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的豬細(xì)胞IBRS-2后，經(jīng)攻毒實(shí)驗(yàn)證明，篩選得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有抵抗20-50 TCID50劑量0型或亞洲I型FMDV毒株感染的能力。當(dāng)將該質(zhì)粒通過(guò)顯微注射導(dǎo)入小鼠受精卵后，篩選得到的轉(zhuǎn)基因小鼠家系使用3-6 LD50 0型FMDV毒株感染時(shí)，相對(duì)同窩小鼠對(duì)照明顯提高了存活率。


圖I為口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)。箭頭所指為2B與3D基因shRNA靶點(diǎn)。圖2為PB-EN3D2B質(zhì)粒雙串聯(lián)shRNA基因和報(bào)告基因排列圖示。3D shRNA基因和2B shRNA基因在質(zhì)粒上呈串聯(lián)排列，兩個(gè)shRNA基因中間是兩個(gè)報(bào)告基因EGFP和Neo_R。圖3 為 PB-EN3D2B (A)與其衍生質(zhì)粒 PB-N3D2B (B)。圖4為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系20 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測(cè)。圖5為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系50 TCID50 0型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測(cè)。圖6為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒攻毒上清病毒滴度檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 將質(zhì)粒PB-EN3D2B與表達(dá)PB轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒CMV-PBase按I: I的質(zhì)量比共同轉(zhuǎn)染豬細(xì)胞IBRS-2，篩選單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，命名為IB32。篩選得到的細(xì)胞系進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，攻毒劑量分別為20 TCID50 0型口蹄疫病毒，50 TCID50 0型口蹄疫病毒和20 TCID50 Asia I型口蹄疫病毒。攻毒結(jié)果表明，IB32-6細(xì)胞系在三次攻毒實(shí)驗(yàn)中均未發(fā)生任何病變，細(xì)胞上清液中也檢測(cè)不到任何病毒滴度。IB32-2和IB32-3兩株轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也體現(xiàn)了顯著的抗病毒效果，24小時(shí)幾乎檢測(cè)不到病變，48小時(shí)的病變狀況也比同時(shí)期的對(duì)照細(xì)胞要輕微。這證明由TO-EN3D2B得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有抵抗20-50 TCID5tl、兩型口蹄疫病毒的能力。攻毒實(shí)驗(yàn)上清病毒滴度檢測(cè)見(jiàn)圖4、5、6。實(shí)施例2 PB-EN3D2B的衍生質(zhì)粒，PB-N3D2B，其Ascl/Hindlll酶切片段回收后通過(guò)顯微注射的方式導(dǎo)入小鼠基因組，培育轉(zhuǎn)基因小鼠家系。單倍體轉(zhuǎn)基因雄鼠與普通母鼠交配，所生具有約50%轉(zhuǎn)基因比例的后代用于攻毒實(shí)驗(yàn)。分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因乳鼠與非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照的存活率。見(jiàn)表I :
權(quán)利要求
1.一種能抑制口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒含有兩個(gè)shRNA表達(dá)基因，能同時(shí)編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3D RNA聚合酶和2B非結(jié)構(gòu)蛋白保守區(qū)域的特異shRNA ;其中，所述兩個(gè)shRNA表達(dá)基因中一個(gè)能表達(dá)抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中3D基因；所述兩個(gè)shRNA表達(dá)基因中一個(gè)能表達(dá)抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中2B基因；兩個(gè)shRNA表達(dá)基因呈串聯(lián)狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒，其特征在于，在所述兩個(gè)shRNA表達(dá)基因之間插入有報(bào)告基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能抑制口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒，其特征在于，所述報(bào)告基因?yàn)镋GFP與新霉素抗性(Neo-R)，這兩個(gè)報(bào)告基因外端分別克隆了一個(gè)IoxP位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的能抑制口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒，其特征在于，所選擇的保守區(qū)基因3D和2B來(lái)自任何一型的口蹄疫病毒，包括0型、A型、亞洲I型。
5.如權(quán)利要求I或2所述的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于將權(quán)利要求I或2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，使該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系抵抗FMDV感染。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于將如權(quán)利要求I或2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠或豬、牛、羊偶蹄類哺乳動(dòng)物，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代抵抗FMDV感染，提高抗病能力。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能抑制口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。該質(zhì)粒含有兩個(gè)shRNA表達(dá)基因，能同時(shí)編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3DRNA聚合酶和2B非結(jié)構(gòu)蛋白保守區(qū)域的特異shRNA；兩個(gè)shRNA表達(dá)基因呈串聯(lián)狀態(tài)。該質(zhì)粒適用于多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。當(dāng)使用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的豬細(xì)胞IBRS-2后，經(jīng)攻毒實(shí)驗(yàn)證明，篩選得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有抵抗20-50TCID50劑量O型或亞洲Ⅰ型FMDV毒株感染的能力。當(dāng)將該質(zhì)粒通過(guò)顯微注射導(dǎo)入小鼠受精卵后，篩選得到的轉(zhuǎn)基因小鼠家系使用3-6LD50O型FMDV毒株感染時(shí)，相對(duì)同窩小鼠對(duì)照明顯提高了存活率。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102703504SQ20121022335
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者嚴(yán)維耀, 劉明秋, 曾溢滔, 焦曄, 鄭兆鑫 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)