專利名稱：一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體涉及一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法。同時還涉及一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的用途，具體地說，本發(fā)明涉及蘇云金芽胞桿菌中群體感應信號分子降解蛋白編碼基因aiiA通過農桿菌轉化煙草，獲得廣譜抗植物病毒的轉基因煙草，對不同種類的重要的植物病毒如煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒等都有較好的抗病毒效果。本發(fā)明的技術方法將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。
背景技術：
自然界中，很多植物都會受到病毒侵染而引起病毒病。植物病毒雖是嚴格的細胞內寄生物，但?；圆⒉粡?，往往一種病毒可寄生在不同種、屬甚至不同科的植物上，常常發(fā)生復合侵染。幾乎每種農作物和經濟作物都受到幾種甚至十幾種病毒的危害而減產或絕產。植物病毒病是一種全球性的病害，每年全世界由植物病毒病造成的農作物損失難以計數(shù)。我國是個農業(yè)大國，隨著生態(tài)條件的改變和植物種質資源的引進，病毒種類有逐漸增多，危害逐漸加重的趨勢。病毒在植物細胞內絕對寄生，其復制所需的能量、物質、場所完全由寄主細胞提供，加之植物沒有完整的免疫代謝系統(tǒng)，這使得植物病毒病的防治非常困難。對于植物病毒病害的防治大多使用的是綜合措施，但這些傳統(tǒng)的方法都存在局限性。如對于一些蟲傳病毒可用農藥來殺死傳染病毒的昆蟲，但這種方法所用化學農藥易造成環(huán)境污染，而且對病毒感染植物后的病害藥效不顯著。對于適用于無性繁殖的農作物可以組織脫毒法獲得無病毒病的種植材料，但缺點是成本高、工作量大，特別是由于田間的再侵染，維持無毒的有效期不長。近年來植物抗病毒基因工程的誕生為人們防治病毒病帶來了希望。2000年Dong等從一株芽胞桿菌菌株MOB 1中克隆到了編碼降解群體感應 (Quorum sensing)信號分子 N-酉先基高絲氨酸內酉旨(N-acyl—homoserine lactones, AHLs) 的蛋白基因aiiA。之后用根癌農桿菌法把該基因轉化煙草、馬鈴薯后，增強了馬鈴薯、煙草對大白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora SCG1)的抗性。此外還發(fā)現(xiàn)AiiA蛋白不僅能提高轉基因植物對病原細菌的抗病能力，還可以提高動物的免疫力。但關于該基因在抗植物病毒方面的功能還沒有相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，方法易行，操作簡便，增強對不同植物病毒的廣譜抗性，獲得的轉基因植物可以增強對不同植物病毒的抗性，將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用，該發(fā)明的主要優(yōu)點是對重要的植物病毒都有廣譜的抗病效果，可以應用于主要作物的轉基因抗病毒。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，其步驟是a.轉化載體的構建將蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，本單位袁志明研究員惠贈，請見遺傳資源表)的aiiA基因用限制性內切酶酶切后連接到植物雙元轉化載體pA8上(購自CAMBIA公司的pCAMBIA 1305. 1載體，簡稱為pA8載體，請見遺傳資源表)，通過凍融法將連接好的植物雙元轉化載體pA8-aiiA轉入農桿菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(美國普渡大學S. Gelvin教授惠贈，請見遺傳資源表)中。b.植物遺傳轉化通過葉盤轉化方法(參考Horsch et al. , 1985)分別轉化珊硒煙草(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)和本生煙草(N. benthamiana)，在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基(MS+1. Omg/ L BA+0. lmg/L NAA+30mg/L Hygromycin+lOOmg/LTimentin)上篩選獲得轉化苗，通過生根培養(yǎng)基(MS+0. lmg/LNAA+30mg/LHygromycin+100mg/L Timentin)獲得完整的再生植物，包括轉化空載體的PA8再生植物以及轉化pA8-aiiA的再生植物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因通過農桿菌轉入煙草中表達，可獲得廣譜抗植物病毒的轉基因煙草。一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用，其應用過程如下當再生煙草植株長有4-5片葉時，選擇PCR和RT-PCR檢測都呈陽性的大小一致的轉基因植株的葉片作為材料。通過摩擦接種的方法接種不同植物病毒，觀察接種部位的過敏反應病斑大小以及熒光面積大小和強弱，比較發(fā)病情況。本發(fā)明涉及的轉基因植物可表現(xiàn)出對植物病毒的廣譜抗性?？赡軐Σ煌≡w (病毒、細菌、真菌等)具有廣譜抗性，將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果植物病毒的防治目前沒有有效的方法，現(xiàn)有技術只是針對某一種植物病毒而進行的，往往只是起到一定的預防效果，發(fā)生植物病毒感染后則很難控制?，F(xiàn)有轉基因技術也只是針對某一種特定的植物病毒。本發(fā)明獲得的轉基因植物具有廣譜抗植物病毒的效果，對目前嚴重危害作物的主要病毒都表現(xiàn)出較理想的抗病效果。


圖1為轉aiiA基因煙草的PCR和RT-PCR檢測結果圖。對獲得的再生煙草植株進行PCR和RT-PCR檢測，上排為PCR檢測結果，下排為 RT-PCR檢測結果，M為DNA分子量標記，1-8為獲得的不同再生株系，-為陰性對照。圖2為轉aiiA基因煙草對煙草花葉病毒TMV的抗性結果圖。檢測轉基因煙草對TMV病毒的抗性，A圖為轉化空載體對照的pA8珊硒煙草，B圖為轉化pA8-aiiA的珊硒煙草。轉化pA8-aiiA基因的煙草形成的過敏反應病斑比轉化空載體對照的PA8煙草要小且少些。C圖為轉化空載體對照的pA8本生煙草，D為轉化pA8-aiiA 的本生煙草。E圖為在紫外光燈下檢測GFP標記的TMV，其中上面是轉化pA8-aiiA的本生煙草，下為轉化空載體對照的pA8本生煙草。轉基因本生煙草GFP熒光強度明顯低于轉化空載體對照。
圖3為轉aiiA基因煙草對馬鈴薯X病毒PVX的抗性結果圖。檢測轉基因煙草對PVX病毒的抗性，A圖為轉化空載體對照的pA8煙草，B圖為轉化pA8-aiiA的煙草。轉化pA8-aiiA基因的煙草形成的紋狀過敏反應病斑比轉化空載體對照的PA8煙草要細且弱些。圖4為轉aiiA基因煙草對馬鈴薯Y病毒PVY的抗性結果圖。檢測轉基因煙草對PVY病毒的抗性，A圖為轉化空載體對照的pA8煙草葉片，B圖為轉化pA8-aiiA的煙草葉片。轉化pA8-aiiA基因的煙草形成的過敏反應病斑比轉化空載體對照的PA8煙草藥弱且少些。圖5為轉aiiA基因煙草對PPV病毒的抗性結果圖。檢測轉基因本生煙草PPV病毒的抗性。A圖為轉化pA8的本生煙草，B圖為轉化 pA8-aiiA的本生煙草，C為在紫外光燈下檢測GFP標記的PPV。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，其步驟是.轉化載體的構建與植物轉化轉化載體的構建(.轉化載體的構建與植物轉化)根據(jù)蘇云金芽孢桿菌 (B.thuringiensis，本單位袁志明研究員惠贈，請見遺傳資源表)的aiiA基因序列設計引物，在引物的5’端分別加上Bgl II和BstE II酶切位點和保護堿基，提取蘇云金芽孢桿菌 (本實驗室自行分離獲得)的總DNA，通過PCR技術克隆出aiiA基因(Wang等，Science in China Series C =Life Sciences, 2007, 50 (3) :385-39)，雙酶切后連接到用 Bgl II 和 BstE II雙酶切后的表達載體pA8 (購自CAMBIA公司的pCAMBIA 1305. 1載體，簡稱為pA8載體) 上，命名為pA8-aiiA質粒。將空載體pA8和構建好的pA8K_aiiA質粒分別通過凍融法轉入農桿菌(A. tumefaciens)菌株EHA105 (本實驗室保存，美國普渡大學S. Gelvin教授惠贈， 請見遺傳資源表)中。B、植物轉化將上述的轉化農桿菌(A. tumefaciens EHA105)分別過夜培養(yǎng)，離心，菌體用液體 MS1/10培養(yǎng)基懸浮。將珊硒煙草(N. tabacum cv. Xanthi)和本生煙草(N. benthamiana) 煙草葉片切成0. 5cmX0. 5cm的小塊，一部分放入帶有pA8質粒菌液中浸泡15分鐘，一部分放入帶有pA8-aiiA質粒的菌液中浸泡15分鐘，一部分放入液體MS培養(yǎng)基浸泡15分鐘，用濾紙吸干多余的菌液或液體后，放在MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)三天，然后轉到篩選培養(yǎng)基 (MS+1. Omg/L BA+0. lmg/L NAA+30mg/L Hygromycin+100mg/L Timentin)上，同時，把用液體MS培養(yǎng)基浸泡的葉片一部分轉到正常培養(yǎng)基(MS+1. Omg/L BA+0. lmg/L NAA)上，一部分轉移到篩選培養(yǎng)基上作為轉化葉片的對照，26°C、Wh光照培養(yǎng)進行初步篩選，每兩周更換一次培養(yǎng)基。再生的小苗轉至生根培養(yǎng)基(MS+0. lmg/LNAA+30mg/L Hygromycin+100mg/L Timentin)生根。結果表明轉化后的葉盤在選擇培養(yǎng)基上生長3_4周后會形成愈傷組織并分化出芽，直接分化出的芽轉入生根培養(yǎng)基可以生根并繼續(xù)生長，形成再生植株。
實施例2 —種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用，其應用過程如下轉化煙草對不同植物病毒的抗性當再生煙草植株長有4-5片葉時，選擇PCR和RT-PCR檢測都呈陽性(圖1)的大小一致的轉基因植株作為供試植株。將不同植物病毒毒原加入適量緩沖液(K2HPO4 lg/100mL, Na2SO3 0. lg/100mL)和適量石英砂一起研磨成勻漿，用毛筆蘸取病毒汁液通過摩擦接種的方法在植株葉表面接種不同植物病毒，包括煙草花葉病毒(TMV)，馬鈴薯X和Y病毒(PVX和 PVY)，GFP 標記的 TMV 病毒(簡稱 GFP-TMV)和 Plum pox potyvirus 病毒(簡稱 GFP-PPV) (其中TMV，PVX，PVY病毒由申請人所在單位-中國科學院武漢病毒研究所普通病毒保藏中心提供，GFP-TMV和GFP-PPV由中國科學院微生物研究所郭惠珊研究員惠贈，請見遺傳資源表)。接種后用清水洗去接種葉片上的殘留汁液，將接種后的煙草放在溫室中培養(yǎng)，7-14天內觀察接種部位的形成的過敏反應病斑大小強弱以及熒光面積差異，比較感病情況。下面結合不同病毒對轉化煙草對不同植物病毒的抗性檢測進行說明1.轉化煙草對煙草花葉病毒的抗病毒效果。將上述轉化的珊硒煙草和本生煙草獲得的種子發(fā)芽，栽種在滅菌后的沙中。當轉化煙草植株長至4-5片葉時，通過PCR和RT-PCR檢測，確證轉化獲得成功(圖1)。選擇大小一致的轉基因植株作為供試植株用于抗植物病毒效果。將煙草花葉病毒加入適量緩沖液 (K2HP04lg/100mL, Na2SO3O. lg/100mL)和適量石英砂一起研磨成勻漿，用毛筆蘸取病毒汁液通過摩擦接種的方法在植株葉表面接種煙草花葉病毒(TMV)，以及GFP標記的TMV病毒。接種后用清水洗去接種葉片上的殘留汁液，將接種后的煙草放在溫室中培養(yǎng)，7-14天內觀察接種部位的形成的過敏反應病斑大小強弱以及熒光面積差異，比較抗病毒效果，結果見圖 2。從圖中可以看出轉化pA8-aiiA基因的珊硒煙草比轉化空載體對照的pA8煙草對煙草花葉病毒的抗性明顯要強，病斑小且少，感病癥狀要輕得多。轉化pA8-aiiA基因的本生煙草比轉化空載體對照的pA8本生煙草對TMV病毒的抗性也明顯要強，形成的綠色熒光的面積要少得多。2.轉化煙草對馬鈴薯X病毒的抗病毒效果。采用上述同樣的方法檢測轉化的珊硒煙草對馬鈴薯X的抗病毒效果，結果見圖3。 轉化pA8-aiiA基因的煙草形成的紋狀過敏反應病斑比轉化空載體對照的pA8煙草要細且弱些。3.轉化煙草對馬鈴薯Y病毒的抗病毒效果。采用上述同樣的方法檢測轉化的珊硒煙草對馬鈴薯Y的抗病毒效果，結果見圖4。 轉化pA8-aiiA基因的煙草形成的過敏反應病斑比轉化空載體對照的pA8煙草弱且少。4.轉化煙草對Plum pox potyvirus (PPV)病毒的抗病毒效果。采用上述同樣的方法檢測轉化pA8-aiiA基因的本生煙草對GFP-PPV的抗病毒效果，結果見圖5。轉化pA8-aiiA基因的本生煙草比轉化空載體對照的pA8本生煙草對PPV 病毒的抗性明顯要強，形成的綠色熒光的面積要少得多。
權利要求
1.一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，其步驟是a.轉化載體的構建將蘇云金芽孢桿菌的ai以基因用限制性內切酶酶切后連接到植物雙元轉化載體pA8 上，通過凍融法將連接好的植物雙元轉化載體pA8-ai以轉入農桿菌菌株EHA105中；b.植物遺傳轉化通過葉盤轉化方法分別轉化珊硒煙草和本生煙草，在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選獲得轉化苗，通過生根培養(yǎng)基MS獲得完整的再生植物，包括轉化空載體的pA8再生植物以及轉化m-aiiA的再生植物；所述的 MS 培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg/L BA + 0. 1 mg/L NAA + 30 mg/L Hygromycin + 100 mg/L Timentin ；所述的生根培養(yǎng)基為 MS + 0.1 mg/L NAA + 30 mg/L Hygromycin + 100 mg/L Timentin0
2.權利要求1所述的一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法及應用，其步驟是a.轉化載體的構建將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因用限制性內切酶酶切后連接到植物雙元轉化載體pA8上，通過凍融法將連接好的植物雙元轉化載體pA8-aiiA轉入農桿菌菌株EHA105中；b.植物遺傳轉化通過葉盤轉化方法分別轉化珊硒煙草和本生煙草，在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選獲得轉化苗，通過生根培養(yǎng)基獲得完整的再生植物，包括轉化空載體的pA8再生植物以及轉化pA8-aiiA的再生植物。方法易行，操作簡便，增強對不同植物病毒的廣譜抗性，將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。
文檔編號C12N15/31GK102492719SQ20111040259
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權日2011年12月7日
發(fā)明者張勇, 楊寶玉, 陳士云 申請人:中國科學院武漢病毒研究所