專利名稱：：一種同時液化糖化玉米淀粉的方法
技術領域：
：本項發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品加工
技術領域：
。本項發(fā)明涉及一種將玉米淀粉同時進行液化和糖化的方法，尤其是指:將玉米淀粉與水混合，高溫預熱以后，同時加入液化酶和糖化酶，再繼續(xù)在相同的高溫條件下保溫一段時間，最終將玉米淀粉完全酶解轉化為單糖和雙糖的方法。
背景技術：
：玉米淀粉糖(例如:葡萄糖和麥芽低聚糖等)是醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工等行業(yè)的重要原料。玉米淀粉糖的生產(chǎn)通常使用一種包括液化和糖化操作的二步法生產(chǎn)工藝；即:先后采用淀粉液化酶和淀粉糖化酶，對玉米淀粉進行液化、再進行糖化，而生產(chǎn)葡萄糖和麥芽低聚糖的工藝。淀粉液化酶和淀粉糖化酶是二種對淀粉作用方式不同的淀粉酶。目前，商品化的液化酶為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶，其最適催化條件為90°C、pH6.0，能隨機快速地水解淀粉分子內部的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生極限糊精及少量麥芽糖，導致淀粉衆(zhòng)黏度迅速下降；商品化的糖化酶為黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶，此糖化酶的最適催化條件為60°C、pH4.24.5，能水解極限糊精分子非還原末端的α-1，4糖苷鍵或a_l，6糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖，導致淀粉漿還原力升高。同時，為了加快糖化、提高最終的糖產(chǎn)率，也常常加入淀粉脫枝酶嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(Bacillusacidopullulyticus)普魯蘭酶。由于上述液化酶和糖化酶具有不同的最適催化反應條件，所以在淀粉的液化和糖化的過程中需要使用不同的反應溫度和pH，因而增加了淀粉糖的生產(chǎn)時間和生產(chǎn)成本。為了能夠建立一種一步法同時對玉米淀粉進行液化糖化、或使液化的淀粉能夠在相同的條件下繼續(xù)糖化的工藝，淀粉糖工業(yè)迫切需要一種最適催化反應溫度在90°C左右、最適催化反應PH在弱酸性范圍的糖化酶。目前，普遍認為采用基因工程技術提高黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性、克隆表達嗜熱微生物葡萄糖淀粉酶,是解決上述問題的二個途徑。極端嗜熱古細菌是一類能在80°C以上高溫環(huán)境中生長的微生物；近來研究發(fā)現(xiàn)，不少種類的極端嗜熱古細菌具有熱穩(wěn)定性葡萄糖淀粉酶基因?；蛑亟M嗜苦菌(Picrophilustorridus)葡萄糖淀粉酶在35-65°C、pH4.5-6.5范圍內具有活性，但是其最適水解底物為麥芽三糖(Sch印ers，B.Thiemann,V.Antranikian,G.CharacterizationofanovelglucoamyIasefromthethermoacidophilicarchaeonPicrophilustorridusheterologousIyexpressedinE.col1.Engineeringinlifesciences.2006，6(3):311-317.)，對淀粉的水解活性低，而未能用于淀粉糖化工業(yè)?；蛑亟M嗜酸熱原體菌(Thermoplasmaacidophilum)葡萄糖淀粉酶最適催化反應溫度僅為75°C、最適催化反應pH為5.0，能夠在5小時內將0.5%(w/v)的馬鈴薯支鏈淀粉部分轉化為葡萄糖(Dock,C.Hess,M.Antranikian,G.AthermoactiveglucoamylasewithbiotechnologicalrelevancefromthethermoacidophiliceuryarchaeonThermoplasmaacidophilum.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.2008,78(1):105-114.)。硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的基因重組葡萄糖淀粉酶(SSGA)和基因重組糖原脫枝酶(SSOTE)的最適水解底物分別為麥芽三糖和支鏈淀粉；這二種酶需要配合使用，才能夠在pH為5.56.5、溫度為7580°C的條件下聯(lián)合水解液化的淀粉，而得到高產(chǎn)率的葡萄糖(KR20040025179、KR101014802)。由于這些極端嗜熱古細菌葡萄糖淀粉酶的最適催化反應溫度較低、或者對淀粉的水解活性低，不能在90°C以上的條件下，與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶一起使用，對玉米淀粉同時進行液化和糖化。
發(fā)明內容本項發(fā)明公開了一種同時對玉米淀粉進行高溫液化和糖化，一步制備淀粉糖的方法；即，將地衣芽孢桿菌α-淀粉酶與一種古細菌麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase,MAase7EC3.2.1.133)同時加入到高溫預熱的玉米淀粉漿中，繼續(xù)進行保溫水解反應，最終將玉米淀粉完全酶解轉化為葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖(說明書附圖1)。本項發(fā)明所涉及的淀粉液化酶，是商品化的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶，活性測定的方法為文獻“Bemfeld,P.Amylasealphaandbeta.Methodsinenzymology.1955,1:149-158.”中所報道的方法。本項發(fā)明所涉及的淀粉糖化酶，屬于葡萄糖苷水解酶13家族，是通過構建基因工程菌，表達嗜熱古細菌的麥芽糖淀粉酶基因，而得到的最適催化反應溫度在90-100°C、最適催化反應PH在5.0-5.5范圍的基因重組極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶；其制備、純化和活性測定的方法為文獻“Li，D.etal.0verexpressionandcharacterizationofanextremelythermostablemaltogenicamylase,withanoptimaltemperatureof100°C,fromthehyperthermophiIicarchaeonStaphylothermusmarinus.Newbiotechnology.2010,27(4)=300-307.”中所報道的方法。本發(fā)明所公開的同時液化和糖化玉米淀粉制備淀粉糖的方法，包括以下步驟:(I)將玉米淀粉加入到水中，濃度為10-30%(w/v)、pH范圍是5.0-6.0;(2)加熱至90-100°C;(3)加入酶活力為50_150U/g淀粉的極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶和酶活力為50-150U/g淀粉的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，混勻；(4)在90-100°C，酶解3_7hr；(5)自然冷卻至室溫，得到以葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖為主要成分的、總產(chǎn)率大于110%(w/w)的玉米淀粉糖衆(zhòng)。本發(fā)明所涉及的玉米淀粉糖的檢測方法為高效陰離子交換色譜法，檢測條件為:采用高效陰離子交換電化學檢測色譜儀(ICS-3000型，戴安，美國)測定上述淀粉糖衆(zhòng)中的糖分組成和含量，陰離子交換柱:CarboPacPA10(4mmX250mm);淋洗液:18mmol/LNaOH;流速:1.0mL/min;進樣量:25yL;柱溫:30°C;脈沖安培檢測，則得如說明書附圖2所示的淀粉糖漿高效陰離子交換色譜圖。采用峰面積標準曲線法，對三色譜峰進行定量，將((糖質量/淀粉質量)xioo%)定義為產(chǎn)率。本項發(fā)明使用嗜熱古細菌麥芽糖淀粉酶代替黑曲霉葡萄糖淀粉酶，并且與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶合用，在相同的溫度和相同的PH值下、對玉米淀粉同時進行液化和糖化(說明書附圖1)，省去了二步法中、液化后糖化前需要改變溫度和調節(jié)PH的操作步驟，提高了淀粉糖的生產(chǎn)速度。圖1是同時液化糖化玉米淀粉的操作流程圖。BLA是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶；SMMA是海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)麥芽糖淀粉酶。圖2是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶與海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)麥芽糖淀粉酶同時液化糖化玉米淀粉所得糖衆(zhòng)的高效陰離子交換色譜圖。圖中保留時間3.717min為葡萄糖色譜峰，圖中保留時間6.217min為異麥芽糖色譜峰，圖中保留時間11.767min為麥芽糖色譜峰。具體實施例方式將20mg玉米淀粉(大成實業(yè)集團，吉林省長春市)與200μL緩沖液(50mMρΗ5.5乙酸-乙酸鈉)混和，在90°C預熱3分鐘后，加入酶活力為IOU的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(BLA，Termamyl120，諾維信，丹麥)和酶活力為5U的海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)麥芽糖淀粉酶(SMMA),在90O保溫5h后，自然冷卻至室溫，則得到淀粉糖漿。采用高效陰離子交換色譜儀測定淀粉糖漿的組成成分，計算得到:葡萄糖的產(chǎn)率為38.92%、麥芽糖的產(chǎn)率為39.87%、異麥芽糖的產(chǎn)率為31.83%、總產(chǎn)率為110.62%。權利要求1.一種同時液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于采用以下步驟:(1)將玉米淀粉加入到水中，濃度為10-30%(w/v),pH范圍是5.0-6.0；(2)加熱至90-100°C；(3)加入酶活力為50-150U/g淀粉的極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶和酶活力為50-150U/g淀粉的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，混勻；(4)在90-100°C，酶解3-7hr；(5)自然冷卻至室溫，得到以葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖為主要成分的、總產(chǎn)率大于110%(w/w)玉米淀粉糖衆(zhòng)。2.根據(jù)權利要求1所述的一種同時液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于所使用的極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶是海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)麥芽糖淀粉酶。3.根據(jù)權利要求1所述的一種同時液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于將極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶(糖化酶)與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(液化酶)一起加入到90-100°C的玉米淀粉漿中。4.根據(jù)權利要求1所述的一種同時液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于產(chǎn)物淀粉糖的主要組成成分是葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖。全文摘要本發(fā)明涉及一種同時液化糖化玉米淀粉的方法。該方法使用一種最適催化反應溫度在90-100℃的極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶代替最適催化反應溫度在55-65℃的黑曲霉葡萄糖淀粉酶；由于這種極端熱穩(wěn)定麥芽糖淀粉酶與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶具有相似的最適催化反應溫度和最適催化反應pH，所以能夠與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶一起加入已預熱到90-100℃、濃度為10-30％(w/v)玉米淀粉漿中，再于相同的溫度保溫一段時間以后，最終得到葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖總產(chǎn)率大于110％(w/w)的玉米淀粉糖漿。這種方法克服了傳統(tǒng)玉米淀粉糖生產(chǎn)工藝中，先用地衣芽孢桿菌α-淀粉酶在90-100℃、pH5.0-6.0液化玉米淀粉、然后再用黑曲霉葡萄糖淀粉酶在55-65℃、pH4.2-4.5糖化玉米淀粉，需要改變溫度和調節(jié)pH的操作步驟，提高了淀粉糖的生產(chǎn)速度。文檔編號C12P19/14GK103146780SQ20111040167公開日2013年6月12日申請日期2011年12月7日優(yōu)先權日2011年12月7日發(fā)明者李丹,李曉磊申請人:長春大學,李丹,李曉磊