專利名稱：一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌及其構(gòu)建方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界第一大豬肉生產(chǎn)國(guó)，豬的存欄量、出欄量、屠宰量、豬肉總產(chǎn)量均居世界首位，但是由病原菌引發(fā)的傳染病每年給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)與畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)及出口創(chuàng)匯。目前對(duì)傳染病的控制主要采用疫苗接種和抗生素治療，疫苗的使用并不總是有效，而抗生素在預(yù)防和治療豬細(xì)菌性疾病中確實(shí)發(fā)揮了重要作用，但長(zhǎng)期大量使用帶來(lái)了許多危害，其中突出的是造成病原菌廣泛而嚴(yán)重的耐藥性和藥物殘留，耐藥性使得疫苗和抗生素對(duì)疾病預(yù)防無(wú)效，且藥物殘留嚴(yán)重影響肉品質(zhì)，甚至危害人類健康。因此尋找無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、能高效控制疾病傳染的天然殺菌藥物，已成為十分緊迫的任務(wù)。革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria, GNB)包括大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎桿菌等20余種病原菌，其共同特點(diǎn)之一是細(xì)胞壁外膜的主要成分是脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)或稱內(nèi)毒素(endotoxin),是決定GNB細(xì)菌感染(如膿毒癥和感染性休克)的主要致病因子，與其他許多疾病有著密切的關(guān)系，如Crohn病、潰瘍性大腸炎、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、急性胰腺炎、肝硬化、酒精性肝病、阻塞性黃疸、牙周疾病等)、呼吸系統(tǒng)(如囊胞性纖維化、哮喘等)、心血管系統(tǒng)(如冠狀動(dòng)脈硬化)、泌尿系統(tǒng)(如溶血性尿毒綜合征、血透或腹膜透析并發(fā)癥)等多個(gè)系統(tǒng)疾病。近年研究證明，內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(endotoxin binding protein, EBP)及其受體系統(tǒng)在機(jī)體識(shí)別和調(diào)控內(nèi)毒素作用中起重要作用，內(nèi)毒素通過其增敏或抑制作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中殺菌通透性增加蛋白 (bact ericidal/permeability increasing protein, BPI)起至丨J關(guān)鍵作用。殺菌蛋白對(duì)革蘭陰性菌具有殺傷作用，在機(jī)體內(nèi)被稱為“超級(jí)抗生素”。它不僅具有殺菌和中和內(nèi)毒素的雙重抗感染活性，還具有抗真菌、促進(jìn)補(bǔ)體活化、增強(qiáng)吞噬的調(diào)理功能、抑制血管生成和抗原蟲等一系列生物學(xué)功能，很有希望成為一種新型抗菌蛋白藥物。程玉磊(2006)和祁克宗等(2006)僅克隆了豬BPIN端基因約140bp，且沒有對(duì)該片段的表達(dá)及功能進(jìn)行研究。秦孝建等(1999)報(bào)道的BPI功能區(qū)合成肽對(duì)光滑型G具有殺菌活性，周紅和肖光夏(1996)和周紅等(2002)對(duì)豬源BPI (從豬PMNs分離豬BPI)體外生物活性進(jìn)行研究，證實(shí)具有殺菌功能。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)重組豬殺菌蛋白功能研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白基因工程菌，并提出其構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的是該生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白基因工程菌的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，克隆豬殺菌蛋白基因的開放閱讀框5’端片段678bp，將其整合到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)上，轉(zhuǎn)化Esherichia coli BL21(DE3),得到重組子，構(gòu)建重組子文庫(kù)，經(jīng)篩選，最終得到一株能穩(wěn)定生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌。一種豬殺菌蛋白基因工程菌，其分類命名為大腸桿菌BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPI N (Escherichia coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011252。CCTCC M 2011252基因工程菌的構(gòu)建，從黔邵花豬肝臟組織中提取RNA，進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，引物Forward Primer 5/ -GCAAGGATCCATGGCCAGGGGCGCTGAC-3'Reverse Primer 5/ -CCATCTCGAGTTATTTTTTTCACTTTGGCTGTCACTGGCAG-3逆轉(zhuǎn)錄TotalRNA 4 μ I ( ^ 5 μ g) , random hexamer primer I μ I, DEPC-H207 μ 1，輕輕混合，離心沉淀，總體積12 μ 1，65°C溫育5min,輕柔離心，冰上冷卻；然后加入 5Xreaction buffer 4 μ I, Ribonuclease inhibitor (20u/ μ I) I μ I, IOmM dNTP mix 2 μ I, Rever Transcriptase (200u/ μ I) I μ I,總體積 20 μ 1，輕輕混合，離心沉淀，25°C 溫育5min，再42°C溫育60min，然后70°C溫育5min，合成的cDNA于_20°C保存?zhèn)溆?。PCR 反應(yīng)體系200 μ I PCR 管，依次加入 dd-water 7. 2 μ I, MasterMix 10 μ I, Sense Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, Anti-sense Primer (10 μ m) O. 4 μ I,模板 cDNA 2 μ I,混勻， 輕度尚心。PCR 反應(yīng)程序首先 94°C 3min，然后 94°C 30s，57°C 30s, 72°C 45s 循環(huán) 35 次，后延伸 72°C IOmin0將其用BamHl和Xhol酶切后連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a (+)上，得到重組載體 E. coli pET32a(+)-pBPIN，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化 Esherichia coli BL21(DE3)得到重組大腸埃希氏菌(E.coli BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPIN) CCTCCM2011252 經(jīng)篩選獲得的CCTCC M 2011252，在LB培養(yǎng)基中用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定重組豬殺菌蛋白的表達(dá)純度和表達(dá)量，采用柱純化法純化目標(biāo)重組豬殺菌蛋白，用分光光度計(jì)定量所得到的重組豬殺菌蛋白。體外殺菌活性檢測(cè)將回收的殺菌蛋白作用于非致病性大腸桿菌JM109、沙門氏菌(豬霍亂沙門氏菌S. choleraesuis和鼠傷寒沙門氏菌S. typhimurium),發(fā)現(xiàn)重組殺菌蛋白有明顯的殺菌作用。生物材料樣品保藏一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌E.coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2011252。保藏時(shí)間為2011年7月13日。


下面結(jié)合附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。圖I是重組豬BPI肽的殺菌曲線。圖2是溫度對(duì)重組豬BPI肽殺滅E.圖3是溫度對(duì)重組豬BPI肽殺滅S.圖4是溫度對(duì)重組豬BPI肽殺滅S.
coli能力的影響。 typhimurium能力的影響。 chloleraesuis能力的影響。
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具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例更為詳細(xì)地解釋了本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)，為更好地理解本發(fā)明提供依據(jù)。實(shí)施例I構(gòu)建從黔邵花豬肝臟組織中提取RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物Forward Primer 5/ -GCAAGGATCCATGGCCAGGGGCGCTGAC-3'Reverse Primer 5/ ~CCATCTCGAGTTATTTTTTTCACTTTGGCTGTCACTGGCAG~3逆轉(zhuǎn)錄在500 μ I 離心管中加入 Total RNA 4 μ I ( < 5 μ g), random hexamer primer I μ I, DEPC-H2O 7 μ I,輕輕混合，離心沉淀，總體積12 μ 1,65°C溫育5min,輕柔離心，冰上冷卻；然后加入 5Xreaction buffer 4 μ I, Ribonuclease inhibitor (20u/ μ I) I μ I, IOmM dNTP mix 2 μ I, Rever Transcriptase (200u/ μ I) I μ I,總體積 20 μ I,輕輕混合，離心沉淀，25°C溫育5min，再42°C溫育60min，然后70°C溫育5min，合成的cDNA 于-20°C保存?zhèn)溆谩?00 μ I PCR 管中按順序加入 dd-water 7. 2 μ I, MasterMix 10 μ I, Forward Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, Reverse Primer (10 μ m) 0. 4 μ I, dNTP mix (IOmM) 0. 5 μ I,模板 cDNA 2 μ 1，混勻，輕度離心。按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s， 57°C退火30s, 72°C延伸45s, 35個(gè)循環(huán)，72°C后延伸IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖電泳分離，回收700bp左右的片段，用BamHl和Xhol酶切后，連接表達(dá)載體pET32a(+)，轉(zhuǎn)化Esherichia coli BL21 (DE3)，涂布抗性平板，構(gòu)建重組
子文庫(kù)。對(duì)獲得的重組子進(jìn)行篩選鑒定，選出表達(dá)重組豬殺菌蛋白效果較好的菌株。實(shí)施例2應(yīng)用將大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌、鼠沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別接種于固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16 18h，挑取單克隆于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)14h，再轉(zhuǎn)移至新鮮LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約4h)，用LB培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌濃度至I X 105cfu/mL。選擇恰當(dāng)?shù)闹亟M豬BPI肽濃度，測(cè)定其對(duì)大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌、鼠沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線，菌量為I X 103cfu/mL,反應(yīng)體積lmL，當(dāng)重組豬BPI 肽與細(xì)菌混合后，37°C培養(yǎng),在不同時(shí)間(5min、10min、20min、40min、lh、2h、4h、8h)每次取 10 μ L于37°C平皿培養(yǎng)16 24h后計(jì)數(shù)菌落，并繪制時(shí)間_殺菌曲線圖，見附圖I。溫度對(duì)重組豬BPI肽活性的影響取適當(dāng)濃度重組豬BPI肽，分別置于-20、4、20、40和60°C條件下溫度處理 30min后取出，測(cè)定其對(duì)大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌和鼠沙門氏菌的殺菌活性，菌量為I X 103cfu/mL。以不經(jīng)溫度處理的重組豬BPI肽做陽(yáng)性對(duì)照，pH7. 5的PBS為陰性對(duì)照，見附圖2-4。pH值對(duì)重組豬BPI肽活性的影響取適當(dāng)濃度重組豬BPI肽，用酸度計(jì)以O(shè). lmol/L的HCl和2mmol/L NaOH分別將重組豬BPI肽的pH值調(diào)至3、5、7、10、12，然后分別測(cè)定其對(duì)大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌和鼠沙門氏菌的殺菌活性，菌量為lX103cfu/mL。以不經(jīng)酸堿處理的重組豬BPI融合蛋白做陽(yáng)性對(duì)照，pH 7. 5的PBS為陰性對(duì)照，見附圖5-7。細(xì)菌量對(duì)重組豬BPI肽活性的影響調(diào)整重組豬BPI肽濃度，以大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌和鼠沙門氏菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在其它條件相同的情況下，改變接種菌量為1 X 103、I X 104、I X 105、I X 106、 IX 107cfu/mL,比較不同菌量對(duì)重組豬BPI肽的最低抑菌濃度(Minimal inhibition concentration, MIC)的影響，見附圖 8-10。結(jié)果顯示，經(jīng)篩選獲得表達(dá)重組豬殺菌蛋白效果較好的菌株，在LB培養(yǎng)基中用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)獲得的重組豬殺菌蛋白進(jìn)行體外殺菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組殺菌蛋白對(duì)非致病性大腸桿菌JM109、豬副傷寒沙門氏菌、鼠沙門氏菌等革蘭氏陰性菌有明顯的殺菌作用。附圖I適當(dāng)濃度的重組豬BPI蛋白在與大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌、鼠沙門氏菌和金黃色葡萄球菌作用20-120min的殺菌活性最強(qiáng)。附圖2-4結(jié)果顯示重組豬BPI肽在_20、4、20、40和60°C作用30min仍具有明顯的
殺菌活性。附圖5-7在不同pH值條件下的殺菌活性表現(xiàn)為對(duì)大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌、 鼠沙門氏菌在酸性條件下增強(qiáng)，在堿性條件下則殺菌活性減弱。附圖8-10在pH 7.0條件下，觀察重組豬BPI肽對(duì)大腸桿菌、豬副傷寒沙門氏菌和鼠沙門氏菌在I X 103、I X 104、I X 105、I X 106、I X 107cfu/mL等細(xì)菌濃度下的殺菌活性，結(jié)果顯示重組豬BPI肽對(duì)大腸桿菌在這5種不同濃度下的MIC值分別為O. 05 μ g/mL、 I. 625 μ g/mL、3. 25 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、13 μ g/mL ;對(duì)豬副傷寒沙門氏菌在這5種不同濃度下的 MIC 值分別為 O. 063 μ g/mL、I. 88 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,6. 88 μ g/mL、13. 0 μ g/mL ;對(duì)鼠沙門氏菌在這5種不同濃度下的MIC值分別為O. 063 μ g/mL、I. 88 μ g/mL、3. 5 μ g/mL、7. 0 μ g/ mL、13. 88 μ g/mL。
權(quán)利要求
1.一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌，其分類命名為大腸桿菌BL21(DE3)-pET32 a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21 (DE3)-pET32a(+)-pBPIN)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M2011252。
2.分類命名為大腸桿M BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21 (DE3) -pET32a (+) -pBPIN)的一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌，表達(dá)的重組豬殺菌蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌的明顯殺菌作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的基因工程菌及其構(gòu)建以及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增黔邵花豬殺菌蛋白基因的開放閱讀框5’端678bpDNA片段，插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化Esherichia coli BL21(DE3)，構(gòu)建重組子文庫(kù)，經(jīng)篩選鑒定，最終得到一株可以生產(chǎn)重組豬殺菌蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN(Escherichia coli BL21(DE3)-pET32a(+)-pBPIN)CCTCC M2011252，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)體外活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組豬殺菌蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌有明顯的殺菌作用。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102586162SQ20111040111
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者劉勝貴, 向?qū)O軍, 魏麟 申請(qǐng)人:劉勝貴, 向?qū)O軍, 懷化學(xué)院, 魏麟