專利名稱：黃瓜枯萎病的苗期人工接種方法及其接種物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃瓜枯萎病的苗期人工接種方法及其接種物。
背景技術(shù)：
由半知菌亞門尖鐮孢菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum(Schl.) f. s p. cucumerinumowen)侵染引起的黃瓜枯萎病是設(shè)施栽培和露地栽培黃瓜上的一種世界性土傳病害，常給黃瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重甚至毀滅性損失。在病害防治中，化學(xué)防治效果不理想； 輪作倒茬雖然有效，但給蔬菜生產(chǎn)的茬口安排帶來(lái)實(shí)際困難；選育和合理利用抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、安全、高效的措施。而苗期人工接種是枯萎病抗病育種、抗病性遺傳以及病菌生理小種鑒定的重要環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外枯萎病苗期接種方法主要有(1)胚根法該接種法簡(jiǎn)便易行，但由于枯萎病菌侵染產(chǎn)生不出苗種子，而且不出苗種子比率與病原菌致病力及寄主抗病性不成正比，品種間差異小，因此認(rèn)為胚根接種法所用的剛發(fā)根的幼植物體與成苗后的植物體可能有不同的抗病性。(2)菌土法該方法與胚根法一樣存在枯萎病菌侵染產(chǎn)生不出苗種子而影響抗病性鑒定結(jié)果問題。(3)灌根法該方法由于人為對(duì)根部造成較大傷口，接種后植株發(fā)病迅速，但該方法難以檢測(cè)植株根系分泌物等對(duì)抗病性的影響，且對(duì)不同植株很難做到傷根均勻，難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。(4)沾根法該方法拔出的幼苗由于機(jī)械損傷而使幼嫩根系出現(xiàn)多處微傷，依靠機(jī)械微傷給病菌提供侵入根部的條件以達(dá)到接種效果。同樣存在灌根法的缺點(diǎn)。綜上所述，上述各種接種方法均存在一定弊端，因此探尋周期短、穩(wěn)定可靠、能夠正確反映品種抗病性的人工接種方法對(duì)黃瓜抗枯萎病的抗病性鑒定、生理小種分化研究具
有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物。本發(fā)明所提供的用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物，由包括如下步驟的方法制備得到的向滅菌后的培養(yǎng)基中加入黃瓜枯萎病菌，于培養(yǎng)13-15天，即得到用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物；所述培養(yǎng)基由土壤、米糠、蔗糖和水組成；所述培養(yǎng)基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為 40 8 0. 5 12.5-40 12 0. 7 17.5。所述加入黃瓜枯萎病菌的量為3. 6 X IO5個(gè)孢子/g培養(yǎng)基-4. 1 X IO5個(gè)孢子/g培
養(yǎng)基；所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于接種黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)物。本發(fā)明所提供的用于接種黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)物，由所述用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物和滅菌土組成。所述接種物和所述滅菌土的質(zhì)量比為1 4。所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種接種黃瓜枯萎病菌的方法。本發(fā)明所提供的接種黃瓜枯萎病菌的方法，包括以下步驟將黃瓜幼苗移栽于所述用于接種黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)物中，進(jìn)行培養(yǎng)，即得到接種了黃瓜枯萎病菌的黃瓜幼苗。所述黃瓜幼苗為子葉期的黃瓜幼苗。所述培養(yǎng)是在溫度為光照25°C 和黑暗18°C的條件下培養(yǎng)10天-15天。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由土壤、米糠、蔗糖和水組成；所述培養(yǎng)基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為 40 8 0. 5 12. 5-40 12 0. 7 17. 5。所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。所述黃瓜的品種名稱為傲雪、中農(nóng)12號(hào)、中農(nóng)21號(hào)、中農(nóng)27號(hào)、中農(nóng)203號(hào)、強(qiáng)大理想、谷雨07-1、荷蘭綠劍、新北京自玉香黃瓜、魔爾優(yōu)加優(yōu)九號(hào)、北國(guó)寒秀、春冠王、中農(nóng) 10號(hào)、長(zhǎng)春密刺、津春2號(hào)或津研2號(hào)。采用本發(fā)明的方法接種后IOd 15d調(diào)查的發(fā)病結(jié)果與田間成株期自然發(fā)病的結(jié)果相吻合，而且經(jīng)多年多次抗病性鑒定，結(jié)果表明該方法接種后抗病反應(yīng)比較穩(wěn)定、可靠性強(qiáng)。本發(fā)明所提供的接種方法適用于黃瓜品種的抗病性鑒定、黃瓜枯萎病菌生理小種分化、 致病力的遺傳變異等方面的研究。


圖1為用本發(fā)明的接種方法接種后不同品種的病情指數(shù)。圖2為用灌根接種法接種后不同品種的病情指數(shù)。圖3為用浸根接種法接種后不同品種的病情指數(shù)。圖4為用胚根接種法接種后不同品種的病情指數(shù)。圖5為用菌土法接種后不同品種的病情指數(shù)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、黃瓜枯萎病的苗期人工接種方法I一、菌懸液的制備
4
將保存于PDA斜面培養(yǎng)基上的黃瓜枯萎病菌，即尖孢鐮孢菌黃瓜?；?(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum owen)(公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是陳霞，劉東，張艷菊，秦智偉，周秀艷.黃瓜枯萎病株鐮孢菌的分離與鑒定。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,41(7) :37-44)，接種于盛有150mL PL培養(yǎng)液(馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，定容至IOOOmL,滅菌)的錐形瓶中，置于搖床上，以120rpm -min"1培養(yǎng)7d。培養(yǎng)液經(jīng)兩層紗布過濾，濾液置于離心機(jī)中以4，OOOrpm · mirT1離心lOmin，倒除上清液，加適量蒸餾水稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子數(shù)，再加水調(diào)至接種濃度為1 X IO6個(gè)小孢子iL-1，備用。二、培養(yǎng)基配制稱取土壤80g，米糠20g，混勻后加入40g/L蔗糖溶液30mL，攪拌均勻后裝于可滅菌的容器中，121°C滅菌20min，即得到用于培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由土壤、 米糠、蔗糖和水組成，土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為40 10 0.6 15。三、黃瓜枯萎病菌在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)向上述步驟二得到的132g培養(yǎng)基中加入50mL上述步驟一得到的濃度為IX IO6個(gè)孢子/mL的黃瓜枯萎病菌懸液(即黃瓜枯萎病菌的加入量為3. 8 X IO5個(gè)孢子/g培養(yǎng)基)， 于無(wú)菌條件下充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅?8°C培養(yǎng)14天，即得到用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物。四、鑒定材料準(zhǔn)備設(shè)長(zhǎng)春密刺(2005年購(gòu)自哈爾濱蔬菜市場(chǎng))為抗病對(duì)照品種，津研2號(hào)(2005年購(gòu)自哈爾濱蔬菜市場(chǎng))為感病對(duì)照品種。2009年以12份黃瓜品種及種質(zhì)資源作為供試品種(見表1，各供試品種的來(lái)源見表幻，種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液消毒IOmin后，用清水沖洗，放入墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，然后于恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待胚根長(zhǎng)至0. 5cm左右時(shí)，將其播于塑料育苗缽內(nèi)，播種基質(zhì)為消毒的蛭石營(yíng)養(yǎng)土(3 1)，每缽1粒，每品種重復(fù) 3次，每重復(fù)10株苗。20 25°C溫室內(nèi)育苗7天，得到子葉期的黃瓜幼苗。五、接種將上述步驟三得到用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物與滅菌土按質(zhì)量比為1 4的比例混合制成接種土，裝入營(yíng)養(yǎng)缽中，然后將子葉期的黃瓜幼苗移栽于營(yíng)養(yǎng)缽中。在溫度為光照^TC/黑暗18°C的條件下培養(yǎng)13天。調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。同時(shí)，以田間自然發(fā)病情況為對(duì)照。田間鑒定設(shè)在自然菌源較多、每年發(fā)病較重的溫室內(nèi)進(jìn)行。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)無(wú)病癥1級(jí)胚軸或子葉出現(xiàn)輕微病癥，但生長(zhǎng)正常2級(jí)胚軸或子葉出現(xiàn)明顯壞死斑，或一片子葉黃化，影響生長(zhǎng)3級(jí)兩片子葉黃化，或一片子葉枯死4級(jí)兩片子葉生長(zhǎng)僵化，植株部分萎蔫或停止生長(zhǎng)5級(jí)整株萎蔫、倒伏或枯死計(jì)算病情指數(shù)，公式為
病情指數(shù)=Σ(各級(jí)病葉數(shù)χ各級(jí)翻)χ 100 R調(diào)查總?cè)~數(shù)χ最高一級(jí)代表值xl(K)
抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)種質(zhì)群體對(duì)枯萎病的抗性依苗期病情指數(shù)分5級(jí)。
權(quán)利要求
1.一種用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物，由包括如下步驟的方法制備得到的 向滅菌后的培養(yǎng)基中加入黃瓜枯萎病菌，于培養(yǎng)13-15天，即得到用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物；所述培養(yǎng)基由土壤、米糠、蔗糖和水組成；所述培養(yǎng)基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為 40 8 0.5 12.5-40 12 0. 7 17.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接種物，其特征在于所述加入黃瓜枯萎病菌的量為3. 6 X IO5個(gè)孢子/g培養(yǎng)基-4. 1 X IO5個(gè)孢子/g培養(yǎng)基；所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum(Schl.) f. sp. cucumerinum owen)。
3.一種用于接種黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)物，由權(quán)利要求1或2所述的接種物和滅菌土組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)物，其特征在于所述接種物和所述滅菌土的質(zhì)量比為 1 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的培養(yǎng)物，其特征在于所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum(Schl. )f. s p. cucumerinum owen)。
6.一種接種黃瓜枯萎病菌的方法，包括以下步驟將黃瓜幼苗移栽于權(quán)利要求3-5中任一所述的培養(yǎng)物中，進(jìn)行培養(yǎng)，即得到接種了黃瓜枯萎病菌的黃瓜幼苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述黃瓜幼苗為子葉期的黃瓜幼苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)是在溫度為光照25°C-28°C 和黑暗18°C的條件下培養(yǎng)10天-15天。
9.一種用于培養(yǎng)黃瓜枯萎病菌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由土壤、米糠、蔗糖和水組成；所述培養(yǎng)基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為40 8 0.5 12.5-40 12 0. 7 17.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述黃瓜枯萎病菌為尖鐮孢菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum(Schl. )f. s p. cucumerinum owen)。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃瓜枯萎病的苗期人工接種方法及其接種物。本發(fā)明提供了一種用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物。本發(fā)明所提供的用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物，由包括如下步驟的方法制備得到的向滅菌后的培養(yǎng)基中加入黃瓜枯萎病菌，于28℃培養(yǎng)13-15天，即得到用于接種黃瓜枯萎病菌的接種物；所述培養(yǎng)基由土壤、米糠、蔗糖和水組成；所述培養(yǎng)基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的質(zhì)量比為40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。本發(fā)明所提供的接種方法適用于黃瓜品種的抗病性鑒定、黃瓜枯萎病菌生理小種分化、致病力的遺傳變異等方面的研究。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102517220SQ20111040001
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者劉大偉, 張艷菊, 李永剛 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)