鏈霉菌菌株及其防治黃瓜枯萎病聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鏈霉菌菌株及其防治黃瓜枯萎病聯(lián)合應(yīng)用，涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明所述的放線菌是從浙江西溪濕地植物根際采集的土樣中采用放線菌分離技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定，命名為白色鏈霉菌（ Streptomyces albus ）2013和暗黑鏈霉菌（ Streptomyces tenebrarius ）M929， S.albus 2013已于2013年6月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNO:M2013269； S.tenebrarius M929已于2013年12月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCCNO:M2013710。兩菌株均能發(fā)酵產(chǎn)生對黃瓜枯萎病菌（ Fusarium oxysporum f.sp. cucumebrium ）具有較強(qiáng)拮抗作用的活性物質(zhì)，可用于防治黃瓜枯萎病害。兩菌株的發(fā)酵產(chǎn)物按重量百分比為3:2—1:1混合制成混合制劑時，防治黃瓜枯萎病病原菌的效果較兩者分別作為單一制劑使用時更為顯著。CCTCC NO: M 20132692013.06.19CCTCC NO: M 20137102013.12.25
【專利說明】鏈霉菌菌株及其防治黃瓜枯萎病聯(lián)合應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及兩株生防放線菌一白色鏈霉菌2013和暗黑鏈 霉菌M929代謝產(chǎn)物在防治黃瓜枯萎病中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 黃瓜枯萎病，又名萎蔫病、死秧病，是黃瓜病害中最為嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的 病害之一。近年來黃瓜枯萎病的發(fā)生逐年加重，一般可導(dǎo)致黃瓜產(chǎn)量減少10%~20%，病情嚴(yán) 重時損失達(dá)70%以上，給生產(chǎn)造成巨大損失。
[0003] 黃瓜枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌黃瓜?；桐栆?/7〇/--f.sp. 該病菌在土壤、病株殘體及未腐熟的農(nóng)家肥中或附著在種子上越冬，成為翌 年初侵染源。病原菌從根部傷口和根毛生長點(diǎn)侵入植株，進(jìn)而破壞其根、莖和葉的維管束， 使黃瓜植株吸收和運(yùn)輸水分功能喪失，最終造成黃瓜植株枯萎死亡。針對黃瓜枯萎病害目 前主要采用化學(xué)農(nóng)藥殺滅病原菌，但化學(xué)防治導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及抗藥性等一系列 問題。因此，生物防治引起人們的重視。目前有研究表明植物提取物中的活性成分對有一定 的抑制作用，但植物有效成分提取操作步驟多，效率低(賈俊英，中國農(nóng)學(xué)通報，2014 ;鄭成 銳，中國園藝文摘，2011 ;李杰，科技導(dǎo)報，2014);已報道采用芽孢桿菌作為生防菌防治黃瓜 枯萎病病害的發(fā)生，由于該菌株對病原菌的抑制作用不強(qiáng)，故生防效果并不理想(韋巧婕， 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013;卜春亞，中國農(nóng)學(xué)通報，2013)。放線菌因其易產(chǎn)生抗病原菌成分 等活性物質(zhì)，已成為生物防治植物病蟲害的主要資源和生物農(nóng)藥開發(fā)的主要來源。土壤是 放線菌棲居的重要場所，從土壤中獲得具有高效抗菌活性的放線菌是目前世界范圍內(nèi)研制 開發(fā)新醫(yī)藥和新農(nóng)藥必不可少的基礎(chǔ)工作。從土壤中篩選拮抗放線菌對黃瓜枯萎病原菌的 生物防治已有不少報道，但大多集中在用單一拮抗放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物防治黃瓜枯萎病，治 療和預(yù)防效果并不顯著。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于通過篩選提供對黃瓜枯萎病 原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的兩株生防菌一白色鏈霉菌2013和暗黑鏈霉菌M929。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是通過不同的比例混合兩株生防鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物，提供上 述白色鏈霉菌和暗黑鏈霉菌在黃瓜枯萎病防治中的聯(lián)合應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)手段得以實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明首先以在浙江西溪濕地植物根際采集的土樣為研究對象，經(jīng)分離、發(fā)酵培養(yǎng)、 發(fā)酵液提取以及對植物病原真菌抑制活性檢測等步驟獲得兩株對黃瓜枯萎病原菌具有較 強(qiáng)抑菌活性的鏈霉菌；其中一株經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定并命名為白色鏈霉菌 <3^^5)2013。該菌已于2013年6月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為： CCTCCNO:M2013269;另一株經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定并命名為暗黑鏈霉菌(泣 該菌已于2013年12月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCCNO:M2013710。中國典型培養(yǎng)物保藏中心地址：武漢市武昌珞珈山，郵編： 430072。
[0007] 本發(fā)明所述的白色鏈霉菌(泣a/tos) 2013在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 時氣絲白色，基絲地衣狀，乳脂色。顯微觀察發(fā)現(xiàn)a從ys2013孢子絲螺旋形， 孢子球形至卵圓形，表面光滑。本發(fā)明所述的aWws2013,發(fā)酵液經(jīng)提取濃 縮后可對黃瓜枯萎病病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。
[0008] 本發(fā)明所述的暗黑鏈霉菌M929在PDA固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)時氣絲暗鼠灰色，基絲地衣狀，黑色。顯微觀察發(fā)現(xiàn) M929孢子絲敞圈，孢子球形至卵圓形，表面光滑。本發(fā)明所述的teflefo-ariysM929,發(fā)酵液經(jīng)提取濃縮后可對黃瓜枯萎病病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。 [0009] 所述的黃瓜枯萎病原菌拮抗放線菌的篩選和抑菌活性檢測過程如下所述： (1) 從野外(浙江省西溪濕地植物根際）采集土樣，并進(jìn)行晾干處理； (2) 從土樣中分離放線菌，并利用黃瓜枯萎病原菌作為指示菌篩選具有拮抗作用的放 線菌； (3) 將長出的放線菌分別點(diǎn)種于混有黃瓜枯萎病原菌孢子懸液（1X106 的 PDA平板上，通過觀察抑菌圈大小，挑選抑菌圈較明顯的菌株進(jìn)入復(fù)篩； (4) 將選取的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心收集發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 減壓濃縮后制備浸膏，用于黃瓜枯萎病的防效檢測，由此篩選出防治效果較好的兩株拮抗 微生物一白色鏈霉菌2013和暗黑鏈霉菌M929。
[0010] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明從土壤中分離篩選出對黃瓜枯萎病原菌具有較強(qiáng)抑制作用的兩株拮抗鏈霉菌a/tos2013和M929,兩株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物按重 量百分比為3:2 -1:1制成的混合制劑可用于黃瓜枯萎病病害的防治，為生物農(nóng)藥的開發(fā) 提供了新的途徑。
[0011]

【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例 1 : (5'tr<9/7^9?_7c<9>s 2013 和 M929 的分 離與篩選） 按以下步驟進(jìn)行： (1) 材料及培養(yǎng)基：用于分離白色鏈霉菌2013和暗黑鏈霉菌M929的材料為采自浙江 西溪濕地植物根際的土樣，用于放線菌分離所用的培養(yǎng)基為含重鉻酸鉀的PDA培養(yǎng)基(配 方為：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加蒸餾水1L煮沸半小時，紗布過濾，再加20g葡 糖糖和20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121°C，高壓滅菌 20min;使用時添加重鉻酸鉀20iig?ml/1;以下試驗中放線菌常規(guī)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均以蒸 餾水配置）； (2) 分離純化：將上述新鮮采集的土樣裝于采樣袋中，帶回實(shí)驗室后分裝晾干一周左 右；瞭干后的土樣每份稱取5g，分別加入含有45ml無菌水的錐形瓶中，錐形瓶中加入3-5 粒無菌的玻璃珠，28°C搖床培養(yǎng)2h，使土樣中的微生物充分進(jìn)入水中；吸取培養(yǎng)后的樣品 以10倍梯度稀釋，分別取1(T2、10' 1(T4濃度稀釋液200i!L，涂布于含20i!g?ml/1重鉻酸 鉀的PDA固體平板上，28°C培養(yǎng)72h;將平板上長出的放線菌分別挑取單菌落，接種于含重 鉻酸鉀的新鮮PDA平板上，28°C± 1°C條件下純化培養(yǎng)72h，獲得純化后的放線菌； (3)初篩和復(fù)篩：將分離得到的放線菌分別點(diǎn)種于混有黃瓜枯萎病原菌孢子懸液 (1X106cfu^!/1)的PDA固體平板上，通過觀察抑菌圈大小，挑選抑菌圈較明顯的菌株進(jìn)行 復(fù)篩； 復(fù)篩采用平板對峙法對初篩的放線菌進(jìn)行抑菌活性測定，具體方法為：在PDA固體平 板上分別對稱放置一個直徑4_的放線菌菌餅和一個黃瓜枯萎病原菌菌餅，置培養(yǎng)箱中 28°C ±1°C條件下培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測定菌落直 徑。抑菌率通過以下公式計算： 抑菌率（%) = (1-處理菌落生長半徑/對照菌落生長半徑）X100 根據(jù)結(jié)果獲得抑菌活性較好的兩株放線菌，對黃瓜枯萎病原菌的抑菌率均在70%以 上。綜合16SrDNA序列的比對結(jié)果、形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性，其中一株菌株鑒 定為白色鏈霉菌，命名為白色鏈霉菌2013 2013);另一株菌株鑒定 為暗黑鏈霉菌，命名為暗黑鏈霉菌M929 M929);保存。
[0013] (4)Streptomyces albus2013 和 M929 抑菌 活性測定：將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)好的Streptomyces albus M929 按 5% (v/v)分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C±1°C條件 下，180r/min，搖床培養(yǎng)120h后，7800r/min離心7min,用濾紙過濾得發(fā)酵濾液。取經(jīng) 0. 22ym膜過濾的發(fā)酵上清液lmL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅 速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面中央分別放1個直徑為4mm的黃瓜枯萎病菌 f. sp. 菌餅，置培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照， 重復(fù)3次；待對照菌落直徑長至平板直徑的2/3左右時統(tǒng)計結(jié)果，采用十字交叉法測定菌落 直徑，以下列公式計算抑制率： 菌絲生長抑制率（％)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑）/(對照菌落直徑-4)] X 100 測定結(jié)果表明Jtr印a/tos2013 和 M929 代謝 產(chǎn)物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制率分別為73. 4%和71.7%。
[0014]實(shí)施例2 : 2013和 M929發(fā)酵 代謝產(chǎn)物的制備方法） 按以下步驟進(jìn)行： (1)菌種的活化培養(yǎng)：將保存的a/tos 2013和 teflefo-ariys M929孢子懸液（1 X 108 cfu?ml/1)接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，在 28°C ±1°C條件下培養(yǎng)48h供發(fā)酵使用； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基每1L中含有黃豆餅粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶裝 發(fā)酵培養(yǎng)液50mL ;配制后121°C滅菌20min，將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)好的 5^/'<9/7(〇?/^<951<3從^5 2013和5^/'(9/7(〇?/^(9>5((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929 分別按5%(>八）接入發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在28°c±1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)84 h; (3) 發(fā)酵物提?。喊l(fā)酵完畢，離心，棄菌體，收集發(fā)酵液于分液漏斗中，將加入等體積的 乙酸乙酯萃取，充分混勻，待分層后，取上層液相至圓底燒瓶，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后獲得 萃取物浸膏，用于測定抑菌活性。
[0015] 以下實(shí)施例3和試驗例中所述的Stre/?(officesa/tos2013和Stre/?(offices tefldrariMM929代謝產(chǎn)物均為實(shí)施例2所制產(chǎn)品；所述產(chǎn)品的百分含量均為質(zhì)量/體積 百分比。
[0016] 實(shí)施例 3 : 2013 和 M929 代謝 產(chǎn)物對黃瓜枯萎病菌的抑制作用） (1) 分別準(zhǔn)確稱取Str印a/tos2013 和 M929 代 謝產(chǎn)物0.lg，并加入10mL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，分別配置終濃度為10g/L 的母液； (2) 抑菌活性測定：取上述母液分別稀釋成濃度為lg/L和0. 5g/L的溶液，取各濃度溶 液lmL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻a/Zws2013 和 M929 代謝產(chǎn)物終濃度分別均為 0.lg/L和 0. 05g/L), 冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜枯萎病菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中 央（培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)36h，以常規(guī)化學(xué)藥劑和無菌水處理作為對 照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率： 菌絲生長抑制率（％)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑）/(對照菌落直徑-4)]X100 試驗例：(本發(fā)明產(chǎn)品與常規(guī)農(nóng)藥防治效果對比試驗） 試驗結(jié)果見表1。從表1看出，Str印(officesa/tos2013和 M929代謝產(chǎn)物抑制黃瓜枯萎病菌效果較常規(guī)化學(xué)藥劑相當(dāng)，當(dāng)兩菌株的發(fā)酵 產(chǎn)物按重量百分比為3:2-1:1混合時，防治黃瓜枯萎病原菌的效果較兩者分別作為單一 制劑使用時更為顯著。
[0017] 表 1 2013 和 M929 代謝產(chǎn)物對 供試的黃瓜枯萎病原菌的抑制效果及比較

【權(quán)利要求】
1. 一種鏈霉菌菌株，其特征在于：菌株2013分類命名為白色鏈霉菌 W/ws) 2013,保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保藏登記號 為CCTCC NO: M 2013269;另一種鏈霉菌菌株M929,其特征在于：菌株M929分類命名為暗黑 鏈霉菌保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日： 2013年12月25日，保藏登記號為CCTCC NO: M 2013710。
2. -種如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述的白色鏈霉菌 2013和暗黑鏈霉菌M929均能發(fā)酵產(chǎn)生對黃瓜枯萎病菌f. sp. cwc應(yīng)具有較強(qiáng)拮抗作用的活性物質(zhì)，可防治黃瓜枯萎病病害，龜裂鏈霉菌2013和 M929兩者的代謝產(chǎn)物重量百分比為3:2 -1:1時，效果顯著。
3. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的白色鏈霉菌2013和M929兩者的代謝 產(chǎn)物的制備方法如下： (1) 將分離得到的白色鏈霉菌2013和暗黑鏈霉菌M929涂布于甘露醇黃豆餅粉制成的 MS平板上，收集孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)基為每1 L中含有黃豆餅粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋 白胨5g，C〇Cl2 0? 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液50mL ; 配制后121°C滅菌20min，將利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)好的a/Zws 2013和5^/'<9/7(〇?/^<951((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929分別按5%(>八)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°〇±1°〇 條件下，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)84 h; (3) 發(fā)酵結(jié)束后離心收集發(fā)酵液，加入等體積的乙酸乙酯，充分震蕩混勻，取上層，在真 空條件下濃縮至浸膏； (4) 混合制劑配制：將5^/'<9/7(〇?/^<951<3從^5 2013和5^/'(9/7(〇?/^(9>5((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929 代謝產(chǎn)物用水溶解，混合，配成終濃度為〇. 〇6g/L泣聊CM W/ws 2013代謝產(chǎn)物和 0. 04g/L (<9/?<9^rari05^929 代謝產(chǎn)物混合配方制劑。
【文檔編號】C12R1/465GK104342389SQ201410509460
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】馬正, 俞曉平, 路丹丹, 羅帥, 邊亞琳, 許益鵬, 王正亮, 申屠旭萍 申請人:中國計量學(xué)院