專(zhuān)利名稱(chēng)：Tat與人野生型P53融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種融合蛋白質(zhì)的制備，特別是涉及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat)與人野生型P53融合蛋白(Tat-p53)的制備，以及純化Tat_p53融合蛋白的方法。
背景技術(shù)：
:人類(lèi)P53基因位于17pl3.1染色體，全長(zhǎng)16 20kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，是研究得最廣泛，最深入的抑癌基因，也是迄今發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)性最高的基因。P53基因編碼產(chǎn)物即為P53蛋白，是一種核酸蛋白，由393個(gè)氨基酸組成，分子量為43.7KDa。由于富含大量脯氨酸，在SDS-PAGE中顯示的分子量為53KDa，起初命名為P53，沿襲至今。P53分為野生型和突變型，野生型P53 (wild-type P53, wtP53)是細(xì)胞中最重要的腫瘤抑制劑，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，以“分子警察”的身份監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)DNA的狀態(tài)，阻止受損DNA繼續(xù)復(fù)制，抑制細(xì)胞惡性增殖，通過(guò)誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯或細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，保證遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。突變型P53是一種異常蛋白，能與人組織的各種病毒蛋白、熱休克蛋白等結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物，或通過(guò)突變、重排、丟失等形式失活，DNA損傷不能被修復(fù)，細(xì)胞遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。P53基因是體內(nèi)最重要的抑癌因子之一，人類(lèi)惡性腫瘤中有一半以上存在P53基因的突變和缺失，它的結(jié)構(gòu)改變和功能異?？赡苁沁@些腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。P53蛋白是一種磷酸化蛋白，半衰期短，只有20 30min，在正常細(xì)胞的細(xì)胞核中幾乎檢測(cè)不到。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，wtP53蛋白是最重要的腫瘤抑制劑。因此，P53蛋白在腫瘤發(fā)生中作用機(jī)制的闡明，將為臨床腫瘤的預(yù)防、診斷和治療提供可靠的理論依據(jù)。通過(guò)導(dǎo)入wtP53來(lái)重建細(xì)胞內(nèi)變異的P53已成為腫瘤治療的新策略。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，野生型P53的導(dǎo)入對(duì)多類(lèi)腫瘤產(chǎn)生明顯的抑制作用。但是由于wtP53屬于非分泌型蛋白，細(xì)胞膜上不存在P53受體或配體，P53很難穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，進(jìn)而達(dá)不到治療目的。國(guó)內(nèi)外大部分的研究主要集中在通過(guò)載體將P53基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)，缺點(diǎn)是導(dǎo)入的載體存在不安全性因素。因此如何能使P53基因編碼產(chǎn)物P53蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，避免導(dǎo)入載體的不安全性并且不影響P53蛋白的活性是應(yīng)用wtP53治療腫瘤需要解決的問(wèn)題。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat)，Tat蛋白是人類(lèi)免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的反式激活因子，它是一種正調(diào)控蛋白質(zhì)，可以很大程度地提高HIV-1基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平，還能調(diào)節(jié)基因以及細(xì)胞的行為。作為新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，Tat蛋白能高效地介導(dǎo)與其共價(jià)連接的DNA、多肽、蛋白質(zhì)等分子進(jìn)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，甚至可以通過(guò)血腦屏障，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有損傷，并且能保持蛋白的生物活性。Tat融合蛋白系統(tǒng)被認(rèn)為是一種很有如途的 聞效運(yùn)載工具，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床治療方面都有著非常廣闊的應(yīng)用前景。Tat蛋白可以引導(dǎo)多種多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)入幾乎所有的靶細(xì)胞，這即是Tat蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，又稱(chēng)為內(nèi)化作用。Tat蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用主要依賴(lài)于多肽或蛋白質(zhì)的濃度，而不同于一般的通道、受體、內(nèi)吞作用的的入胞方式。由于具有這一功能，Tat可被用來(lái)作為介導(dǎo)外源蛋白通過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)載工具，因此日益受到人們的重視。Tat介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程不依賴(lài)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和受體，也不需要能量，即使在4°C下仍然可以順利進(jìn)行。目前，推測(cè)這一過(guò)程和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中堿性氨基酸(精氨酸和賴(lài)氨酸)的存在有關(guān)，這些氨基酸帶有很強(qiáng)的正電荷，可能通過(guò)直接與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜脂類(lèi)相互作用而介導(dǎo)穿膜過(guò)程。這也使得其可以導(dǎo)入幾乎所有的細(xì)胞，甚至還可以通過(guò)血腦屏障。近來(lái)，應(yīng)用這一技術(shù)已成功將分子量約15 120KD的數(shù)十種融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。操作中只需將與Tat-PTD融合的分子直接加入到組織培養(yǎng)介質(zhì)中，15min內(nèi)細(xì)胞內(nèi)可達(dá)到最大濃度，且每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度近乎相同。由此，應(yīng)用Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)外源蛋白既可以通過(guò)控制作用時(shí)間精確控制細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度，通常20 200 u mol/L的蛋白終濃度即可產(chǎn)生生物學(xué)表型。因此，與將蛋白引入細(xì)胞的傳統(tǒng)方法如微注射、穿孔蛋白及脂質(zhì)體法等相比，Tat-PTD介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)有著顯著的優(yōu)越性。目前，對(duì)Tat蛋白能夠有效的介導(dǎo)基因、多肽、蛋白質(zhì)以及一些其它的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還不是很清楚。相關(guān)研究推測(cè)，它以低親和力與細(xì)胞上的受體相結(jié)合，通過(guò)破壞細(xì)胞質(zhì)膜，以非內(nèi)吞途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。本發(fā)明獲得的Tat_p53融合蛋白可通過(guò)Tat介導(dǎo)野生型p53蛋白進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，既不影響P53蛋白的活性，又可避免通過(guò)載體導(dǎo)入p53到細(xì)胞內(nèi)引起的不安全因素，為腫瘤的治療開(kāi)辟一個(gè)全新的設(shè)計(jì)思路與途徑。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為新近發(fā)展起來(lái)的新型表達(dá)系統(tǒng)具有很多顯著優(yōu)點(diǎn):(I)高表達(dá):由于表達(dá)載體利用特有的AOXl啟動(dòng)子，是目前最強(qiáng)、調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一，用甲醇可以嚴(yán)格地調(diào)控表達(dá)。(2)高穩(wěn)定:表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合；完備的發(fā)酵方法，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，其轉(zhuǎn)化子能夠非常穩(wěn)定地表達(dá)外源蛋白質(zhì)，產(chǎn)量高。(3)高分泌:將白蛋白信號(hào)肽用于畢赤酵母表達(dá)載體，具有很好的分泌效果，大量外源蛋白被分泌到培養(yǎng)基中，而酵母本身只分泌少量蛋白，這樣有利于產(chǎn)品的分離。⑷對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行信號(hào)序列的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成、某些脂質(zhì)的加入、糖基化等翻譯后的修飾，更接近于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。(5)遺傳背景清楚，生長(zhǎng)繁殖迅速，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)?；谏鲜鲈?，我們選擇適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的畢赤酵母建立重組Tat-p53融合蛋白真核表達(dá)體系
發(fā)明內(nèi)容
: 本發(fā)明旨在用分子克隆的方法制備一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat)與人野生型P53的融合蛋白，使P53突破細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種集Tat與人野生型P53的特性于一體的Tat_p53融合蛋白。本發(fā)明的Tat與人野生型P53融合蛋白是包括與天然Tat序列相同區(qū)域和與人野生型P53序列相同的另一區(qū)域。在本發(fā)明的融合蛋白中，可以是與天然Tat同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端，與人野生型P53同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端；也可以是與天然Tat同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端，與人野生型P53同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端。本發(fā)明的另一目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。包括與天然Tat氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人野生型P53氨基酸殘基序列相同的區(qū)域構(gòu)成的融合蛋白的DNA序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括pPICZa質(zhì)粒、pET系列載體、pcDNA3.1質(zhì)粒等。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于表達(dá)本發(fā)明融合蛋白編碼基因的宿主。本發(fā)明的宿主可以是被重組表達(dá)載體或重組表達(dá)載體的一部分轉(zhuǎn)化，含有本發(fā)明融合蛋白編碼基因的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母X-33。本發(fā)明將Tat與人野生型P53融合，所形成的融合蛋白既保留了 Tat能高效地介導(dǎo)與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)等分子跨膜組織和細(xì)胞的功能，又保留了野生型P53抑制腫瘤的活性。因此本發(fā)明的融合蛋白既可以通過(guò)Tat介導(dǎo)P53突破細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，又可以使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的P53具有抑制腫瘤的活性。編碼天然Tat的多聚核苷酸和編碼人野生型P53的多聚核苷酸可以用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫(kù)的方法等獲得，用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的mRNA或cDNA可以來(lái)源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞及文庫(kù)等。也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時(shí)可選用宿主偏愛(ài)的密碼子，這樣可以提高產(chǎn)物的表達(dá)。若需要可采用本領(lǐng)域周知的方法對(duì)多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。編碼天然Tat和編碼人野生型P53的多聚核苷酸的融合，在保持各自閱讀框不變的前提下，可以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過(guò)PCR的方法，在編碼序列的兩側(cè)引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，通過(guò)酶切產(chǎn)生粘性末端，或直接人工合成基因時(shí)引入適當(dāng)?shù)恼承阅┒耍幋a天然Tat和編碼人野生型P53的多聚核苷酸的粘性末端用DNA連接酶連接，從而獲得編碼融合 蛋白的基因。如果需要可在本發(fā)明的融合蛋白基因兩側(cè)引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸含有限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的基因序列克隆到各種表達(dá)載體中去。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過(guò)程見(jiàn)J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002)的敘述。許多表達(dá)載體和其對(duì)應(yīng)的宿主可以從公司購(gòu)得，如酵母表達(dá)載體pPICZa，pPIC9，pHIL-sl (Invitrogen Corp.San Diego, California, USA.)等。優(yōu)選的方法是將編碼本發(fā)明中的融合蛋白或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表達(dá)載體，本發(fā)明的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可以是胞內(nèi)表達(dá)的，也可以是分泌表達(dá)的。這些載體都包括一個(gè)由0.9kb的5'醇氧化酶操縱子(AOXl)序列片段和約0.3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3'序列組成的表達(dá)盒，用于方便編碼目的蛋白的基因整合至酵母染色體和控制目的基因的表達(dá)。分泌型表達(dá)載體可以是 pPIC9，pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6 等；胞內(nèi)表達(dá)的載體可以是 pHIL_D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHW010E121，pGAPZ、pGAPZa 等。本發(fā)明優(yōu)選的是 pPICZ a。表達(dá)融合蛋白的宿主可以是酵母、細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等，本發(fā)明優(yōu)選的是酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來(lái)，優(yōu)選的是從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)。本發(fā)明優(yōu)選的信號(hào)肽是白蛋白信號(hào)肽。編碼融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。得到攜帶融合蛋白基因的重組表達(dá)載體后，可使用通常的方法，如:鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)球法和電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。其中，本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是電穿孔法。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過(guò)人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如收集并裂解細(xì)胞，提取DNA，然后用PCR方法鑒定?；蛘撸?xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞破碎液中的蛋白可用抗人P53抗體檢測(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主，如重組酵母、重組細(xì)菌、重組動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以使用搖瓶或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時(shí)優(yōu)選的是生物反應(yīng)器。培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)所需的物質(zhì)，包含氮源、碳源、PH調(diào)節(jié)成分等，培養(yǎng)基配方應(yīng)根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)試驗(yàn)獲得。培養(yǎng)可分為兩個(gè)階段，第一階段主要用于菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)，第二階段主要用于產(chǎn)物的合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)菌或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用分子篩、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，按照本發(fā)明方法制備的融合蛋白Tat_p53對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2、乳腺癌細(xì)胞SK0V3的增殖有明顯的抑制作用，促進(jìn)其凋亡。本發(fā)明中的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是單不局限于其不同形式的鹽、修飾后產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進(jìn)行修飾。所用的修飾劑可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本發(fā)明中的融合蛋白及其衍生物可以單獨(dú)使用，優(yōu)選的為與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應(yīng)與融合蛋白相容且不能對(duì)受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類(lèi)、醇類(lèi)或氨基酸，它們須無(wú)菌且無(wú)致熱原。藥物制劑可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括將融合蛋白與一種或多種輔助成分混合的步驟。優(yōu)選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類(lèi)，小分子糖類(lèi)等。本發(fā)明 中的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以通過(guò)任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入、口服等方法給藥。優(yōu)選的方法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時(shí)間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1P53基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖譜:泳道I為DL2000為DNA分子量標(biāo)識(shí)物；泳道2為擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。圖2真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZ a C_Tat_p53酶切消化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜:泳道I為重組質(zhì)粒pPICZ a -Tat-P53 ;泳道2為重組質(zhì)粒pPICZ a -Tat_P53酶消化產(chǎn)物；DL2000為DNA分子量標(biāo)識(shí)物。圖3重組質(zhì)粒pPICZa C-Tat_p53PCR轉(zhuǎn)化酵母菌DNA的PCR鑒定電泳圖譜:DL2000為DNA分子量標(biāo)識(shí)物；泳道I為pPICZ a C轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA的PCR產(chǎn)物；泳道2未轉(zhuǎn)化的X-33酵母菌基因組DNA的PCR產(chǎn)物；泳道3 11為不同酵母菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR產(chǎn)物.
圖4SDS-PAGE電泳篩選融合蛋白Tat_p53最佳誘導(dǎo)時(shí)間圖譜:BM為寬分子量蛋白Marker ;泳道I 7分別為篩選出的高表達(dá)轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)24h，48h，72，96h，120h，144h，168h后的電泳圖譜。
圖5SDS-PAGE電泳篩選融合蛋白Tat_p53最佳誘導(dǎo)pH值圖譜:BM為寬分子量蛋白Marker ;泳道I 9分別為篩選出的高表達(dá)轉(zhuǎn)化子經(jīng)不同pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0,6.5,7.0誘導(dǎo)后的電泳圖譜。。圖6Tat_p53融合蛋白純化的SDS-PAGE膠電泳圖譜:泳道I為寬分子量蛋白Marker ;泳道2為純化后的Tat_p53融合蛋白。圖7純化Tat_p53融合蛋白的Western blot結(jié)果；泳道I為寬分子量蛋白Marker ;泳道2-3為轉(zhuǎn)膜后經(jīng)抗體孵育顯色的Tat-p53融合蛋白。泳道4_5為R250染色后顯色的Tat-p53 蛋白(SDS-PAGE)。圖8流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果；圖A，左側(cè)圖為SK0V3細(xì)胞未加藥物的空白對(duì)照組，右側(cè)圖為SK0V3細(xì)胞加藥組，圖中C3代表正 常細(xì)胞數(shù)量，C4代表細(xì)胞凋亡數(shù)量。圖B，左側(cè)圖為H印G2未加藥物的空白對(duì)照組，右側(cè)圖為H印G2加藥組，圖中C3代表正常細(xì)胞數(shù)量，C4代
表細(xì)胞凋亡數(shù)量。
具體實(shí)施例方式以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。本發(fā)明利用基因工程方法將人野生型P53基因全長(zhǎng)cDNA與近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat)融合。Tat能高效地介導(dǎo)與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)等分子跨膜導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很高而且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷，并保持蛋白的生物活性。將其插入到真核表達(dá)載體pPICZ a C的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建了 pPICZa C-Tat_p53重組體，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染畢赤酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)能表達(dá)Tat_p53融合蛋白，經(jīng)離子交換層析純化獲得了Tat-p53融合蛋白，純化的Tat-p53融合蛋白可溶于水，并可在_20°C長(zhǎng)期保存。實(shí)施例1:Tat_P53基因的克隆1.1RNA 的制備:取肝臟組織放入液氮中速凍。使用Trizol試劑(Invitrogen Corp.San Diego,California, USA.),一步法方法提取肝組織的RNA。具體步驟如下:I)取出冰凍的小塊肝臟組織放入盛有液氮的研缽中，將其研磨至粉末狀。2)將碾碎的組織移入1.5ml無(wú)RNA酶EP管中，加入約Iml Trizol。3)加入200 U I氯仿，劇烈振蕩搖勻，室溫下放置30s。4)4°C 離心(12 000r/min) 5min05)將上清液小心轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)RNA酶的EP管中。6)加入等體積異丙醇,室溫放置5min。7)4°C離心(12 000r/min) 5min,棄上清。8)加入70%乙醇Iml洗滌沉淀兩次，4°C離心(12 000r/min) 5min。9)室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇。10)將總RNA沉淀溶于50 u I DEPC水中，而后進(jìn)行RNA的分析與定量。11)取I ill樣品稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD26tl和OD28tl,計(jì)算其濃度和純度。RNA含量按下面公式計(jì)算:
RNA ( μ g/ml) = 40 X OD260 X 稀釋倍數(shù)OD260/OD280 = 1.8 2.0 表不純度合格12)瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。1.2Tat-P53 基因的克隆(RT-PCR 法)取如上提取的人肝臟組織總RNA I μ g，按如下比例建立逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系:人肝臟組織總RNA I μ g ; 10 X RNA PCR 緩沖液 2 μ I ；MgCl2 (25mmol/L) 4 μ I ;RNA 酶抑制劑(40υ/μ 1)0.5μ I ;dNTPs (各 10mmol/L)2y I ;AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I) I μ I ；01igodT(20pmol/y 1)1μ I ;無(wú)RNA酶滅菌水加入至終體積20 μ I。于PCR儀上50°C反應(yīng)30min，然后94°C 2mi n滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA后，按照如下比例建立PCR反應(yīng)體系:上述cDNA 反應(yīng)液 20 μ I ；MgCl2 (25mmol/L) 6 μ I ; 10 X LA PCR 緩沖液8μ I ;上游引物:5，-tcgcgaggtgtgtttcgtcgatacggtagaaagaagcgtcgacaacgtaggcgtatggaggagccgcagtcaga-3’(包含P53前端序列，全部Tat序列以及部分白蛋白信號(hào)肽序列)(SEQ ID NO:1), I μ I (20pmol/y I);下游引物:5，-caggtacctcagtctgagtcaggcc-3，(包含末端 P53 序列及酶切位點(diǎn) Kpn I)(SEQ ID NO:2)，I μ I (20pmol/μ I) ；TaKaRa LA Taq (5U/ μ I) I μ I ;;滅菌超純水至終體積100 μ I。PCR 反應(yīng)條件是:94V 5min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 72°C lmin，94°C 30s, 53°C 30s,72°C lmin，共16個(gè)循環(huán)；72°C 5min。以上述PCR產(chǎn)物為模版進(jìn)行第二步PCR反應(yīng)，應(yīng)用上游引物:5’ -ggttcgaaacgatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcgcgaggtgtgtttcgt-3’ (包含另一部分白蛋白信號(hào)肽序列,酶切位點(diǎn)Bstb I) (SEQ ID NO:3),
Iμ I (20pmol/ μ I);下游引物:5，-caggtacctcagtctgagtcaggcc-3，(SEQ ID NO:2),PCR 反應(yīng)條件是:94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，共 16 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μ 1，在I %瓊脂糖凝膠中電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，并用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)檢查特異性擴(kuò)增條帶大小(圖1)。1.3PCR產(chǎn)物的純化用D0UPS0N瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒V3.0純化回收，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)施例2:畢赤酵母分泌型表達(dá)載體Tat-P53_pPICZ α表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.2Tat-P53-pPICZ α 表達(dá)載體的構(gòu)建用Bstb I和Kpn I消化上述切膠回收的PCR產(chǎn)物Tat_P53和載體pPICZ α，瓊脂糖凝膠電泳定量后，16°C連接過(guò)夜。連接反應(yīng)體系如下:目的基因0.1 0.3pmol ;酶切后的載體PPICZ α 0.03pmol ；10X連接緩沖液I μ I ;T4DNA連接酶(350U/y I) I μ I ;滅菌超純水至終體積10 μ I。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞XLl-blue輕輕混勻，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化。取200 μ I已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞涂布于含Zeocin (25 μ g/ml)的低鹽LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 16h。挑取不同的克隆，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，而后，提取質(zhì)粒，以Bstb I和Kpn I雙酶切鑒定(圖2)。選取酶切鑒定正確的克隆，用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒。進(jìn)行DNA序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示插入pPICZ α載體中的序列如下:ttcgaaacgatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcgcgaggtgtgtttcgtcgatacggtagaaagaagcgtcgacaacgtaggcgtatggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgetccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgcccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagactga(SEQ ID NO:4),此序列包括白蛋白信號(hào)肽序列、Tat序列和人wtP53基因序列。構(gòu)建成功的表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，獲得的融合蛋白序列為:YGRKKRRQRRRMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD(SEQ ID NO:5)實(shí)施例3:Tat-P53融合蛋白畢赤酵母表達(dá)體系的建立及篩選3.lTat-P53_pPICZ α表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母取測(cè)序正確的培養(yǎng)菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量分析。取20 25 μ g表達(dá)載體Tat-P53_pPICZ α經(jīng)SacI酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10 μ I超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母Χ-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于5ml YPD培養(yǎng)基中，250rpm，30°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，以常規(guī)制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。然后取80 μ I上述感受態(tài)菌，與5 IOyg線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒混合，移入
0.2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50 100 μ I轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin(100 μ g/ml)的YPD平板上，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3d，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。3.2PCR方法篩選Tat_p53_pPICZ a C陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株離心回收9個(gè)不同菌體，用煮-凍-煮法提取酵母基因組DNA做PCR鑒定。用5’Α0X1(5，_gactggttccaattgacaagc_3，)(SEQ ID NO:6)和3，A0X1(5，-gcaaatggca1:tctgacatcc-3，) (SEQ ID NO:7)為引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:94°C 2min ；94°C 30s,60°C 30s,72°C 90s, 30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否得到預(yù)期大小的基因片段。(圖3)實(shí)施例4:Tat-p53融合蛋白的表達(dá)和純化4.lTat-p53融合蛋白的表達(dá)取上述鑒定結(jié)果陽(yáng)性的克隆接種于IOml BMGY(pH6.0)培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)24h，至OD600達(dá)到2.0 6.0時(shí)收集細(xì)胞。用等體積(IOml)BMMY(pH6.0)重懸細(xì)胞沉淀，30°C震蕩培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)過(guò)程中，每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%,同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)各取0.5ml發(fā)酵液,離心取上清用于蛋白質(zhì)分析(SDS-PAGE, Western Blot等)。分別取不同工程菌液用于SDS-PAGE分析，在凝膠分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，篩選高表達(dá)量的Tat-p53工程菌。4.2確定畢赤酵母分泌表達(dá)Tat_p53的最佳誘導(dǎo)時(shí)間(I)選擇高表達(dá)Tat_p53工程菌接種于IOmlBMGY培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，至OD600達(dá)2.0 6.0收集細(xì)胞；(2)等體積(IOml)BMMY重懸細(xì)胞沉淀，30°C振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌二蒸水，使發(fā)酵液總體積保持不變；(3)在培養(yǎng)他、2411、4811、7211、9611、12011、14411、16811時(shí)間點(diǎn)各取11111發(fā)酵液，離心菌體，上清用于蛋白分析；(4) SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為120h (圖4)。4.3篩選畢赤酵母 分泌表達(dá)Tat_p53的最佳pH值(I)選取Tat_p53表達(dá)量較高的畢赤酵母工程菌，在IOml YB)培養(yǎng)基中28°C、225r/min振蕩培養(yǎng)24h ；(2)將擴(kuò)增的畢赤酵母工程菌接種于100ml BMGY中，pH值為6.0、28°C、225r/min振蕩培養(yǎng)30h左右，使其0D_ = 5。此做法的優(yōu)點(diǎn)是:使酵母擴(kuò)增的起始條件相同，為以后確定誘導(dǎo)最佳pH值奠定基礎(chǔ)；(3)室溫離心(3000r/min) 5min,棄去上清,加入前述未加緩沖液的BMMY 9ml,按下表的量加入lmol/L Na2HPO4和0.5mol/L檸檬酸配制成不同pH值的BMMY，30°C、225r/min振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過(guò)程中每24h補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌蒸餾水，使發(fā)酵液總體積保持不變；表2.1不同pH的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配方
權(quán)利要求
1.一種集天然Tat與人野生型P53的特性于一體的Tat-P53融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白包括與天然Tat氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人野生型P53氨基酸殘基序列相同的另一區(qū)域，或上述二區(qū)的功能同等物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集Tat與野生型P53的特性于一體的Tat-P53融合蛋白，其特征在于:所述與天然Tat氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-末端，所述與人野生型P53氨基酸殘基序列同源的另一區(qū)域位于融合蛋白的C-末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集Tat與野生型P53的特性于一體的Tat-P53融合蛋白，其特征在于:所述與天然Tat氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-末端，所述與人野生型P53氨基酸殘基序列同源的另一區(qū)域位于融合蛋白的N-末端。
4.編碼權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)限定的融合蛋白的DNA序列。
5.攜帶權(quán)利要求4中所述DNA序列的重組表達(dá)載體。
6.含權(quán)利要求5所述DNA的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等，其中優(yōu)選的是酵母細(xì)胞，更優(yōu)選的是畢赤酵母， 最優(yōu)選的是畢赤酵母X-33。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白質(zhì)的制備，特別是涉及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Tat)與人野生型P53融合蛋白(Tat-p53)的制備，以及純化Tat-p53融合蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103145845SQ20111039922
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者顏煒群 申請(qǐng)人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司