專利名稱：一種新的制備TAT-Oct4的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人0ct4的融合蛋白(TAT-0ct4)的方法。
背景技術(shù)：
0ct4是一種具有很強(qiáng)特異性的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，而且在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中0ct4起著嚴(yán)密的不可替代的調(diào)控作用。人的0ct4基因長(zhǎng)度是16.40kb，位置在6號(hào)染色體上(6p21.31)。0ct4也稱為0ct3是由Pou5Fl基因編碼產(chǎn)生的一種蛋白，屬于V類POU蛋白，是一種POU轉(zhuǎn)錄因子。POU轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白，其構(gòu)成主要包括POU保守結(jié)構(gòu)域(POUS)和POU同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)，由15 55個(gè)氨基酸序列中間連接。N端的POU家族特有保 守結(jié)構(gòu)域(POUs)大約由74 82個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，C端的同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)大約60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。在POU保守結(jié)構(gòu)域(POUS)和POU同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)都有一個(gè)各有脯氨酸富集區(qū)域，這兩個(gè)脯氨酸的富集區(qū)域是0ct4因子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)。0ct4是維持細(xì)胞多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其主要是通過調(diào)控自身下游靶基因而參與正常發(fā)育過程，在胚胎早期發(fā)育中起著極其關(guān)鍵的作用。有研究認(rèn)為0ct4基因與胚胎干細(xì)胞(ES)細(xì)胞分化密切相關(guān)，多能干細(xì)胞的數(shù)量受到0ct4控制。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ES細(xì)胞中0ct4基因的表達(dá)水平受到人為的調(diào)控可使ES細(xì)胞向不同方向分化。2006年日本科學(xué)家Takahashi和Yamanaka通過對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子的篩選,最后利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將轉(zhuǎn)錄因子0ct4等4種轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞，成功地將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。隨著iPS技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究證明通過轉(zhuǎn)錄因子0ct4單獨(dú)誘導(dǎo)重編程也成功得到iPS細(xì)胞，這進(jìn)一步證明了 0ct4在細(xì)胞重編程過程中起著極其關(guān)鍵的作用。然而，現(xiàn)有的方法幾乎都是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，由于引入外源DNA的引入容易引起宿主細(xì)胞突變，這一現(xiàn)象是當(dāng)前iPS技術(shù)發(fā)展中的一個(gè)重要難題。能夠通過耗能或非耗能形式穿過多種細(xì)胞膜的小分子多肽(其長(zhǎng)度一般不超過30個(gè)氨基酸)被命名為穿膜肽。1988年，Green等和Frankel等首次報(bào)道了 HIV-1的反式激活蛋白TAT具有主動(dòng)穿過多種細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的作用。隨著不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)穿膜肽除了自身能透過多種細(xì)胞膜，還能攜帶比自身分子量大很多倍的寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且對(duì)宿主細(xì)胞沒有明顯的毒副作用。穿膜肽已成為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)研究域的一個(gè)新的熱點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)的融合蛋白目的是替代現(xiàn)有的利用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染的方式來獲得誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，利用穿膜肽TAT特有的生物學(xué)活性，使0ct4直接作用于宿主細(xì)胞，從根本上避免了利用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染的方式將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞帶來的突變等各種不良后果。巴斯德畢赤酵母是低等真核生物，于20世紀(jì)80年代初開發(fā)獲得。巴斯德畢赤酵母具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。因此巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用。巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)；(I)具有乙醇氧化酶AOXl基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子
之一 O(2)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。(3)菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。(4)巴斯德畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。(5)營養(yǎng)要求低,培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。(6)屬于單細(xì)胞生物，故保留了易于操作和生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)。(7)表達(dá)的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很低，十分有利于目的產(chǎn)物純化。(8)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的正確加工和修飾。甲基營養(yǎng)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達(dá)系統(tǒng)，并已被用于表達(dá)許多有用的蛋白質(zhì) 。例如，美國專利5，324，639公開了在甲基營養(yǎng)酵母特別是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)胰島素樣生長(zhǎng)因子I的方法；美國專利5，330，901公開了使用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)人血清白蛋白的方法；美國專利5，965，389提供了在甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構(gòu)建體以及由之制備純的GAD65的方法；美國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)血小板衍生的細(xì)胞因子(TOGF)的方法；美國專利6，780，615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)應(yīng)樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關(guān)于使用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)融合蛋白TAT-0ct4的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人0ct4的融合蛋白(TAT-0ct4)的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種集TAT與人0ct4的特性于一體的TAT_0ct4融合蛋白。本發(fā)明的TAT與人0ct4融合蛋白是包括與天然TAT序列相同區(qū)域和與0ct4序列相同的另一區(qū)域。在本發(fā)明的融合蛋白中，可以是與天然TAT同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端，與人0ct4同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端；也可以是與天然TAT同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端，與人0ct4同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端。 本發(fā)明的另一目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。包括與天然TAT氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人0ct4氨基酸殘基序列相同的區(qū)域構(gòu)成的融合蛋白的DNA序列。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)融合蛋白TAT_0ct4多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的:(I)甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(2)編碼TAT_0ct4的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和
(4)可選擇標(biāo)志，從而以至少120mg/L培養(yǎng)基的濃度產(chǎn)生TAT-0ct4多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于表達(dá)融合蛋白TAT_0ct4的甲基營養(yǎng)酵母，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長(zhǎng)，并且是被包括甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼TAT-0ct4的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中TAT_0ct4多肽的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件:甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼TAT-0ct4的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白非常少，而且培養(yǎng)基中不含有其他的蛋白質(zhì)，因此巴斯德畢赤酵母分泌的外源蛋白是培養(yǎng)液中總蛋白的主要成份，這樣大大降低了對(duì)所獲得外源蛋白進(jìn)行分離和純化的難度，所以分泌表達(dá)外源蛋白是一種理想的方式。為了達(dá)到這一目的，本發(fā)明所使用的信號(hào)是經(jīng)過優(yōu)選的α因子信號(hào)肽。α因子信號(hào)肽序列來自于啤酒酵母(S.cerevsia)的 α性成熟因子前導(dǎo)序列，由87個(gè)氨基酸組成，并且已將這段序列編碼的信號(hào)肽插入到巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體中。巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體可以是胞內(nèi)表達(dá)載體，也可以是分泌表達(dá)載體。無論是表達(dá)載體還是分泌載體都包括一個(gè)由0.9kb的5’ AOXl序列片段和約0.3kb的轉(zhuǎn)錄終止基因的3’序列組成的表達(dá)盒。胞內(nèi)表達(dá)載體包括PHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHW010E12U pGApZ、pGAPZ α 等。分泌載體包括 pPIC9、pPIC9k、、pPICZ α、PYAM75P6E6。所以本發(fā)明優(yōu)先選擇分泌型、高拷貝標(biāo)記和易操作的穿梭載體，特別是pPICZa作為融合蛋白TAT_0ct4的表達(dá)載體。一般用于外源基因表達(dá)的巴斯德畢赤酵母菌株包括￥-11430^-6100-3、65115、枷71、51 1168等，本發(fā)明優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母X-33菌株。巴斯德畢赤酵母X-33菌株具有典型高等真核生物的多種翻譯后修飾功能。其中包括信號(hào)肽的加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵的形成、N-型糖基化等。得到攜帶TAT-0ct4基因的重組表達(dá)載體后，可使用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)球法和電穿孔法等方法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選了相對(duì)于其他轉(zhuǎn)化方法最為方便、快捷的電轉(zhuǎn)移法。重組表達(dá)載體導(dǎo)入酵母體內(nèi)后只有與酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在并得以表達(dá)。本發(fā)明中，為了穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，可以在His或5’ AOXl的單酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒載體線性化(SacI)，使之通過單交換整合到酵母細(xì)胞染色體中，從而得到表型為Mut+并具有高甲基利用能力的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)可以使用的培養(yǎng)基有BMG/BMM、BMGY/BMMY、MGY/MMY等培養(yǎng)基，經(jīng)過優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)所選的培養(yǎng)基的是成分中含有緩沖液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培養(yǎng)基。甲醇作為唯一的碳源和能源，加入量一般為培養(yǎng)體積的0.5 L 0% (V/V)。
本發(fā)明首次在巴斯德畢赤酵母(畢赤酵母X-33)中高效分泌表達(dá)了融合蛋白TAT-0ct4，建立了穩(wěn)定的融合蛋白TAT-0ct4畢赤酵母高效表達(dá)體系。與在大腸桿菌中的表達(dá)相比，本發(fā)明的方法具有如下特點(diǎn):①表達(dá)體系穩(wěn)定，含目的基因的表達(dá)盒通過同源重組整合進(jìn)入酵母的染色體中，菌種穩(wěn)定，不存在質(zhì)粒丟失的問題；②有效的分泌表達(dá)，目的蛋白質(zhì)的表達(dá)受醇氧化酶啟動(dòng)子的嚴(yán)格控制，可在甲醇誘導(dǎo)下啟動(dòng)表達(dá)并將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，而且巴斯德畢赤酵母本身的蛋白很少分泌到培養(yǎng)基中，使目的蛋白更易于純化；③不存在內(nèi)毒素污染問題；本發(fā)明建立了在巴斯德畢赤酵母中高效分泌表達(dá)TAT_0ct4的方法，使用SDS-PAGE, Western印跡分析證實(shí)了按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的TAT_0ct4的理化性質(zhì)，從而為進(jìn)一步檢測(cè)其體內(nèi)外生物學(xué)活性提供了必要條件。在以上研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步探討了巴斯德畢赤酵母工程菌制備TAT_0ct4的方法，優(yōu)化了利用巴斯德畢赤酵母菌制備融合蛋白TAT-0ct4的條件，其中所使用的優(yōu)化條件包括:培養(yǎng)溫度維持在30°C、所使用·的pH值為7.5、并且培養(yǎng)基中添加有2% (W/V)的蛋白胨。本發(fā)明建立了巴斯德畢赤酵母工程菌高效表達(dá)制備融合蛋白TAT_0ct4的方法。本發(fā)明將TAT與人0ct4融合，所形成的融合蛋白既保留了 TAT能高效地介導(dǎo)與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)等分子跨膜組織和細(xì)胞的功能，又保留了 0ct4單獨(dú)誘導(dǎo)重編程，進(jìn)而得到類似iPS細(xì)胞的活性。因此本發(fā)明的融合蛋白既可以通過TAT介導(dǎo)0ct4突破細(xì)胞膜而進(jìn)入宿主細(xì)胞，又可以使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的0ct4具有誘導(dǎo)重新編程的作用。本發(fā)明的研究結(jié)果將為融合蛋白TAT-0ct4的高密度工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)。


圖1顯示重組質(zhì)粒pPICZ a /TAT_0ct4轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌的PCR鑒定電泳圖譜。其中泳道I是DNA分子量標(biāo)志物(DL2000);泳道2是未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母菌X33基因組DNA的PCR產(chǎn)物；泳道3是空白質(zhì)粒pPICZ α轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌基因組DNA的PCR產(chǎn)物；泳道4 25是不同巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2顯示時(shí)間對(duì)TAT_0ct4表達(dá)的影響(SDS-PAGE分析)。其中泳道I 7分別為O、24、48、72、96、120、144小時(shí)，泳道8是Takara蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物，泳道9 11分別為168、192、216小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)上清，在192小時(shí)表達(dá)量最大。圖3顯示pH值對(duì)TAT-0ct4表達(dá)的影響(SDS-PAGE分析)。其中泳道I 7分別為ρΗ3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、泳道8是Takara蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物，泳道9 11分別為ΡΗ7.0,7.5,8.0條件下，誘導(dǎo)表達(dá)120h上清。最佳pH值為7.5。圖4 顯不 TAT_0ct4 的 Western-blot 分析結(jié)果。I:TAT-0ct4, 2:未轉(zhuǎn)入任何質(zhì)粒的X33陰性對(duì)照，3:轉(zhuǎn)化空pPICZ α空質(zhì)粒的Χ3具體實(shí)施例方式以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例1:0ct4基因的克隆和擴(kuò)增(I)總RNA的提取Trizol法從人肝組織中提取總RNA:將新鮮分離的人肝組織切成約IOOmg大小，立即放入液氮中速凍。按下列方法從組織中提取總RNA。取出冰凍的組織300mg放入盛有液氮的研缽中，將組織碾碎。把碾碎的組織移入50ml離心管中，加入約5mlTrizol，于室溫用勻漿器高速勻漿15 30S。加入1.0ml氯仿(200 μ 1/ml Trizol)，充分振蕩搖勻，室溫放置5min。4°C離心(12000r/min) 15min后將上層水相移至另一離心管中。加入等體積異丙醇，振蕩搖勻，室溫沉淀IOmin, 4°C離心(12000r/min) 15min,棄上清。加入75%乙醇Iml洗滌沉淀2次，4°C離心(12000r/min) 5min,室溫下空氣蒸發(fā)殘存乙醇。將總RNA沉淀溶于50 μ IDEPC處理過的水中，_80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ μ I樣品稀釋100倍后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定Α260和Α280，計(jì)算其濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的完整性。RNA含量按下面公式計(jì)算:RNA 濃度(μ g/ μ I) = Α260 X 40 X 稀釋倍數(shù) /1000Α260/Α280 = 1.8 2.0 表示純度合格(2) 0ct4 基因的克隆(RT-PCI^i)RT 反應(yīng):在0.2mlEP管中加入上述提取的總RNAl μ g，I μ I OligodT，70°C變性lOmin，冰浴lmin，然后加入下列反應(yīng)液:`
MgCl2 4 μ I
10 X RNAPCR 緩沖液 2μ1 RNA酶抑制劑0.5 μ I
dNTP(lramol/L) 2μ I
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ I無RNA酶滅菌超純水加至終體積20 μ I于PCR儀上42°C反應(yīng)60min，然后99°C 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA用于下一步PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng):向上述0.2mlEP管中加入以下反應(yīng)體系:10 X LAPCR 緩沖液 8 μ ILATaq I μ I上游引物Ιμ 下游引物Ιμ 滅菌超純水加至終體積100 μ I此PCR反應(yīng)引物序列如下:上游引物1:5，-CAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGG-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?
①94 度 5min②94 度 30s，61 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 個(gè)循環(huán)③72 度 5min擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小是否與預(yù)期結(jié)果吻合，確定是否得到正確目的基因。(3)克隆載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增回收PCR擴(kuò)增的0ct4基因片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。回收后，將0ct4基因片段與T載體16°C連接過夜。連接反應(yīng)體系包括:0ct4基因片段0.1 0.3pmol ；T載體
0.03pmol ;溶液I (含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑盒)5 μ I ;滅菌超純水至終體積10 μ I。按照常規(guī)方法，從37°C培養(yǎng)16小時(shí)的XL1-Blue陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的LB瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于含有IOOmlLB培養(yǎng)基的IL培養(yǎng)瓶中，以制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并于-80°C凍存?zhèn)溆?。取一份凍存的感受態(tài)細(xì)胞融化后，加入上述連接產(chǎn)物，進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化。再取200 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含X-Gal、IPTG (二者可在涂菌前半小時(shí)涂于LB瓊脂平板表面)和氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 16小時(shí)。(4)重組載體的鑒定隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落(“藍(lán)白篩選”)，接種于含氨芐青霉素(lOOyg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)(225rpm)過夜，然后常規(guī)提取質(zhì)粒DNA。取1μ I溶解的DNA沉淀物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37°C Bstp 1041、EcoR I雙酶消化4小時(shí)，1%瓊脂糖凝膠電泳后根據(jù)內(nèi)切酶譜鑒定正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質(zhì)粒，用于DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示插入T載體中的序列與NCBI上公布的人0ct4序列(登錄號(hào):BC117435.1) 一致。實(shí)施例2:TAT-0ct4畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZ a /TAT_0ct4的構(gòu)建和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化取上述測(cè)序鑒定正確的攜帶人0ct4基因的質(zhì)粒50ng作為模板，通過PCR引入跨膜肽TAT序列和人血清白蛋白信號(hào)肽序列，由于引入的序列較長(zhǎng)，PCR反應(yīng)分兩步進(jìn)行
反應(yīng)I在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?①94 度 5min②94 度 30s，60 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 個(gè)循環(huán)③72 度 5min此PCR反應(yīng)引物序列如下:上游引物2:5’-CTCGGCTTATTCGAGGTGTGTTTCGATACGGTAGAAAGAAGCGTCGACAGCGTCGACGAATG-3’ (SEQ ID NO:3)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
反應(yīng)2在PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?①94 度 5min②94 度 30s，61 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 個(gè)循環(huán)②72 度 5min上游引物3:5， -CTTCGAGGCGATGAAGTGGGTAACCTTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCGCGA-3，(SEQ ID NO:4)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小是否與預(yù)期結(jié)果吻合，確定是否得到正確目的基因。利用上游引物2和上游引物3引入跨膜肽TAT序列和人血清白蛋白信號(hào)肽的部分序列和Bstpl04I位點(diǎn)，并利用下游引物I引入EcoR I位點(diǎn)，PCR引入上述序列和酶切位點(diǎn)后，回收目的片段。用相應(yīng)酶切后，連入用同樣酶切后的質(zhì)粒PPICZ α，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ a /TAT-0ct4，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列測(cè)定分析。測(cè)序結(jié)果顯示插入pPICZ α載體的序列包括人血清白蛋白信號(hào)肽、TAT序列和人0ct4基因序列，具體DNA序列如下:ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCGCGAGGTGTGTTTCGTCGATACGGTAGAAAGAAGCGTCGACAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACTGA(SEQ ID NO:5)含有上述序列的表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母后，經(jīng)酵母表達(dá)獲得的融合蛋白序列為:YGRKKRRQRRRMAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKffVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVffFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQID NO:6)取10 μ g 15 μ g pPICZ α /TAT_0ct4重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶消化(線性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質(zhì)粒用10 μ I超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母Χ-33的YPD陰性培養(yǎng)板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個(gè)菌落，接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，250rpm，30°C震蕩培養(yǎng)8小時(shí)，以常規(guī)方法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。然后取80 μ I上述感受態(tài)菌，與10 μ g 15 μ g線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒混合，移入
0.2cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。取50 μ I 100 μ I轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Zeocin(100 μ g/ml)的YPD平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3天，觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。然后用PCR方法篩選轉(zhuǎn)化酵母菌。離心回收菌體后，提取酵母基因組DNA并進(jìn)行使用上游引物1:5，-CAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGG-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如附圖1所示。實(shí)施例3:TAT-0ct4的表達(dá)及最佳表達(dá)條件的確定(I)融合蛋白TAT-0ct4表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定取上述鑒定結(jié)果陽性的克隆接種IOmlBMGY (pH6.0)培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，至0D_達(dá)到2 .0 6.0時(shí)收集細(xì)胞。用等體積(IOml) BMMY (pH6.0)重懸細(xì)胞沉淀，30°C震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)過程中，每24小時(shí)補(bǔ)充一次甲醇至終濃度0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水，使發(fā)酵液總體積保持不變。在培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144、168、192、216小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)各取1.0ml發(fā)酵液，離心取上清用于SDS-PAGE蛋白質(zhì)分析。結(jié)果如附圖2所示，誘導(dǎo)表達(dá)上清，在192小時(shí)表達(dá)量最大。(2)融合蛋白TAT_0ct4表達(dá)最佳pH的確定畢赤酵母對(duì)培養(yǎng)基的pH適應(yīng)范圍很廣，但是在表達(dá)表達(dá)外源蛋白的過程中，培養(yǎng)液PH對(duì)外源蛋白的表達(dá)有很大的影響。因此，在搖床水平進(jìn)行了表達(dá)TAT-0ct4的pH優(yōu)化，為融合蛋白TAT-0ct4的表達(dá)提供必要參數(shù)。選取表達(dá)量高的融合蛋白TAT-0ct4畢赤酵母工程菌接種于IOmlYPD培養(yǎng)基中，30°C、250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。取上述培養(yǎng)的菌液Iml接種于IOOmlBMGY培養(yǎng)基中30°C、250r/min震蕩培養(yǎng)24 36h。分別取上述菌液IOml置于50ml離心管中，室溫離心(3000r/min) IOmin,棄上清。各管分別加入未加緩沖液的BMMY 9ml，加入Imol.L^1Na2HPO4和0.5mol.Γ1檸檬酸配制成不同pH的BMMY誘導(dǎo)表達(dá)(TAT-0ct4 工程菌分別在 pH 為 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，確定TAT-0ct4表達(dá)的最適pH，30°C、225r/min震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過程中每24h補(bǔ)充甲醇至終濃度為0.5%，同時(shí)補(bǔ)充滅菌去離子水，使培養(yǎng)液總體積保持不變。在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)各取Iml培養(yǎng)液，離心取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析(SDS-PAGE法)。結(jié)果如附圖3顯示，最佳誘導(dǎo)pH值為7.5。實(shí)施例4:TAT-0ct4多肽的理化性質(zhì)鑒定(I)SDS-PAGE 分析用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定和粗略定量分析。方法如下:制膠:按如下比例灌制分離膠和濃縮膠。①12 %分離膠的配制:
超純水3.3ml 30%丙烯酰胺 4.0ml Tris-HCl (pH 值=8.8) 2.5ml10 % 過硫酸按 0.03ml TEMED 0.004ml 10% SDS 0.1ml②濃縮膠的配制:超純水3.4ml 30 % 丙烯酰胺 0.83ml Tris-HCl (pH 值=6.8)0.630ml10 % 過硫酸按 0.05ml TEMED 0.005ml 10% SDS 0.05ml③分別取24h、48h、72h、96h、120、144、168、192h 培養(yǎng)上清按 4: I 比例加入5 X SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸5min。④取出上述樣品，冷卻至室溫后，離心(10000r/min) lmin,取上清每孔加樣50 μ I。⑤50V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到100V，恒壓電泳分離。⑥考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，觀察分析結(jié)果。(2)表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析按照常規(guī)方法將發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥30 60分鐘。將上述NC膜置于平皿中，加入20ml封閉液(含0.2% BSA的TTBS)，室溫輕輕振蕩2 3小時(shí)或4°C封閉過夜。封閉結(jié)束后，將NC膜放入雜交袋中按0.1ml抗體溶液/cm2膜加入兔抗人0ct4抗體，室溫振蕩4小時(shí)。膜用TTBS漂洗5次后，用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體至1: 200 1: 1000，加入雜交袋中，與NC膜一起室溫振蕩4小時(shí)。加入Iml0.3% (W/V)NiCl或CoCl2及10 μ I 30% H2O2溶液。洗膜后，將膜移入顯色液中， 室溫下輕輕搖動(dòng)并觀察顯色反應(yīng)。結(jié)果如附圖4所示，TAT-0ct4可以與人0ct4抗體特異性結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種集天然TAT與人0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白包括與天然TAT氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人0ct4氨基酸殘基序列相同的另一區(qū)域，或上述二區(qū)的功能同等物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集TAT與野生型0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述與天然TAT氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-末端，所述與人0ct4氨基酸殘基序列同源的另一區(qū)域位于融合蛋白的C-末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集TAT與0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述與天然TTAT氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-末端，所述與人0ct4氨基酸殘基序列同源的另一區(qū)域位于融合蛋白的N-末端。
4.編碼權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)限定的融合蛋白的DNA序列。
5.攜帶權(quán)利要求4中所述DNA序列的重組表達(dá)載體。
6.含權(quán)利要求5所述DNA的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等，其中優(yōu)選的是酵母細(xì)胞，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母X-33。
7.權(quán)利要求6所說的畢赤酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化:(I)甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)子；(2)編碼融合蛋白TAT-0ct4的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而以至少120mg/L培養(yǎng)基的濃度得到融合蛋白TAT-0ct4。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人Oct4的融合蛋白(TAT-Oct4)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/62GK103145846SQ20111039925
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者顏煒群 申請(qǐng)人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司