專利名稱：編碼植物轉(zhuǎn)錄因子的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)水稻衍生的環(huán)境脅迫耐受性的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的基因，和利用該蛋白質(zhì)的方法。
現(xiàn)有技術(shù)在自然界中植物具有對(duì)抗各種類型的環(huán)境脅迫例如脫水，高溫，冰凍或鹽脅迫的耐受性機(jī)理。在具有這樣的環(huán)境脅迫耐受性的植物的生產(chǎn)中，已經(jīng)使用了遺傳工程選擇和交配具有脫水，鹽，或低溫耐受性的品系的技術(shù)。但是，這些技術(shù)需要很長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行選擇，其成功率較低。
另一方面，由于在分子水平上闡明了脅迫耐受性的機(jī)理，已經(jīng)利用生物技術(shù)生產(chǎn)脅迫耐受性的植物。例如，已經(jīng)證明當(dāng)將它們暴露于環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞中誘導(dǎo)了脅迫反應(yīng)蛋白質(zhì)例如LEA蛋白質(zhì)，水通道蛋白質(zhì)，或合成相容性溶質(zhì)的合成酶，從而在這樣的脅迫中保護(hù)細(xì)胞。因此，已經(jīng)嘗試了這樣的研究，其中將例如大麥的LEA蛋白質(zhì)或煙草的解毒酶的基因，或滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如糖，脯氨酸，或甘氨酸甜菜堿)的合成酶的基因?qū)氲剿拗髦参?。還嘗試?yán)镁幋a擬南芥的W-3脂肪酸去飽和酶，藍(lán)綠藻的D9-去飽和酶的基因等進(jìn)行研究，這些酶是細(xì)胞膜脂類修飾酶。在上面的研究中，將一個(gè)基因結(jié)合到椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子并且導(dǎo)入到植物。但是重組植物的脅迫耐受性水平是低的并且不穩(wěn)定的。因此，這些植物沒(méi)有投入使用。
另一方面，發(fā)現(xiàn)脅迫耐受性機(jī)理與幾種基因有固有的聯(lián)系(Plant Physiol1157-334(1997))。因此，已經(jīng)嘗試了將同時(shí)激活基因表達(dá)的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因?qū)胫参?，從而加?qiáng)植物的脅迫耐受性的研究(植物細(xì)胞，101-17(1998))。但是，當(dāng)幾個(gè)基因被同時(shí)激活時(shí)，宿主植物的能量變成指導(dǎo)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生或由基因產(chǎn)物導(dǎo)致胞內(nèi)代謝。因此，植物本身的生長(zhǎng)受害或延緩。
相反，本發(fā)明人已經(jīng)分離了結(jié)合到脅迫反應(yīng)元件并且特異性地激活位于來(lái)自于擬南芥的元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，和DREB2B，(日本專利申請(qǐng)待審(公開(kāi))No.2000-60558)。他們報(bào)道在植物中導(dǎo)入并且過(guò)量表達(dá)這些基因能夠給與植物脅迫耐受性，不會(huì)導(dǎo)致植物的生長(zhǎng)延緩(日本專利申請(qǐng)待審(公開(kāi))No.2000-116260)。
將擬南芥分類為雙子葉植物，而許多作物例如水稻，玉米，和小麥分類為單子葉植物。根據(jù)植物進(jìn)化的觀點(diǎn)，雙子葉植物和單子葉植物有許多不同。已經(jīng)證實(shí)擬南芥的DREB1A基因在單子葉植物中也起作用，但是在雙子葉植物中不起作用。因此如果可以分離來(lái)自于單子葉植物的DREB同源基因，可以將環(huán)境脅迫耐受性更有效轉(zhuǎn)移到單子葉植物。
本發(fā)明達(dá)到的目的本發(fā)明的目的之一是從例如水稻等單子葉植物鑒別編碼特異于脅迫耐受性基因的轉(zhuǎn)錄因子的基因，并且利用該基因提供新的環(huán)境耐受性植物。
達(dá)到該目的手段本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了集中的研究以便達(dá)到上述目的。結(jié)果，它們已經(jīng)成功地從水稻基因組鑒別了所有的DREB同源基因。他們也發(fā)現(xiàn)將這些基因?qū)氲狡渌参镲@著加強(qiáng)了它們的脅迫耐受性。這導(dǎo)致完成本發(fā)明。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了下列(1)到(12)。(1)含有下面的DNA(a)或(b)的分離基因(a)含有如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；或(b)與包含一種核苷酸序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述核苷酸序列與含有SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA互補(bǔ)。(2)編碼下面的蛋白質(zhì)(c)或(d)的分離基因(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。(3)根據(jù)上述(1)或(2)所述的基因，其中脅迫是脫水脅迫，低溫脅迫或鹽脅迫。(4)下面的重組蛋白質(zhì)(c)或(d)(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQID NO10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件的下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。(5)根據(jù)上述(4)所述的蛋白質(zhì)，其中脅迫是脫水脅迫，低溫脅迫或鹽脅迫。(6)包括(1)到(3)任一項(xiàng)所述的基因的重組載體。(7)用上述(6)所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。(8)根據(jù)上述(7)所述的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是植物。(9)根據(jù)上述(7)所述的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是單子葉植物。(10)生產(chǎn)調(diào)節(jié)位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的方法，其中將上述(8)或(9)的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且從得到的培養(yǎng)基產(chǎn)物中回收蛋白質(zhì)。(11)確定植物的脅迫水平的方法，其中在植物體中確定了上述(1)到(3)任一項(xiàng)所述的基因的轉(zhuǎn)錄水平。(12)通過(guò)將權(quán)利要求(1)到(3)任一項(xiàng)所述的基因?qū)氲街参镏懈纳浦参锏拿{迫耐受性的方法。
本說(shuō)明書(shū)包括在日本專利申請(qǐng)No.2001-358268說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有或部分內(nèi)容，它是本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)文件。
實(shí)施本發(fā)明的具體方案本發(fā)明的基因是來(lái)源于水稻基因組的基因，該基因具有抗環(huán)境脅迫例如低溫，脫水或鹽脅迫的耐受性改善機(jī)制。
本發(fā)明的基因是“編碼結(jié)合到順式元件的轉(zhuǎn)錄因子的分離的基因，所述的元件位于編碼脅迫反應(yīng)蛋白質(zhì)的基因的上游，該蛋白質(zhì)響應(yīng)環(huán)境脅迫例如低溫，脫水，或鹽脅迫而表達(dá)，從而激活該基因的轉(zhuǎn)錄”。上述順式元件的特定的例子包括脫水反應(yīng)元件(DRE)，脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)，低溫反應(yīng)元件。由本發(fā)明的基因編碼的蛋白質(zhì)激活位于上面提到的脅迫反應(yīng)元件(DRE等)的下游的基因的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的基因可以按照例如下面所述進(jìn)行鑒別。I本發(fā)明基因的鑒別基于與具有同源功能的已知基因，即編碼特異于植物的脅迫耐受性基因的轉(zhuǎn)錄因子的基因的同源性可以篩選本發(fā)明的基因。可以制備水稻的mRNA和cDNA文庫(kù)或水稻基因組文庫(kù)并且可以用于篩選?；蛘撸瑢F(xiàn)存的水稻DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。(1)基因文庫(kù)的篩選i)mRNA和cDNA文庫(kù)的制備最初，mRNA和cDNA文庫(kù)按如下方法制備。
對(duì)于mRNA的來(lái)源，可以使用水稻植物體的一部分例如葉，莖，根，或花，或整個(gè)植物體?；蛘?，通過(guò)在固體培養(yǎng)基例如GM培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基，或#3培養(yǎng)基上播種水稻種子，將它們?cè)跓o(wú)菌條件下生長(zhǎng)獲得植物體。該來(lái)源可以是無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的愈傷組織或培養(yǎng)的水稻細(xì)胞，對(duì)其品種沒(méi)有特別的限制，只要細(xì)胞含有需要的基因的mRNA。此外，由于待篩選的基因響應(yīng)環(huán)境脅迫而表達(dá)，可以優(yōu)先使用與低溫脅迫(例如10到-4℃)，鹽脅迫(例如150到250mM氯化鈉)，或脫水脅迫(例如脫水狀態(tài))接觸的植物。
例如，按照如下所述制備mRNA。將已經(jīng)在低溫脅迫，脫水脅迫或鹽脅迫條件下通過(guò)水耕法生產(chǎn)的水稻植物體暴露，然后用液氮冷凍。冷凍的植物體用研缽研磨。從上述獲得的經(jīng)研磨的這些材料，采用乙二醛方法，硫氰酸胍-氯化銫方法，氯化鋁-脲方法，蛋白酶K-脫氧核糖核酸酶方法等提取和制備粗制的RNA組分。然后從這些RNA粗組分利用寡聚dT-纖維素或多聚U-Sepharose在Sepharose 2B親和柱上或通過(guò)分批方法，獲得多聚(A)+RNA(mRNA)。此外通過(guò)蔗糖密度梯度離心等可以對(duì)得到的mRNA進(jìn)一步分餾。
此外，利用由此獲得的mRNA作為模板可以制備cDNA文庫(kù)。例如，利用寡聚(dT)引物或隨機(jī)引物，和在商品試劑盒(例如ZAP-cDNA合成試劑盒Stratagene)中的反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA。然后，從獲得的單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。隨后，將含有合適的限制性位點(diǎn)的接合子加到獲得的雙鏈cDNA，然后將其插入到λ噬菌體載體的克隆位點(diǎn)。利用Gigapack III Gold包裝提取物(Stratagene)等等包裝獲得的DNA，并且感染到大腸桿菌縮主，然后擴(kuò)增。此后，回收和儲(chǔ)藏噬菌體顆粒。
ii)基因組文庫(kù)的制備例如，按照下列方式利用λ噬菌體載體制備基因組文庫(kù)。作為DNA的來(lái)源，可以使用水稻植物體的一部分例如葉，莖，根或花，或整個(gè)植物體，只要該組織含有DNA。在液氮存在下將植物體磨成粉，通過(guò)CTAB的方法，芐基氯方法等提取DNA。將獲得的DNA用限制性酶Sau3AI部分分解，然后通過(guò)氯化鈉密度梯度超離心等分餾以回收10-20kb片段。將這些片段插入到λ噬菌體載體例如λEMBL3和λFIXII的BamHI裂解位點(diǎn)。此后，利用Gigapack III金包裝提取物(Stratagene)等進(jìn)行包裝，隨后感染到大腸桿菌宿主。然后回收擴(kuò)增的噬菌體顆粒并且儲(chǔ)藏。
iii)文庫(kù)的篩選按下列方式可以篩選文庫(kù)。
基于例如編碼特異于植物的脅迫耐受性基因的轉(zhuǎn)錄因子的已知基因，例如來(lái)源于擬南芥的DREB基因(DREB1A基因SEQ ID NO11，DREB2A基因SEQID NO12，DREB1B基因SEQ ID NO13，DREB1C基因SEQ ID NO14，DREB2B基因SEQ ID NO15)的高度保守區(qū)域的序列制備作為探針的DNA片段？通過(guò)利用具有約15bp到25bp的兩種引物進(jìn)行PCR，可以擴(kuò)增探針DNA，所述的引物是基于高度保守區(qū)域的每側(cè)的序列設(shè)計(jì)的，以便擴(kuò)增所述的區(qū)域。如果高度保守的區(qū)域是短的，不足于作為探針，可以設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增幾個(gè)高度保守的區(qū)域及其相鄰區(qū)域。
利用上面的探針，通過(guò)噬斑雜交或菌落雜交篩選cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。
(2)利用基因數(shù)據(jù)庫(kù)篩選指定例如編碼特異于植物的脅迫耐受性基因例如來(lái)源于擬南芥的DREB基因(DREB1A基因，DREB1B基因，DREB1C基因，DREB2A基因，DREB2B基因)的轉(zhuǎn)錄因子的已知基因的重要序列(高度保守區(qū)域或推測(cè)具有需要的功能的區(qū)域)。隨后，基于該特定的序列，進(jìn)行現(xiàn)存的基因數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性檢索。檢索的遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)可以是EST或全長(zhǎng)基因。利用分析軟件例如BLAST或FASTA在GenBank或DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索。優(yōu)選的是，檢測(cè)的目標(biāo)是編碼氨基酸序列的基因，該氨基酸序列尤其是與高度保守區(qū)域或推測(cè)具有需要的功能的區(qū)域的氨基酸序列具有高同源性，結(jié)果獲得保存了對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)的功能必需的氨基酸序列的序列。基于獲得的序列，設(shè)計(jì)引物，利用未克隆的cDNA(RT-PCR)，一個(gè)cDNA文庫(kù)，基因組DNA，或基因組文庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR，從而獲得需要的基因?；蛘撸蒔CR擴(kuò)增的DNA片段用作為探針，對(duì)cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選以獲得需要的基因。
(3)核苷酸序列的測(cè)定根據(jù)常規(guī)方法可以測(cè)定克隆的cDNA的整個(gè)核苷酸序列。核苷酸測(cè)序包括利用M13噬菌體的Maxam-Gilbert的化學(xué)修飾方法或雙脫氧核苷酸鏈終止方法。通常，利用自動(dòng)核苷酸測(cè)序儀(例如，377DNA測(cè)序儀，Pekin-Elmer)進(jìn)行測(cè)序。
因此，鑒定OsDREB1A(SEQ ID NO1)，OsDREB1B(SEQ ID NO3)，OsDREB1C(SEQ ID NO5)，OsDREB1D(SEQ ID NO7)，和OsDREB2A(SEQ IDNO9)為來(lái)源于水稻的DREB同源基因。
還有，通過(guò)對(duì)該基因的ORFs進(jìn)行分析而鑒定由這些基因編碼的OsDREB1A蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)，OsDREB1B蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)，OsDREB1C蛋白質(zhì)(SEQ ID NO6)，OsDREB1D蛋白質(zhì)(SEQ ID NO8)，和OsDREB2A蛋白質(zhì)(SEQ ID NO10)。
但是，本發(fā)明的基因不限于包括顯示于SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9的DNA的基因。包括在嚴(yán)格條件下與包括一個(gè)核苷酸序列雜交的DNA的基因也是本發(fā)明的基因，只要它們編碼調(diào)節(jié)位于脅迫反應(yīng)元件的下游的基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，所述的核苷酸序列與包括顯示于SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA互補(bǔ)?！皣?yán)格條件”是指其中甲酰胺濃度是30-50％，溫度是37℃到50℃，以及6×SSC的條件。優(yōu)選的是，甲酰胺濃度是50％，溫度是42℃，并且6×SSC。
本發(fā)明的基因是編碼包括顯示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。即使一個(gè)蛋白質(zhì)包含在顯示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列的缺失、取代、或添加的氨基酸序列，編碼這些蛋白質(zhì)的基因也包括在本發(fā)明的基因中，只要這些蛋白質(zhì)可以調(diào)節(jié)位于脅迫反應(yīng)元件的下游的基因的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“幾個(gè)氨基酸”優(yōu)選的是指20個(gè)或更少和更優(yōu)選的是5個(gè)或更少的氨基酸。
采用常規(guī)技術(shù)例如Kunkel方法，有空位的雙鏈體方法或其變異體，利用突變導(dǎo)入試劑盒[例如Mutant-K(Takara)或Mutant-G(Takara)]或利用LAPCR體外誘變系列試劑盒(Takara)可以將突變導(dǎo)入到本發(fā)明的基因，所述的突變導(dǎo)入試劑盒利用位點(diǎn)特異性誘變。
一旦已經(jīng)測(cè)定本發(fā)明基因的核苷酸序列，通過(guò)化學(xué)合成，通過(guò)利用基因的cDNA或基因組DNA作為模板的PCR，或通過(guò)以具有上述核苷酸序列的DNA片段作為探針的雜交可以獲得本發(fā)明基因。
2.本發(fā)明蛋白質(zhì)的DRE結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄激活能力的分析(1)DRE結(jié)合能力的分析通過(guò)凝膠遷移分析(Urao，T.等人，植物細(xì)胞51529-1539(1993))，利用由蛋白質(zhì)，GST等等組成的融合蛋白質(zhì)證實(shí)本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合到DRE的能力。以兩個(gè)基因的閱讀框架互相相合的方式將本發(fā)明的基因連接到編碼GST基因(例如，pGEX-4T-1載體)的質(zhì)粒的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼區(qū)域的下游，在誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)已經(jīng)轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌純化融合蛋白可以制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
凝膠遷移分析是檢測(cè)DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法。將用32P標(biāo)記的含有DRE的DNA片段等等與上文所述的融合蛋白混合，并且培養(yǎng)，獲得的混合物進(jìn)行電泳。在干燥之后，將凝膠進(jìn)行放射自顯影以檢測(cè)由于DNA片段和蛋白質(zhì)的結(jié)合已經(jīng)遷移到背面的帶。由于當(dāng)使用含有突變的DRE序列的DNA片段時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到上述介紹的帶，可以證明本發(fā)明蛋白質(zhì)與DRE序列的特異性結(jié)合。
(2)轉(zhuǎn)錄激活能力的分析通過(guò)利用水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)的反式激活試驗(yàn)可以分析本發(fā)明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活能力。例如，將OsDREB1A cDNA連接到含有CaMV35S啟動(dòng)子的pBI221質(zhì)粒(Clontech)以構(gòu)建效應(yīng)子質(zhì)粒。另一方面，將含有DRE的DNA片段連接到TATA啟動(dòng)子的上游以構(gòu)建報(bào)道質(zhì)粒，所述的啟動(dòng)子位于β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的上游。結(jié)果，將這兩個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入到水稻原生質(zhì)體并且然后測(cè)定GUS活性。如果通過(guò)OsDREB1A蛋白質(zhì)的同時(shí)表達(dá)GUS活性得到增強(qiáng)，則可以知道原生質(zhì)體中OsDREB1A蛋白質(zhì)的表達(dá)激活了通過(guò)DRE序列的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明中，根據(jù)Abel等人的方法(Abel，S等人，植物雜志5421-427(1994))可以制備原生質(zhì)體和將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到原生質(zhì)體。為了將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入效率不同的實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤降低到最小，可以將其中的熒光素酶基因被連接到CaMV35S啟動(dòng)子的下游的質(zhì)粒與上述兩個(gè)質(zhì)粒一起導(dǎo)入到原生質(zhì)體，因此可以測(cè)定抗熒光素酶活性的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性。然后，獲得的測(cè)定值顯示轉(zhuǎn)錄激活能力。采用Jefferson等人的方法可測(cè)定β-葡萄糖醛酸酶的活性(Jefferson，R.A等人，EMBO J。838447-8451(1986))；利用PicaGene熒光素酶分析試劑盒(Toyo InK)可以測(cè)定熒光素酶活性。
3.重組載體和轉(zhuǎn)化體的制備(1)重組載體的制備通過(guò)將本發(fā)明的基因連接到(插入到)合適的載體可以獲得本發(fā)明的重組載體。待插入本發(fā)明基因的載體沒(méi)有特別的限制，只要它在宿主中可復(fù)制。例如，可以使用質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等。質(zhì)粒DNA包括用于大腸桿菌宿主的質(zhì)粒例如pBR322，pBR325，pUC118，和pUC119；枯草芽孢桿菌宿主的質(zhì)粒pUB110，pTP5；酵母宿主的質(zhì)粒例如YEp13，YEp24，和YCp50；用于植物細(xì)胞宿主的pBI221和pBI121。噬菌體DNA包括λ噬菌體等等。再者，動(dòng)物病毒載體例如反轉(zhuǎn)錄病毒或痘苗病毒；或也可以使用昆蟲(chóng)病毒載體例如桿狀病毒。
為了將本發(fā)明的基因插入到載體，例如可以使用一種方法，其中用合適的限制性酶裂解純化的DNA，然后插入到限制性位點(diǎn)或用于連接到載體的合適的載體DNA的多克隆位點(diǎn)。應(yīng)該以該基因的功能可表達(dá)的方式將本發(fā)明的基因插入到載體。為了達(dá)到該目的，除了啟動(dòng)子和本發(fā)明的基因，如果需要，可以將含有順式元件的那些例如加強(qiáng)子，剪接信號(hào)，多聚(A)附加信號(hào)，選擇標(biāo)記，核糖體結(jié)合序列(SD序列)等等連接到本發(fā)明的載體。選擇標(biāo)記的例子是二氫葉酸還原酶基因，氨芐青霉素耐受基因，新霉素耐受基因等等。
(2)轉(zhuǎn)化體的制備通過(guò)將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入到宿主以使需要的基因表達(dá)，可以獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。對(duì)宿主沒(méi)有特別的限制，只要本發(fā)明的基因能夠在其中表達(dá)。特定宿主的例子包括埃希氏細(xì)菌例如大腸桿菌；芽孢桿菌例如枯草芽孢桿菌；假單胞菌例如糞假單胞菌；根瘤菌例如苜蓿中華根瘤菌；酵母例如啤酒酵母，粟酒裂殖酵母；從擬南芥，玉米，水稻，胡蘿卜等等建立的植物細(xì)胞系，或從例如植物制備的原生質(zhì)體；動(dòng)物細(xì)胞例如COS細(xì)胞，CHO細(xì)胞；或昆蟲(chóng)細(xì)胞例如Sf9細(xì)胞和Sf21細(xì)胞。
當(dāng)將細(xì)菌例如大腸桿菌用作為宿主時(shí)，本發(fā)明的重組載體能夠在宿主內(nèi)自主復(fù)制，同時(shí)，優(yōu)選的是它由啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合序列，本發(fā)明的基因，和轉(zhuǎn)錄終止序列組成。該載體還含有調(diào)節(jié)該啟動(dòng)子的基因。也可以使用大腸桿菌菌株例如HMS174(DE3)，K12，或DH1?？梢允褂每莶菅挎邨U菌菌株MI114或207-21。
可以使用任何啟動(dòng)子，只要能夠指導(dǎo)所需要的基因在宿主例如大腸桿菌中表達(dá)。例如，也可以使用大腸桿菌或噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子例如trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，PL啟動(dòng)子，或PR啟動(dòng)子。還可以使用人工設(shè)計(jì)和改變的啟動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子。對(duì)將重組載體導(dǎo)入到細(xì)菌的方法沒(méi)有特別的限制，其例子包括利用鈣離子的方法(Cohen，S.N.等人，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，692110-2114(1972))和電穿孔方法。
當(dāng)以酵母例如啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，或巴斯德畢赤氏酵母用作為宿主時(shí)，對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有特別限制，可以使用任何啟動(dòng)子，只要能夠指導(dǎo)需要的基因在酵母中的表達(dá)。例如可以使用gal1啟動(dòng)子，gal10啟動(dòng)子，熱休克蛋白質(zhì)啟動(dòng)子，MFα1啟動(dòng)子，PH05啟動(dòng)子，PGK啟動(dòng)子，GAP啟動(dòng)子，ADH啟動(dòng)子或AOX1啟動(dòng)子。
對(duì)將重組載體導(dǎo)入到酵母的方法沒(méi)有特別限制，其例子包括電穿孔(Becker，D.M.等人，酶學(xué)方法，194182-187(1990))，原生質(zhì)體方法(Hinnen，A等人，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)，751929-1933(1978))，乙酸鋰方法(Itoh，H.細(xì)菌雜志，153163-168(1983))。
當(dāng)以植物細(xì)胞例如從水稻，玉米，小麥，擬南芥，煙草，胡蘿卜等等建立的細(xì)胞株或從這樣的植物制備的原生質(zhì)體，用作為宿主時(shí)，對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有特別的限制，只要能夠指導(dǎo)需要的基因在植物中表達(dá)。例子包括椰菜花葉病毒的35SRNA啟動(dòng)子，rd29A基因的啟動(dòng)子，rbcS啟動(dòng)子。
將重組載體導(dǎo)入到植物中的方法包括Abel等人利用聚乙二醇(Abel，H.等人，植物雜志5421-427(1994))的方法和電穿孔。當(dāng)將動(dòng)物細(xì)胞用作為宿主時(shí)，例如，可以使用猿COS-7或Vero細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO細(xì)胞)，小鼠L細(xì)胞，大鼠GH3細(xì)胞，人FL細(xì)胞等等，SRα啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子，LTR啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子等等。還可以使用人巨細(xì)胞病毒等等的早期基因啟動(dòng)子。
為了將重組載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞，例如，可以使用電穿孔，磷酸鈣方法，脂轉(zhuǎn)染等等。當(dāng)昆蟲(chóng)細(xì)胞例如Sf9細(xì)胞，Sf21細(xì)胞等等用作為宿主時(shí)，可以使用磷酸鈣方法，脂轉(zhuǎn)染，電穿孔等等。
4.本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)是具有由本發(fā)明的基因編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或是具有在上面描述的氨基酸序列中有至少一個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列并且調(diào)節(jié)位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。
通過(guò)將轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和從獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物中回收蛋白質(zhì)可以獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)產(chǎn)物”是指任何下列材料培養(yǎng)物上清液，培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)的微生物，或破碎的細(xì)胞或微生物。采用用于培養(yǎng)宿主的常規(guī)方法可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。
作為用于培養(yǎng)從微生物宿主例如大腸桿菌或酵母獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用天然的或合成的培養(yǎng)基，只要它含有被微生物同化的碳源，氮源和無(wú)機(jī)鹽并能夠有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。當(dāng)將植物細(xì)胞用作為宿主，如果必要可以在培養(yǎng)基中加入維生素例如硫胺和維生素B6。當(dāng)將動(dòng)物細(xì)胞用作為宿主時(shí)，如果必要可以向培養(yǎng)基中加入血清RPMI1640。
碳源的例子包括碳水化合物例如葡萄糖，果糖，蔗糖和淀粉；有機(jī)酸例如乙酸和丙酸；和醇例如乙醇和丙醇。氮源的例子包括氨；無(wú)機(jī)或有機(jī)酸的銨鹽例如氯化銨；硫酸銨，乙酸銨和磷酸銨；其他含有氮的化合物；胨；肉提取物；和玉米浸提物。
無(wú)機(jī)物質(zhì)的例子包括磷酸一鉀，磷酸二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉，硫酸鐵(I)，硫酸鎂，硫酸銅和碳酸鈣。通常，在需氧條件下(例如振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng))，在30-37℃，約6小時(shí)到3天進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間，pH保持在約7.0-7.5。用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸，堿溶液等等調(diào)節(jié)pH。
在培養(yǎng)期間，如果必要向培養(yǎng)基中抗生素例如氨芐青霉素或四環(huán)素。當(dāng)培養(yǎng)用含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，如果必要向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑。例如，當(dāng)培養(yǎng)用含有Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可以在培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等等。當(dāng)培養(yǎng)用含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物時(shí)，可以向培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸(IAA)等等。
通常，在5％二氧化碳存在下，約30-37℃將培養(yǎng)進(jìn)行約6小時(shí)-3天。在培養(yǎng)期間，如果需要可以向培養(yǎng)基中加入抗生素例如卡那霉素或青霉素。在培養(yǎng)之后，如果蛋白質(zhì)在微生物或細(xì)胞中產(chǎn)生，通過(guò)將培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞破碎而提取本發(fā)明的蛋白質(zhì)。如果本發(fā)明的蛋白質(zhì)被分泌到微生物或細(xì)胞的外面，可以在隨后的步驟中使用培養(yǎng)液，將它離心以去除微生物或細(xì)胞。之后，可以單獨(dú)或合適的方式結(jié)合使用用于分離/純化蛋白質(zhì)的常規(guī)生化技術(shù)例如硫酸銨沉淀，凝膠層析，離子交換層析，和親和層析以從上面的培養(yǎng)產(chǎn)物中分離和純化本發(fā)明蛋白質(zhì)。
5.制備已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)利用遺傳工程技術(shù)將編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因?qū)氲剿拗髦参锟梢陨a(chǎn)耐受環(huán)境脅迫，特別是低溫，冷凍和脫水脅迫的轉(zhuǎn)基因植物。將本發(fā)明的基因?qū)氲剿拗髦参锏姆椒òㄩg接導(dǎo)入例如農(nóng)桿菌感染方法和直接導(dǎo)入例如粒子槍方法，聚乙二醇方法，脂質(zhì)體方法，和微注射方法。當(dāng)使用農(nóng)桿菌感染方法時(shí)，采用下列步驟可以生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
(1)導(dǎo)入到植物的重組載體的制備和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化通過(guò)用合適的限制酶裂解包括本發(fā)明基因的DNA，如果必要將合適的接頭連接到獲得的DNA，將該DNA插入到用于植物細(xì)胞宿主的克隆載體，可以制備待導(dǎo)入到植物的重組載體。二元載體型質(zhì)粒例如pBI2113Not，pBI2113，pBI101，pBI121，pGA482，pGAH，pBIG，或中間載體型質(zhì)粒例如pLGV23Neo，pNCAT，pMON200可以用作為克隆載體。
當(dāng)使用二元載體型質(zhì)粒時(shí)，在二元載體的邊界序列(LB，RB)之間插入需要的基因。在大腸桿菌中擴(kuò)增獲得的重組載體。然后通過(guò)凍融，電穿孔等等將擴(kuò)增的重組載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌C58，LBA4404，EHA101，C58C1RifR，EHA105等等。將獲得的農(nóng)桿菌用作為植物的轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，除了上面描述的方法還可以使用三成員偶合方去(Nucleic acidsresearch 128711(1984))以制備含有本發(fā)明基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌以感染植物。具體地，將含有本發(fā)明基因的質(zhì)粒的大腸桿菌，含有輔助質(zhì)粒的大腸桿菌(例如pRK2013)，和農(nóng)桿菌混合，在含有利福平和卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，可以獲得用于感染植物的合子農(nóng)桿菌。
對(duì)于外源基因等在植物體中表達(dá)，應(yīng)該將用于植物的啟動(dòng)子和終止子分別定位于結(jié)構(gòu)基因的上游和下游。可以用于本發(fā)明的啟動(dòng)子的特定例子包括椰菜花葉病毒(CaMV)來(lái)源的35S轉(zhuǎn)錄體(Jefferson，RA.等人，EMBO J 63901-3907(1987))；用于玉米泛素基因的啟動(dòng)子[Christensen，A.H.等人，Plant Mol.Biol.18675-689(1992)]，胭脂堿合成酶(NOS)基因的啟動(dòng)子；章魚(yú)堿(OCT)合成酶基因的啟動(dòng)子?？捎玫慕K止子的特定例子包括CaMV衍生的終止子和NOS衍生的終止子。不限于上面所述的啟動(dòng)子和終止子，只要已知它們?cè)谥参矬w中有功能。
如果用于轉(zhuǎn)基因植物的啟動(dòng)子是對(duì)需要的基因的組成型表達(dá)負(fù)責(zé)的啟動(dòng)子(例如CaMV35S啟動(dòng)子)，其使用已經(jīng)引起轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)的延遲，可以使用指導(dǎo)需要的基因的瞬時(shí)表達(dá)的啟動(dòng)子(例如rd29A基因啟動(dòng)子)。如果需要，增強(qiáng)本發(fā)明基因的表達(dá)的內(nèi)含子序列可以定位于啟動(dòng)子序列和基因之間。例如，可以導(dǎo)入來(lái)自于玉米醇脫水酶(Adhl)的內(nèi)含子(Genes&Development 11183-1200(1987))。
為了有效地選擇需要的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選的是將有效的選擇標(biāo)記基因與本發(fā)明的基因結(jié)合使用。作為選擇標(biāo)記，可以使用從卡那霉素抗性(NPTII)基因，授予植物對(duì)抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(htp)基因，授予植物bialaphos耐受性的膦絲菌素?；D(zhuǎn)移酶(bar)基因等等選擇的一個(gè)或多個(gè)基因?？梢詫⒈景l(fā)明的基因和選擇標(biāo)記基因一起摻入單一載體?；蛘?，可以使用摻入到各自的載體的兩種類型的重組DNA。
(2)將本發(fā)明的基因?qū)氲剿拗髟诒景l(fā)明中，盡管對(duì)轉(zhuǎn)化體的宿主沒(méi)有特別限制，優(yōu)選的是植物。植物可以是培養(yǎng)的植物細(xì)胞，培養(yǎng)的植物的整個(gè)植物體，植物器官(例如葉，花瓣，莖，根，根莖或種子)，或植物組織(例如表皮，韌皮部，薄壁組織，木質(zhì)部，或維管束)。優(yōu)選的植物是單子葉植物例如水稻，玉米和小麥。當(dāng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞，植物體，植物器官或植物組織用作為宿主時(shí)，可以使用農(nóng)桿菌感染方法，粒子槍方法，或聚乙二醇方法，通過(guò)將該載體導(dǎo)入到植物部分可以將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入，以轉(zhuǎn)化該宿主。或者，通過(guò)電穿孔將載體導(dǎo)入到原生質(zhì)體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。
例如，當(dāng)采用農(nóng)桿菌感染方法將基因?qū)氲綌M南芥時(shí)，用含有包括需要的基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染植物的步驟是必須。該步驟可通過(guò)真空抽濾方法(CRAcad.Sci.Paris，life Science，3161194(1993))進(jìn)行。具體地，使擬南芥在由等部分的蛭石和珍珠巖組成的土壤上生長(zhǎng)。將擬南芥直接浸入含有包括本發(fā)明基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，置于干燥器，然后用真空泵抽吸到65-70mmHg。然后將植物保持在室溫5-10分鐘。將植物罐轉(zhuǎn)移到用外膜覆蓋以保持濕度的盤(pán)。接下來(lái)的一天，移走外膜。將植物在那種狀態(tài)下生長(zhǎng)以收獲種子。
此后，將種子播種在補(bǔ)充了合適的抗生素的MS瓊脂培養(yǎng)基上以選擇那些具有本發(fā)明基因的個(gè)體。將在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥轉(zhuǎn)移到罐并且在那里生長(zhǎng)。結(jié)果，可以獲得已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子。通常，以類似的方式將基因?qū)氲剿拗髦参锏幕蚪M。但是，由于在已經(jīng)導(dǎo)入了基因的基因組的具體位置不同，導(dǎo)入的基因的表達(dá)不同。這種現(xiàn)象被稱為“位置效應(yīng)”。通過(guò)用來(lái)自于導(dǎo)入的基因的DNA片段作為探針，進(jìn)行Northern印跡分析對(duì)轉(zhuǎn)化體測(cè)試，選擇更高效表達(dá)的導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)化體是可能的。
通過(guò)從這些植物的細(xì)胞和組織提取DNA和通過(guò)PCR或Southern印跡分析檢測(cè)導(dǎo)入的基因可以證明，需要的基因整合到了導(dǎo)入本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，這些是本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的方法。
(3)本發(fā)明基因在植物組織中的表達(dá)水平和表達(dá)位點(diǎn)的分析通過(guò)從植物的細(xì)胞和組織中提取RNA和通過(guò)RT-PCR或Northern印跡分析檢測(cè)導(dǎo)入的基因的mRNA，可以分析已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物中一個(gè)基因的表達(dá)水平和表達(dá)位點(diǎn)，這些是本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)技術(shù)?；蛘?，利用抗上面產(chǎn)物的抗體，通過(guò)Western印跡分析等等可以直接分析本發(fā)明基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和表達(dá)位點(diǎn)。
(4)在已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物中各種基因的mRNA水平的變化可以通過(guò)Northern雜交在已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物中鑒別那些據(jù)信由于轉(zhuǎn)錄因子的作用而導(dǎo)致表達(dá)水平被改變了基因。
例如，在特定的時(shí)間期間內(nèi)(例如1-2星期)使水栽或其它方式生長(zhǎng)的植物遭受環(huán)境脅迫。環(huán)境脅迫的例子包括低溫，脫水，和鹽脅迫。例如，通過(guò)從水栽培養(yǎng)基中拔出植物，在濾紙上干燥10分鐘到24小時(shí)可以給予脫水脅迫。通過(guò)在15到-4℃保留植物10分鐘到24小時(shí)可以給予低溫脅迫。通過(guò)例如用50-500mM氯化鈉溶液替代水栽溶液并且使植物保留10分鐘到24小時(shí)可以給予鹽脅迫。
分別從沒(méi)有遭受脅迫的對(duì)照植物，從遭受了環(huán)境脅迫植物制備總RNA，將獲得的總RNA進(jìn)行電泳。通過(guò)利用待觀察的基因作為探針進(jìn)行RNA雜交可以分析表達(dá)方式。(5)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性的評(píng)價(jià)通過(guò)將轉(zhuǎn)基因植物置于含有包括蛭石和珍珠巖等等的土壤的罐中，將植物與各種環(huán)境脅迫接觸，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的存活力可以評(píng)價(jià)已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境脅迫耐受性。環(huán)境脅迫包括低溫，脫水和鹽脅迫。例如，通過(guò)在不加水時(shí)保持植物2-4星期，然后檢測(cè)存活力可以評(píng)價(jià)對(duì)脫水脅迫的耐受性。通過(guò)將植物在15到-10℃保持1-10天，在20-35℃生長(zhǎng)2天到3星期，然后檢測(cè)其存活力，可以評(píng)價(jià)對(duì)低溫和冷凍脅迫的耐受性?？梢岳缤ㄟ^(guò)將植物保留在100到600毫摩爾/升的NaCl中1小時(shí)到7天，在20到35℃下生長(zhǎng)1到3星期，然后檢測(cè)它的存活率來(lái)評(píng)定其對(duì)鹽脅迫的耐受性。
6.確定植物中的脅迫水平本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)錄是低溫脅迫，脫水脅迫或鹽脅迫激活的。所以，本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)錄水平的確定能夠用于評(píng)價(jià)植物遭受的低溫，脫水或鹽脅迫的脅迫水平。
本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)錄水平可以例如通過(guò)RNA凝膠印跡分析或定量PCR來(lái)確定。用于RNA凝膠印跡分析的探針可以根據(jù)基于本發(fā)明的基因和/或含有與該基因鄰接的特異序列的100-1000bp區(qū)的任何常規(guī)方法來(lái)生產(chǎn)。用于定量PCR的引物可以通過(guò)基于編碼本發(fā)明的基因的區(qū)域或與其鄰接的區(qū)域的序列的任何常規(guī)方法來(lái)制備。
上面所述的探針或引物可以用于試劑盒中用于確定本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)錄水平。
7.其他另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于生產(chǎn)抗該蛋白質(zhì)的抗體。該抗體可以是多克隆或多克隆抗體。生產(chǎn)抗體的方法是沒(méi)有特定限制的。并且可以根據(jù)任何常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行[參見(jiàn)例如，Sambrook，J et al.，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1989)]。該抗體可以用于通過(guò)例如Western印跡或免疫沉淀檢測(cè)需要的該蛋白質(zhì)。
實(shí)施例參考下面的實(shí)施例本發(fā)明得到了更詳細(xì)的說(shuō)明，但是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。
篩選水稻OsDREB基因1.用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性研究在下面所示的DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A和DREB2B基因的全長(zhǎng)氨基酸序列的基礎(chǔ)上，用GenBank中的水稻DNA的數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST進(jìn)行同源性檢索。
作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)類型的基因來(lái)自EST數(shù)據(jù)的1型(OsDREB1B)，來(lái)自根據(jù)DREB1同源基因的基因組序列數(shù)據(jù)的2型(OsDREB1C和OsDREB1D)，和來(lái)自根據(jù)DREB2同源基因的EST數(shù)據(jù)的1型(OsDREB2A)。
2.cDNA文庫(kù)的檢索(1)制備cDNA文庫(kù)在黑暗條件下，用蒸餾水，在25℃，將水稻種子(Nipponbare)水栽生長(zhǎng)15天。將得到的植物體在4℃下處理2小時(shí)或24小時(shí)，從培養(yǎng)器中拔出，在濾紙上干燥10小時(shí)，或用250mM的NaCl處理10小時(shí)，接著用液氮冷凍。用硫氰酸胍-氯化銫方法從冷凍的樣品中提取總RNA，用Oligo(dt)-纖維素柱制備mRNA。用得到的mRNA作為模板和用HybriZAP-2，1雙雜交cDNA Gigapack克隆試劑盒(Stratagene)合成cDNA，將cDNA插入和克隆進(jìn)HybriZAP-2，1噬菌粒載體的EcoRI-XhoI裂解位點(diǎn)。用GigapackIII金包裝提取物(Stratagene)包裝噬菌粒的DNA。將得到的含有cDNA的λ噬菌體顆粒用于感染寄主大腸桿菌，然后，擴(kuò)增，隨后回收。然后儲(chǔ)存得到的噬菌體懸浮液。
(2)利用探針檢索通過(guò)PCR擴(kuò)增(1)中得到的OsDREB1D基因組序列的N末端側(cè)的含有ERF/AP2區(qū)和一個(gè)保守區(qū)的序列，生產(chǎn)探針。利用這一探針檢索(1)中制備的cDNA文庫(kù)。作為結(jié)果，得到新的DREB1同源cDNA(OsDREB1A)。
通過(guò)水稻基因組研究課題提供對(duì)應(yīng)于OsDREB1B的EST克隆。為了擴(kuò)增全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，利用根據(jù)從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的基因組序列和終止密碼子得到的預(yù)測(cè)所設(shè)計(jì)的引物將OsDREB1C和OsDREB1D進(jìn)行PCR。
根據(jù)EST的序列生產(chǎn)用于檢索OsDREB2A的全長(zhǎng)cDNA的探針，從而檢索cDNA文庫(kù)。由于推測(cè)得到的cDNA克隆是不完全長(zhǎng)度的，所以利用從cDNA文庫(kù)制備的DNA作為模板進(jìn)行5’RACE確定全長(zhǎng)序列。根據(jù)這一序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增全長(zhǎng)基因的引物，并且通過(guò)RT-PCR得到全長(zhǎng)基因。
(3)核苷酸測(cè)序利用377 DNA序列儀(Perkin-Elmer)確定得到的DREB同源基因的cDNA的核苷酸序列。另外，分析OPF確定所有氨基酸序列。結(jié)果作為結(jié)果，鑒定5種類型的OsDREB基因和對(duì)應(yīng)于OsDREB蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列。作為來(lái)源于擬南芥的DREB蛋白質(zhì)，所有OsDREB蛋白質(zhì)含有推測(cè)為中心的ERF/AP2 DNA結(jié)合區(qū)，N末端的核定位信號(hào)，和C末端的酸激活區(qū)的這些區(qū)域(

圖1)。
在圖2和圖3中，將來(lái)自各種植物的DREB同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列相互比較，發(fā)現(xiàn)了高度保守序列。在帶色的背景上標(biāo)出的字母代表高保守區(qū)。
每個(gè)OsDREB的核苷酸序列和氨基酸序列的序列號(hào)如下OsDREB1A核苷酸序列(SEQ ID NO1)，氨基酸序列(SEQ ID NO2)；OsDREB1B核苷酸序列(SEQ ID NO3)，氨基酸序列(SEQ ID NO4)；OsDREB1C核苷酸序列(SEQ ID NO5)，氨基酸序列(SEQ ID NO6)；OsDREB1D核苷酸序列(SEQ ID NO7)，氨基酸序列(SEQ ID NO8)；OsDREB2A核苷酸序列(SEQ ID NO9)，氨基酸序列(SEQ ID NO10)。[實(shí)施例2]OsDREB蛋白質(zhì)結(jié)合DRE的能力的分析利用大腸桿菌制備谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和OsDREB1A和OsDREB2A的蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)。然后通過(guò)凝膠移動(dòng)試驗(yàn)評(píng)估得到的蛋白質(zhì)，以檢測(cè)蛋白質(zhì)與DRE的結(jié)合能力。
通過(guò)PCR擴(kuò)增定位于OsDREB1A cDNA的核苷酸序列的位置69到位置545的477bp的DNA片段或定位于OsDREB2A cDNA的核苷酸序列的位置334到位置822的489bp的DNA片段。然后，將擴(kuò)增片段連接到質(zhì)粒pGEX-4T-1(Pharmacia)的EcoRI-XhoI位點(diǎn)。在將這一質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌XL1-BlueMRF中后，在500毫升的2x YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌(分子克隆(1982)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版)。在這一培養(yǎng)物中，加入激活質(zhì)粒PGEX-4T-1的啟動(dòng)子的0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，以誘導(dǎo)OsDREB1A和GST的融合蛋白質(zhì)的合成。
在18毫升緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM EDTA，5mMMgCl2，400mMNaCl，5％甘油，0.1mM苯甲磺酰氟，0.1mM二硫蘇糖醇)中懸浮已經(jīng)誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)的大腸桿菌。然后，在其中加入1％Triton X-100和1mM EDTA。用超聲波裂解細(xì)胞后，在20,000g離心裂解的物質(zhì)1小時(shí)。然后，利用谷胱甘肽-瓊脂糖(Pharmacia)從上清液中純化蛋白質(zhì)。利用32P標(biāo)記的含有DRE序列的75bpDNA片段(SEQ ID NO16)作為探針，在室溫下溫育得到的融合蛋白質(zhì)20分鐘。用含有0.25x Tris-硼酸-EDTA的5％的聚丙烯酰胺，在120V下電泳混合物90分鐘。作為這一凝膠移動(dòng)試驗(yàn)的結(jié)果，檢測(cè)那些移動(dòng)到背面的帶。當(dāng)利用含有突變的DRE序列的DNA片段作為探針時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到這些帶。所以，表明OsDREB1A和OsDREB2A蛋白質(zhì)特異地結(jié)合DRE序列(圖4)。
制備轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)基因植物)(1)構(gòu)建植物質(zhì)粒1)制備OsDREB1A基因片段利用下面的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增定位于OsDREB1A基因的cDNA的核苷酸序列的位置69到位置785的717bp的DNA片段。然后，將擴(kuò)增的片段連接到載體pBluescriptSK(-)(Stratagene)的BamHI裂解位點(diǎn)，得到重組的質(zhì)粒pSKOsDREB1A。用BamHI裂解pSKOsDREB1A得到含有OsDREB1A基因的約700bp的DNA片段。正向；5’-GGGGATCCATGTGCGGGATCAGCAGGAGATG-3’(SEQ IDNO17)反向5’-GGGGATCCCTAGTAGCTCCAGAGTGGGAC-3’(SEQ ID NO18)2)制備PBE2113Not，G-ubi，G35S-ShΔ將PBE2113Not(植物細(xì)胞101391-1406(1998))，G-ubi，和G35S-ShΔ用作具有啟動(dòng)子DNA的質(zhì)粒。G-ubi和G35S-ShΔ制備如下。開(kāi)始時(shí)，用BamHI裂解pBIG質(zhì)粒(核酸研究18203(1990))，再末端鈍化和連接來(lái)去除BamHI裂解位點(diǎn)。然后，用HindIII和EcoRI裂解質(zhì)粒。將得到的片段與通過(guò)以相同方式裂解PBE2113Not質(zhì)粒得到的約1.2kb的片段相互連接，從而制備pBIG2113Not質(zhì)粒。
隨后，用HindIII和BamHI裂解pBIG2113Not，然后與同樣方法裂解的rd29A啟動(dòng)子的片段(約0.9kb，自然生物技術(shù)17287-291(1999))的片段連接，制備pBIG29APHSNot質(zhì)粒。另外，用HindIII和SalI裂解這一pBIG29APHSNot質(zhì)粒，然后與同樣方法裂解的玉米泛素基因(Ubi-1)啟動(dòng)子(約2.0kb，植物分子生物學(xué)18675-689(1992))的片段，或含有p35S-shΔ-stop的CaMV 35S啟動(dòng)子和玉米的蔗糖合成酶基因(Sh1)內(nèi)含子的一部分的片段(約1.6kb，ProceedingNational Academy of Science USA 9615348-15353(1999))連接。這樣，制備了G-ubi質(zhì)?；騁35S-shΔ質(zhì)粒。分別用BamHI裂解上面所述的PBE2113Not，G-ubi，和G35S-shΔ，用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd)將其與OsDREB1A基因片段連接。用這樣得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體后，分別從中純化質(zhì)粒pBE35SOsDREB1A，G-ubiOsDREB1A，和G35S-ShΔOsDREB1A。然后，確定它們的核苷酸序列，選擇具有以有意義方向結(jié)合的OsDREB1A基因的那些核苷酸。
3)導(dǎo)入農(nóng)桿菌將含有質(zhì)粒pBE35SOsDREB1A的大腸桿菌DH5α，含有輔助質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌HB101，和農(nóng)桿菌C58混合，并且在28℃，在LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。刮去產(chǎn)生的菌落，并且懸浮于1毫升的LB培養(yǎng)基中。在含有100毫克/升利福平和20毫克/升的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上鋪被該懸浮液(10微升)，在28℃下培養(yǎng)2天，從而得到合子農(nóng)桿菌C58(pBE35SOsDREB1A)。通過(guò)電穿孔，分別將質(zhì)粒G-ubiOsDREB1A和質(zhì)粒G35S-ShΔOsDREB1A導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，然后在培養(yǎng)后，用10％的甘油洗滌。這樣制備了農(nóng)桿菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和農(nóng)桿菌EHA105(G35S-shΔOsDREB1A)。
(2)通過(guò)農(nóng)桿菌感染將基因?qū)霐M南芥在含有100毫克/升的利福平和20毫克/升的卡那霉素的10毫升LB培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)合子24小時(shí)。隨后，在500毫升的LB培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)液，并且培養(yǎng)24小時(shí)。離心得到的培養(yǎng)液以除去培養(yǎng)基，懸浮于500毫升的感染緩沖液(每升2.3g Murashige和Skoog植物鹽混合物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd)，1毫升Gamborg維生素溶液，50g蔗糖，200微升L-77(Nippon UnicarCo.，Ltd.)，和10微克6-芐氨基嘌呤)。
在另一方面，在含有等量的蛭石和珍珠巖組成的土壤的9cm的罐中生長(zhǎng)4到5個(gè)擬南芥植物體6星期。然后，將擬南芥植物體直接浸入農(nóng)桿菌C58(pBI35SOsDREB1A)的農(nóng)桿菌懸浮液中，放置于干燥器中，用真空泵抽吸，將壓力減小到650mmHg，然后停留10分鐘。隨后，將植物罐轉(zhuǎn)移到盤(pán)中，用包布覆蓋維持濕度。在第二天，除去包布。然后，不覆蓋生長(zhǎng)植物以便產(chǎn)生種子。在次氯酸鈉的水溶液中滅菌后，在用于選擇的瓊脂培養(yǎng)基(用100毫克/升的萬(wàn)古霉素和30毫克/升的卡那霉素補(bǔ)充的MS培養(yǎng)基)上播種種子。將在這一培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥轉(zhuǎn)移到罐中，得到轉(zhuǎn)化植物的種子。
(3)通過(guò)農(nóng)桿菌感染，將基因?qū)胨驹?0％的乙醇中浸泡水稻種子1分鐘，在2％的次氯酸鈉中浸泡滅菌1小時(shí)。然后，用無(wú)菌水洗滌已滅菌的種子，將各9粒種子播種在N6D固體培養(yǎng)基(每升3.98g的CHU[N6]基礎(chǔ)鹽混合物(Sigma)，30g蔗糖，100毫克肌醇，300毫克酪蛋白氨基酸，2.878毫克的L-脯氨酸，2毫克的甘氨酸，0.5毫克的煙酸，0.5毫克的鹽酸吡哆醇，1毫克的鹽酸硫胺素，2毫克的2，4-D，4克的Gellite，pH5.8)，接著培養(yǎng)24天。這樣誘導(dǎo)了愈傷組織。將從約20粒種子形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的N6D固體培養(yǎng)基上，接著再培養(yǎng)3天。
在28℃，在含有100毫克/升的利福平和20毫克/升的卡那霉素的5毫升YEP培養(yǎng)基(每升10克細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，10克細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，5克NaCl，和406毫克MgCl2.6H2O，pH7.2)中分別培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和農(nóng)桿菌EHA105(G35S-ShDOsDREB1A)24小時(shí)。用含有20毫克/升乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基稀釋該農(nóng)桿菌，直到O.D.660是0.1，每升培養(yǎng)基中含有10毫克MnSO4.5H2O，3mgH3BO3，2mg ZnSO4.7H2O，250微克Na2MoO4.2H2O，25微克CuSO4.5H2O，25微克CoCl2.6H2O，750微克KI，150毫克CaCl2.2H2O，250mgMgSO4.7H2O，40mg Fe-EDTA，150mg NaH2PO4.2H2O，1mg煙酸，10毫克鹽酸硫胺素，1毫克鹽酸吡哆醇，100毫克肌醇，176.7毫克L-精氨酸，7.5毫克甘氨酸，900毫克L-谷氨酸，300毫克天冬氨酸，和3克KCl，pH5.2。這樣制備了20毫升農(nóng)桿菌懸浮液。
隨后，將農(nóng)桿菌懸浮液加入培養(yǎng)了3天的愈傷組織，然后，混合1分鐘。然后，將該愈傷組織放置于無(wú)菌的紙巾上除去過(guò)多的農(nóng)桿菌懸浮液，然后在暗處，在25℃，在放置了無(wú)菌濾紙的2N6-AS固體培養(yǎng)基(每升3.98g CHU[N6]基本鹽混合物，30克蔗糖，10克葡萄糖，100毫克肌醇，300毫克酪蛋白氨基酸，2毫克甘氨酸，0.5毫克尼克酸，0.5毫克鹽酸吡哆醇，1毫克鹽酸硫胺素，2毫克2，4-D，10毫克乙酰丁香酮，和4克Gellite，pH5.2)上培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)3天后，用含有500毫克/升的羧芐青霉素的3％的蔗糖水溶液完全洗滌培養(yǎng)產(chǎn)物直到產(chǎn)物不變白。進(jìn)一步在含有500毫克/升的羧芐青霉素和10毫克/升潮霉素的N6D固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)洗滌的培養(yǎng)產(chǎn)物1星期。然后，將得到的培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到含有500毫克/升的羧芐青霉素和50毫克/升的潮霉素的N6D固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18天。另外，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(每升4.6克Murashige和Skoog植物鹽混合物(Nihon Pharemaceutical Co.，Ltd)，30克蔗糖，30克山梨醇，2克酪蛋白氨基酸，100毫克肌醇，2毫克甘氨酸，0.5毫克煙酸，0.5毫克鹽酸吡哆醇，0.1毫克鹽酸硫胺素，0.2毫克NAA，2毫克細(xì)胞分裂素，250毫克羧芐青霉素，50毫克潮霉素，和8克瓊脂糖，pH5.8)。將該產(chǎn)物每星期轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中再生。將生長(zhǎng)到約1cm的具有芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的培養(yǎng)基(每升4.6克Murashige和Skoog植物鹽混合物(Nihon藥物公司)，30克蔗糖，2毫克甘氨酸，0.5毫克煙酸，0.5毫克鹽酸吡哆醇，0.1毫克鹽酸硫胺素，50毫克潮霉素，和2.5克Gellite，pH5.8)。在無(wú)激素培養(yǎng)基上已經(jīng)生長(zhǎng)到約8厘米的植物體轉(zhuǎn)移到含有合成的特殊裝罐土壤(Bonsol No.1，SumitomoChemical Co.，Ltd.)的罐中允許轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生種子。
利用水稻原生質(zhì)體分析轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制正如圖5所示，為了構(gòu)建效應(yīng)質(zhì)粒，將OsDREB1A cDNA，OsDREB2A cDNA，DREB1A cDNA，和DREB2A cDNA放置于CaMV35S啟動(dòng)子和玉米的蔗糖合成酶的內(nèi)含子序列的下游，與pBI221質(zhì)粒(Clontech)連接。獨(dú)立地構(gòu)建報(bào)道質(zhì)粒，該質(zhì)粒中，在最小啟動(dòng)子-61rd29A和GUS報(bào)道基因的上游，含有rd-29A啟動(dòng)子的DRE的75bp DNA重復(fù)片段插入了兩次。
隨后，將這兩個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體，然后，根據(jù)分解4-甲基7-羥基香豆酰-β-D-葡糖苷酸導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度改變判斷GUS活性。將CaMV35S啟動(dòng)子-LUC的融合基因作為每個(gè)實(shí)驗(yàn)的導(dǎo)入效率的標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)導(dǎo)入。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OsDREB1A和OsDREB2A基因能通過(guò)DRE激活轉(zhuǎn)錄。
在轉(zhuǎn)化體中，對(duì)OsDREB基因的表達(dá)的分析(1)在非轉(zhuǎn)化體中分析OsSREB基因的表達(dá)通過(guò)Northern雜交分析野生型水稻中OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，和OsDREB2A基因的表達(dá)特性。在25℃，在白天16小時(shí)暴曬，晚上8小時(shí)的條件下水栽水稻17天。對(duì)植物體分別應(yīng)用抗壞血酸，脫水，低溫，鹽(NaCl)，損傷和水脅迫。每0，10，20，40，60分鐘，2，5，10和24小時(shí)對(duì)應(yīng)用脅迫的水稻進(jìn)行取樣。
如下對(duì)水稻應(yīng)用各種脅迫通過(guò)在含有100微摩爾ABA的溶液中浸泡應(yīng)用抗壞血酸脅迫；通過(guò)在濾紙上干燥應(yīng)用脫水脅迫；通過(guò)轉(zhuǎn)移到冷卻到4℃的培養(yǎng)箱應(yīng)用低溫脅迫；通過(guò)在含有250mM NaCl的水溶液中浸泡應(yīng)用鹽(NaCl)脅迫；通過(guò)將葉子切開(kāi)8到10厘米高施加損傷脅迫；和通過(guò)浸泡純水施加水脅迫。分別從沒(méi)有給脅迫的對(duì)照植物和給脅迫的植物中制備總RNA。然后，將RNA進(jìn)行電泳。這樣，通過(guò)Northern方法觀察每個(gè)基因的表達(dá)。結(jié)果表示在圖6中。
從分析中可見(jiàn)，OsDREB1A基因的表達(dá)和OsDREB1B基因的表達(dá)分別主要是通過(guò)兩個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)的。相反，OsDREB2A的表達(dá)主要是通過(guò)脫水和鹽脅迫誘導(dǎo)的。在OsDREB1C中連續(xù)觀察到基因表達(dá)。
(2)在已轉(zhuǎn)化的擬南芥中，OsDREB基因表達(dá)的分析以和實(shí)施例3相同的方法，制備具有導(dǎo)入擬南芥的OsDREB1A，OsDREB1D和OsDREB2A基因的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)Northern方法分析了導(dǎo)入轉(zhuǎn)化體的OsDREB1A，OsDREB1D，和OsDREB2A基因的mRNA水平，和這些基因的水平，以及認(rèn)為被導(dǎo)入基因改變的它們的表達(dá)。具體地，將rd29A基因，cor15a基因，kin1基因和erd10基因的部分片段用作探針(rd29ASEQ ID NO19，cor15aSEQ ID NO20，kin1SEQ ID NO21，erd10SEQ ID NO22)，分析了mRNA水平。除了轉(zhuǎn)化體，將具有其中不含導(dǎo)入的DREB同源基因的pBI121質(zhì)粒(Clontech)的已轉(zhuǎn)化的擬南芥用作對(duì)照，比較基因表達(dá)。
將在GM瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3星期的約1克植物體暴露于脫水脅迫和低溫脅迫。通過(guò)從瓊脂培養(yǎng)基中拔出植物，并在石盤(pán)上干燥5小時(shí)而應(yīng)用脫水脅迫。在4℃培養(yǎng)植物而應(yīng)用低溫脅迫5小時(shí)。分別從沒(méi)有給予脅迫的對(duì)照植物和給予脫水和低溫脅迫的植物制備總RNA。將得到的總RNA進(jìn)行電泳。然后，通過(guò)Northern方法評(píng)估基因表達(dá)。
通常，以同樣的方法將這些基因?qū)朕D(zhuǎn)化體的基因組，但由于基因組上的位置中的差異，從而使導(dǎo)入基因的表達(dá)不同。這一現(xiàn)象叫作“位置效應(yīng)”。在這一實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Northern方法，用來(lái)自導(dǎo)入基因的DNA片段測(cè)試轉(zhuǎn)化體，可以選擇導(dǎo)入基因更高度表達(dá)的那些轉(zhuǎn)化體。同樣，通過(guò)利用可能參與脅迫耐受的基因的DNA片段作為探針，導(dǎo)入了OsDREBIA。這樣，鑒定了具有各種mRNA水平的基因。結(jié)果表示在圖7中。
作為結(jié)果，在啟動(dòng)子中具有GCCGAC的基因比具有ACCGAG的基因被更強(qiáng)地誘導(dǎo)。在單子葉植物的脅迫耐受基因的組中，具有GCCGAC作為DRE序列的那些的存在量比具有ACCGAG的那些更大。因此，這表明在這些單子葉植物中，OsDREB基因允許脅迫耐受基因比DREB基因更有效地表達(dá)。
(3)在已轉(zhuǎn)化的水稻中分析OsDREB基因的表達(dá)以和實(shí)施例3同樣的方法，制備具有導(dǎo)入水稻的擬南芥的OsDREB1A，OsDREB1B，和DREB1C基因的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)Northern方法分析導(dǎo)入轉(zhuǎn)化體的擬南芥的OsDREB1A，OsDREB1B，和DREB1C基因的mRNA水平，和這些基因的水平，以及認(rèn)為被導(dǎo)入基因所改變的它們的表達(dá)。具體地，將OsDREB1A基因，OsEREB1B基因，DREB1C基因，lip9基因，Wsi724基因，和SalT基因的部分片段用作探針(OsDREB 1ASEQ ID NO23，OsDREB 1BSEQ ID NO24，DREB1CSEQ ID NO25，LIP9SEQ ID NO26，Wsi724SEQ IDNO27，salTSEQ ID NO28)，分析mRNA的表達(dá)水平。在分析中，除了轉(zhuǎn)化體，為了比較基因表達(dá)，將具有在其中不含導(dǎo)入的DREB同源基因的G-ubi的已轉(zhuǎn)化水稻用作對(duì)照。
在含有30毫克/毫升潮霉素的0.1％的Benlate溶液中進(jìn)行5天選擇。然后，將植物轉(zhuǎn)移到含有Bonsol No.1的罐中，生長(zhǎng)12天。將約2克的生長(zhǎng)植物應(yīng)用鹽(NaCl)和低溫脅迫。通過(guò)從土壤中拔出植物體和浸泡在250mM NaCl的試管中5小時(shí)應(yīng)用鹽脅迫。在4℃培養(yǎng)植物體應(yīng)用低溫脅迫5小時(shí)。分別從沒(méi)有給予脅迫的對(duì)照植物和給予鹽和低溫脅迫的植物制備總RNA，然后進(jìn)行電泳。這樣，以和(2)中同樣的方法通過(guò)Northern方法觀察每個(gè)基因的表達(dá)。在圖8中表示了結(jié)果。
作為結(jié)果，在具有導(dǎo)入其中的OsDREB1A，OsDREB1B和DREB1C基因的已轉(zhuǎn)化水稻中，誘導(dǎo)了在啟動(dòng)子區(qū)具有DRE序列的lip9基因的表達(dá)，而沒(méi)有誘導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū)中沒(méi)有DRE序列的salT基因的表達(dá)。同樣，在這些轉(zhuǎn)化體中誘導(dǎo)了Wsi724基因的表達(dá)，該基因的表達(dá)在啟動(dòng)子區(qū)中沒(méi)有鑒定，但根據(jù)應(yīng)用脅迫時(shí)的表達(dá)方式(脫水、鹽、低溫可誘導(dǎo)，低溫誘導(dǎo)比脫水和鹽的誘導(dǎo)更慢)，推斷它是OsDREB的靶。[實(shí)施例6]OsDREB基因?qū)M南芥脅迫耐受的影響以和實(shí)施例3相同的方式，制備具有導(dǎo)入擬南芥的OsDREB1A和DREB1A基因的轉(zhuǎn)化體。作為對(duì)照，制備了用不含DREB同源基因的pBI121轉(zhuǎn)化的擬南芥。在下面條件下進(jìn)行各個(gè)耐受實(shí)驗(yàn)。
(1)NaCl耐受性如下觀察NaCl耐受性。在GM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)擬南芥3星期，浸泡在600mMNaCl的水溶液中2小時(shí)，接著洗滌。然后，將植物體轉(zhuǎn)移到含有Professional裝罐土壤的罐中，培養(yǎng)3星期，評(píng)估它的存活率。
(2)脫水耐受性如下研究脫水耐受性。將生長(zhǎng)在GM培養(yǎng)基中3星期的擬南芥轉(zhuǎn)移到含有由等量的蛭石和珍珠巖組成的土壤的罐中，培養(yǎng)1星期，然后終止水供應(yīng)。在培養(yǎng)2星期后，評(píng)估它的存活率。
(3)冷凍耐受性如下研究冷凍耐受性。將在GM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3星期的擬南芥轉(zhuǎn)移到含有Professional裝罐土壤的罐中，培養(yǎng)1星期。然后，在-6℃放置植物體36小時(shí)，然后在22℃培養(yǎng)5天。然后評(píng)估它的存活率。
在觀察鹽脅迫耐受性的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照的存活率是12％，導(dǎo)入OsDREB1A的植物的存活率是55％或65％的。對(duì)于導(dǎo)入DREB1A的植物，導(dǎo)入35SDREB1A的植物存活率是68％，導(dǎo)入29ADREB1A的植物存活率是90％。這表明，在雙子葉植物中OsDREB基因也提高了脅迫耐受性(圖9)。
本文引證的所有申請(qǐng)，專利和專利申請(qǐng)書(shū)全部引入本文作為參考。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供了來(lái)源于單子葉植物的脅迫耐受轉(zhuǎn)錄因子，和編碼這一轉(zhuǎn)錄因子的基因。利用本發(fā)明的該基因可以更有效地將脅迫耐受性傳遞給農(nóng)作物，即單子葉植物。
序列表文字SEQ ID NO16；探針SEQ ID NO17；引物SEQ ID NO18；引物SEQ ID NO19；rd29a的探針SEQ ID NO20；cor15a的探針SEQ ID NO21；kin1的探針SEQ ID NO22；erd10的探針SEQ ID NO23；OsDREBIA的探針SEQ ID NO24；OsDREBIB的探針SEQ ID NO25；DREBIC的探針SEQ ID NO26；lip9的探針SEQ ID NO27；Wsi724的探針SEQ ID NO28；salT的探針序列表<110>日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心<120>編碼植物轉(zhuǎn)錄因子的基因<130>PH-1628<150>JP 2001-358268<151>2001-11-22<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>927<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(69)..(782)<400>1cacactcgag cagagcaaat acagttcagg aatcaggagc aagcagaaac acacacacaa 60atccgaag atg tgc ggg atc aag cag gag atg agc ggc gag tcg tcg ggg 110Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly1 5 10tcg ccg tgc agc tcg gcg tcg gcg gag cgg cag cac cag acg gtg tgg158Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp15 20 25 30acg gcg ccg ccg aag agg ccg gcg ggg cgg acc aag ttc agg gag acg206Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr35 40 45agg cac ccg gtg ttc cgc ggc gtg cgg cgg agg ggc aat gcc 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105 110 115agg gca atg tat ggt ccc aca gca cgt gtc aat ttt gca gat aat tcc738Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val Asn Phe Ala Asp Asn Ser120 125 130 135aca gat gcc aac tct ggc tgc aca tca gca cct tca ttg atg atg tct786Thr Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala Pro Ser Leu Met Met Ser140 145 150aat ggg ccg gcc act ata cct tct gat gag aag gat gag ctg gaa tct834Asn Gly Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu Lys Asp Glu Leu Glu Ser155 160 165cct cct ttc atc gtg gct aat ggg cca gct gtg ttg tat cag cct gat882Pro Pro Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala Val Leu Tyr Gln Pro Asp170 175 180aag aag gat gtg ttg gaa cgt gta gtc cct gag gtg cag gat gtt aaa930Lys Lys Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro Glu Val Gln Asp Val Lys185 190 195aca gaa ggg agc aat ggc ttg aaa cgt gtt tgt cag gag cgg aag aat978Thr Glu Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val Cys Gln Glu Arg Lys Asn200 205 210 215atg gag gta tgt gaa tca gaa ggg atc gtt tta cac aaa gaa gtg aac1026Met Glu Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile Val Leu His Lys Glu Val Asn220 225 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135 140 145cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa655Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys150 155 160aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag703Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu165 170 175ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt751Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val180 185 190 195aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt799Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser200 205 210gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa847Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu215 220 225acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt895Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly230 235 240tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt943Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe245 250 255gat 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145 150 155tgt ggt gat gtt tgt gtg aag cat gaa gat act gat tgt gaa tct aat707Cys Gly Asp Val Cys Val Lys His Glu Asp Thr Asp Cys Glu Ser Asn160 165 170 175cca ttt agt cag att tta gat gtt aga gaa gag tct tgt gga acc agg755Pro Phe Ser Gln Ile Leu Asp Val Arg Glu Glu Ser Cys Gly Thr Arg180 185 190ccg gac agt tgc acg gtt gga cat caa gat atg aat tct tcg ctg aat803Pro Asp Ser Cys Thr Val Gly His Gln Asp Met Asn Ser Ser Leu Asn195 200 205tac gat ttg ctg tta gag ttt gag cag cag tat tgg ggc caa gtt ttg851Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Phe Glu Gln Gln Tyr Trp Gly Gln Val Leu210 215 220cag gag aaa gag aaa ccg aag cag gaa gaa gag gag ata cag caa cag899Gln Glu Lys Glu Lys Pro Lys Gln Glu Glu Glu Glu Ile Gln Gln Gln225 230 235caa cag gaa cag caa cag caa cag ctg caa ccg gat ttg ctt act gtt947Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Pro Asp Leu Leu Thr Val240 245 250 255gca gat tac ggt tgg cct tgg tct aat gat att gta aat gat cag act995Ala Asp Tyr Gly Trp Pro Trp Ser Asn Asp Ile Val Asn Asp Gln Thr260 265 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1.含有下面的DNA(a)或(b)的分離基因(a)含有如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；或(b)與包含一種核苷酸序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述核苷酸序列與含有SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA互補(bǔ)。
2.編碼下面的蛋白質(zhì)(c)或(d)的分離基因(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其中脅迫是脫水脅迫，低溫脅迫，或鹽脅迫。
4.下面的重組蛋白質(zhì)(c)或(d)(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQID NO10所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件的下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其中脅迫是脫水脅迫，低溫脅迫或鹽脅迫。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求1到3的任何一個(gè)所述的基因的重組載體。
7用權(quán)利要求6所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
8.據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是單子葉植物。
10.生產(chǎn)調(diào)節(jié)定位于脅迫反應(yīng)元件下游的基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的方法，其中權(quán)利要求8或9所述的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，并且從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物中回收所述的蛋白質(zhì)。
11.確定植物的脅迫水平的方法，其中確定植物體中權(quán)利要求1到3的任何一個(gè)所述的基因的轉(zhuǎn)錄水平。
12.通過(guò)在植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1到3的任何一個(gè)所述的基因提高植物的脅迫耐受性的方法。
全文摘要
來(lái)自單子葉植物如水稻的基因的鑒定，該基因編碼特異于脅迫耐受基因的轉(zhuǎn)錄因子，利用該基因提供新的環(huán)境脅迫耐受植物。從水稻基因組中，鑒定了一個(gè)結(jié)合于存在于編碼脅迫反應(yīng)蛋白質(zhì)的基因的上游的順式元件并且編碼和激活基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的基因。另外，將轉(zhuǎn)錄因子的基因用于轉(zhuǎn)化植物，從而提高對(duì)環(huán)境脅迫如低溫，脫水，和鹽脅迫的耐受性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1431309SQ0215428
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者筱崎和子, 伊藤裕介, 佐久間洋 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)