專利名稱：與細(xì)胞重構(gòu)、傳導(dǎo)及凋亡相關(guān)的cr1基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人類功能基因，特別是涉及與細(xì)胞重構(gòu)、傳導(dǎo)及凋亡相關(guān)的基因，闡明該基因的調(diào)控機(jī)理，尤其是在心肌細(xì)胞重構(gòu)、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，可為心肌和腫瘤疾病的診斷及防治提供有效手段。
以下通過(guò)實(shí)施例作為對(duì)發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明的范圍。
SEQ ID No 3gagtagttct cctgggtccg ctctgcgggc ttctgggaga tgtagtttct ggtctgtagg 60caggacggaa ggagcggggg aggcccctta cgcaaactac aattcccggc ggggagcgcg120gtgaagcggg ggtgggatct gaacatggcg gcggtggtag ctgctacggc gctgaagggc180cggggggcga gaaatgcccg cgtcctccgg gggattctcg caggagccac agctaacaag240gcttctcata acaggacccg ggccctgcaa agccacagct ccccagaggg caaggaggaa 300cctgaacccc tatccccgga gctggaatac attcccagaa agaggggcaa gaaccccatg 360aaagctgtgg gactggcctg ggccatcggc ttcccttgtg gtatcctcct cttcatcctc 420accaagcggg aagtggacaa ggaccgtgtg aagcagatga aggctcggca gaacatgcgg 480ttgtccaaca cgggcgagta tgagagccag aggttcaggg cttcctccca gagtgccccg 540tcccctgatg ttgggtctgg ggtgcagacc tgaggagcgc tgcgaccctc ctaggctatt 600gactgttaag tcctcaggtt tggcccagat tccagttcgt gcctctgagg tccaccagag 660ggcgcatgaa gcccaggctg ttgccaaacc ctaccctgcc ccacaccaag gagccagcca 720aaggcaaata aagttattga gtgtttagta gaaagg756SEQ ID No 4MAAVV AATAL KGRGA RNARV LRGIL AGATA NKASH NRTRA LQSHS SPEGK 50EEPEP LSPEL EYIPR KRGKN PMKAV GLAWA IGFPC GILLF ILTKR EVDKD 100RVKQM KARQN MRLSN TGEYE SQRFR ASSQS APSPD VGSGV QT 142
合成寡脫氧核苷酸5′GATCCGAGCCACAGCTAACAAGGCTTTTTTAAGCCTTGTTAGCTGTGGCTCT 3′(SEQ ID NO5)5′CTAGAGAGCCACAGCTAACAAGGCTTAAAAAAGCCTTGTTAGCTGTGGCTCG 3′(SEQ ID NO6)一對(duì)引物混合并退火，克隆入pBSKU6載體(劉靜等高科技通訊2000年第10卷第8期6-9頁(yè))和(Ren-Huan Xu BRAIN RESEARCH 899<2001>，10-19)。
合成引物引物C5’ATAACGCGTCCCGGGTGGTAAACCGTGCA3’(SEQ ID NO7)引物D5’TTAACGCGTGAGCTCAAGGTCGGGCAGGAA3’(SEQ ID NO8)從構(gòu)建的pBSKU6載體上PCR擴(kuò)增出嵌有RNAi片段的U6區(qū)段，亞克隆至pEGFP-C1(CLONTECH公司)載體中的Mlu I位點(diǎn)。
用GIBCO公司產(chǎn)品LipofectAMINE 2000 Reagent，按其說(shuō)明書給出步驟將pEGFPC1-U6-RNAi轉(zhuǎn)染至肝癌7721細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))中，2-3天后用生物工程公司(Sangon)Trizol試劑提總RNA。采用Clontech公司引物標(biāo)記系統(tǒng)，將CR-1編碼區(qū)基因α-32P-dATP標(biāo)記后作為探針，進(jìn)行Northern雜交，與沒(méi)有轉(zhuǎn)染的7721細(xì)胞對(duì)比。結(jié)果表明，用RNAi技術(shù)，使CR-1基因在RNA水平大幅下調(diào)(圖2)。
把轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用G418(含G418 100μg/ml的培養(yǎng)液，2天換液一次)篩選兩周，挑得陽(yáng)性克隆。7721細(xì)胞原株和轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi的7721細(xì)胞分別用0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化得到細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，用檸檬酸緩沖液(0.25mol/L蔗糖，40mmol/L檸檬酸，PH7.6)重懸細(xì)胞，再用75％冰冷乙醇逐滴加入，處理30分鐘，用PBS洗兩次，加入固定液(碘化丙啶20μg/ml，RNAseA 50μg/ml)37℃水浴30分鐘。200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司FACSCalibur)檢測(cè)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi的7721細(xì)胞進(jìn)入G0-G1期為17.65％，進(jìn)入G2-M期為61.11％，而未轉(zhuǎn)染的對(duì)照分別為43.32％和35.74％，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi的7721細(xì)胞停滯于G2期(圖3)，并且轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi的7721細(xì)胞凋亡數(shù)為29.76％(未轉(zhuǎn)染的對(duì)照為4.44％)，表明轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi后引起7721細(xì)胞有較大程度的凋亡(圖4)。
引物EATTAGGATCCAAATGGCGGCGGTGGTAGCTGCT (SEQ ID No9)引物FAATTGTCGACTCAGGTCTGCACCCCAGACCC(SEQ ID No10)用已克隆的CR-1 cDNA為模板，采用Clontech Advantage eDNA PCR kit進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為98℃熱啟動(dòng)2分鐘；94℃變性30秒；62℃復(fù)性30秒，72℃延伸45秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為50微升。從膠中回收PCR產(chǎn)物，酶切后與BamH I-Sal I酶切的pGBKT7質(zhì)粒載體相連，獲得pGBKT7/CR-1重組質(zhì)粒。按照CLONTECH MATCHMAKER GAL4Two-Hybrid System 3說(shuō)明書描述，制備酵母AH109新鮮感受態(tài)細(xì)胞，用PEG/LiAc方法轉(zhuǎn)化pGBKT7/CR-1質(zhì)粒，在缺乏色氨酸的SD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)化子為表達(dá)誘餌蛋白CR-1的工程酵母AH109/BD-CR1。
采用構(gòu)建在pACT2載體上的人骨骼肌cDNA文庫(kù)(美國(guó)Clontech公司，Cat#HY4047AH)篩選與之相互作用的蛋白。所構(gòu)建的pGBKT7/CR-1重組質(zhì)粒按照CLONTECH MATCHMAKERGAL4 Two-Hybrid System 3說(shuō)明書描述大量轉(zhuǎn)化工程酵母菌AH109/BD-CR1，在缺乏腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸及色氨酸的SD培養(yǎng)基上篩選約4×106轉(zhuǎn)化子，共得到94個(gè)陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)印到濾紙上，按照CLONTECH MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3說(shuō)明書描述進(jìn)行β-半乳糖苷酶法分析，有57個(gè)克隆呈藍(lán)色表型，表明其β-半乳糖苷酶基因表達(dá)為陽(yáng)性。陽(yáng)性克隆酵母經(jīng)劃線分離純化后再經(jīng)同樣β-半乳糖苷酶法分析確證，然后提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA再次轉(zhuǎn)化AH109/BD-CR1和進(jìn)行β-半乳糖苷酶基因表達(dá)的分析后，最終確定與誘餌蛋白CR-1起作用的蛋白共18個(gè)，其編碼基因經(jīng)酶切分析可分為7種類型。DNA測(cè)序以及用所獲得的氨基酸序列檢索NCBI基因庫(kù)，結(jié)果表明，克隆得到的DNA片段1與翻譯起始因子3亞單位5(eIF3 subunit 5)(XM010886)基因一致性為95％(圖5-1)；DNA片段2與肌球蛋白重鏈的myomesin 1(skelemin)(XM012744)基因一致性為86-91％(圖5-2)；DNA片段3與肌球蛋白輕鏈MRLC2(AF363061)基因一致性為98％(圖5-3)；DNA片段4與參與肌肉紋狀肌M帶復(fù)合酶系的β-烯醇化酶(XM008524)基因一致性為96％(圖5-4)，此外還與一些新蛋白有相互作用；DNA片段5與MRIP-1(AF359283)基因的一致性為98％(圖5-5)。利用酵母雙雜交技術(shù)分段分析CR-1蛋白與MRIP1蛋白具體相互作用結(jié)構(gòu)域MRIP1序列的結(jié)構(gòu)域分析表明，MRIP-1含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域RAS網(wǎng)狀激活系統(tǒng)-reticular activating system，為一類與膜相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白；PH結(jié)構(gòu)域，其多發(fā)現(xiàn)存在于各種真核信號(hào)蛋白，功能主要是參與各種膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合；Arf(ADP核糖化因子)Gap，作為一種GTP結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)胞膜的磷酯，在細(xì)胞信號(hào)傳遞及囊泡運(yùn)輸中起作用(圖6)。根據(jù)這3個(gè)結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)合成如下引物，引物GATTACATATGGCGGCGGTGGTAGCTG(含Nde I位點(diǎn))(SEQ ID No11)引物HAATTCTCGAGGGTCTGCACCCCAGACCCA (含Xho I位點(diǎn))(SEQ ID No12)引物IATTAGAATTCATGTTCGGCGGCGCGGGGCC (含EcoR I位點(diǎn))(SEQ ID No13)引物JATTAGTCGACATTAGTAGTCGCTGAAGGCGCTGC(含Sal I位點(diǎn))(SEQ ID No14)引物KATTAGAATTCTCGTCCTCAGTCCCCTCCAC (含EcoR I位點(diǎn))(SEQ ID No15)引物L(fēng)ATTAGTCGACATTAGCCTGGGGGCAGGGAAGTGG(含Sal I位點(diǎn))(SEQ ID No16)引物MATTAGAATTCATGCAGCACCCTGCCAGTG (含EcoR I位點(diǎn))(SEQ ID No17)引物NATATGTCGACATTATAGGAGGCTAGGACTAC (含Sal I位點(diǎn))(SEQ ID No18)以克隆的CR1 cDNA作為模板，用引物G和H同實(shí)施例4的條件PCR擴(kuò)增含Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)的CR-1 PCR產(chǎn)物，連接到pGADT7載體(購(gòu)自Clontech公司)得到pGADT7/CR-1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，在缺乏亮氨酸的SD培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化子，以此作為表達(dá)誘餌蛋白的工程酵母AH109/AD-CR1。
以克隆的MRIP1 cDNA作為模板，同實(shí)施例4的條件PCR擴(kuò)增含EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)的MRIP1 PCR產(chǎn)物，用引物I和J擴(kuò)增得到900bp的MRIP1-a片段，用引物K和L擴(kuò)增得到648bp的MRIP1-b片段，用引物M和N擴(kuò)增得到1083bp的MRIP1-c片段，克隆的PCR片段經(jīng)酶切后，連接到pGBKT7載體(購(gòu)自Clontech公司)獲得重組質(zhì)粒pGBKT7/MRIP1-a、pGBKT7/MRIP1-b、pGBKT7/MRIP1-c。將3個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化工程酵母AH109/AD-CR1，在缺乏腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸及色氨酸的SD培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，僅在pGBKT7/MRIP1-a的轉(zhuǎn)化平板上得到陽(yáng)性克隆，說(shuō)明CR1蛋白是通過(guò)MRIP1-a片段(其中包含完整的RAS結(jié)構(gòu)域)與MRIP1蛋白發(fā)生相互作用的，本實(shí)施例表明CR-1參與膜上受體所媒介的信息傳導(dǎo)這一能力是通過(guò)MRIP-1的RAS結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的。實(shí)施例5用pGEX系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)CR-1基因根據(jù)CR-1序列設(shè)計(jì)合成了含有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物，引物OGTGGGATTCACATGGCGGCGGTGGTAGCTGCT(含BamH I位點(diǎn))(SEQ ID No 19)引物PGCAGAATTCTCAGGTCTGCACCCCAGACCCAAC(含EcoR I位點(diǎn))(SEQ ID No 20)用引物O和P，以克隆的CR-1 cDNA作為模板，同實(shí)施例4的條件PCR擴(kuò)增了兩端帶有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)的CR-1 PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠回收、酶切后，連接到含有GST基因的pGEX-5X-1載體(Amersham Pharmacia公司)上，連接后的重組質(zhì)粒pGEX-5X/CR-1轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。含pGEX-5X/CR-1的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在含氨芐青霉素(Amp)100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后以1∶100稀釋接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至光密度600nm(OD600)為0.5-0.8，隨后加入IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。隨后離心(6000×g 10分鐘)，收集細(xì)胞。然后用超聲裂解菌體，離心除去不溶物，于上清液中加入50％谷胱甘肽-瓊脂糖珠，4℃反應(yīng)1小時(shí)，離心收集瓊脂糖珠，用PBS緩沖液洗脫多次之后，從瓊脂糖珠中回收谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白GST-CR-1。用10％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為43kDa(圖7-1)。因?yàn)镚ST的分子量約為28kDa，所以CR-1的分子量推測(cè)為15kDa，從CR-1序列(SEQ ID NO.4)進(jìn)行推測(cè)，其理論值約為15.4kDa。用CR-1抗體進(jìn)行Western檢測(cè)，證明43kDa融合蛋白為表達(dá)的目的蛋白GST-CR-1蛋白(圖7-2)。GST-CR-1融合蛋白從谷胱甘肽-瓊脂糖珠上可用特異性蛋白酶Xa因子切割，獲得純化的CR-1蛋白。
用引物Q和R，以克隆的CR-1 cDNA作為模板，同實(shí)施例4的條件PCR擴(kuò)增了兩端帶有EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的CR-1 PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠回收、酶切后，連接到pET-24a(+)載體(Novagen公司)上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-CR1-NC，其表達(dá)目的蛋白的N端及C端分別帶有T7-Tag和6×His-Tag標(biāo)記；采用同樣的模板和載體，用引物Q和T擴(kuò)增CR-1基因，經(jīng)EcoR I和Not I酶切連接到pET-24a(+)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pET-CR1-N，其表達(dá)目的蛋白的N端帶有T7-Tag標(biāo)記；用引物R和S擴(kuò)增CR-1基因，經(jīng)Nde I和Xho I酶切連接到pET-24a(+)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pET-CR1-C，其表達(dá)目的蛋白的C端帶有6×His-Tag標(biāo)記；用引物S和T擴(kuò)增CR-1基因，經(jīng)Nde I和NotI酶切連接到pET-24a(+)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pET-CR1，其表達(dá)目的蛋白的N端及C端均不帶有標(biāo)記。重組質(zhì)粒經(jīng)T7啟動(dòng)子和T7終止子引物雙向測(cè)序證明構(gòu)建正確。
將構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒分別用常規(guī)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-CodonPlus-RIL(Stratagene公司)細(xì)胞，在含有卡那霉素(Km)50μg/ml、氯霉素(Cm)50μg/ml的LB培養(yǎng)平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子接種1ml含有卡那霉素(Km)50μg/ml、氯霉素(Cm)50μ/ml的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。取50μl菌液轉(zhuǎn)種于1ml LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220rpm培養(yǎng)3小時(shí)。至細(xì)胞光密度600nm(OD600)為0.5-0.8，隨后加入IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)至終濃度為1mM。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)，隨后離心(6000×g 8分鐘)收集細(xì)胞。1×PBS緩沖液洗滌一次，然后用超聲裂解菌體，5000×g離心8分鐘除去殘余菌體，12000×g 5分鐘離心收集包含體。用10％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果表明，只有N端及C端帶標(biāo)記的質(zhì)粒pET-CR1-NC或N端帶標(biāo)記的質(zhì)粒pET-CR1-N可獲得表達(dá)，而N端及C端不帶標(biāo)記或N端不帶標(biāo)記的質(zhì)粒(即pET-CR1和pET-CR1-C)不能獲得表達(dá)(圖8)。


圖1. Western雜交檢測(cè)CR-1蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，其中1Marker分別為97，66，43，31，20，14KD；2HT29人直腸癌細(xì)胞；3cos7非洲綠猴腎上皮細(xì)胞；47402人肝癌細(xì)胞；57721人肝癌細(xì)胞；6A549人肺癌細(xì)胞；7K562人慢性白血病細(xì)胞圖2. 7721肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi后CR-1 RNA的Northern blot結(jié)果，β-actin為Northern blot實(shí)驗(yàn)中作為mRNA水平檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)，其中17721人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi組，27721人肝癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組對(duì)照；37721人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染組，β-actin內(nèi)標(biāo)；47721人肝癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，β-actin內(nèi)標(biāo)；圖3-1. 7721人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果，其中A細(xì)胞進(jìn)入G0-G1期為17.65％B細(xì)胞進(jìn)入G2-M期為61.11％圖3-2. 7721人肝癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果，其中A細(xì)胞進(jìn)入G0-G1期為43.32％B細(xì)胞進(jìn)入G2-M期為35.74％圖4-1. 7721人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFPC1-U6-RNAi組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)為29.76％；圖4-2. 7721人肝癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)為4.44％圖5-1.和CR-1蛋白相互作用基因片段1與翻譯起始因子3亞單位5(eIF3 subunit 5)基因(XM010886)同源性比較。圖5-2.和CR-1蛋白相互作用基因片段2與肌球蛋白重鏈myomesinl基因(XM012744)同源性比較。圖5-3.和CR-1蛋白相互作用基因片段3與肌球蛋白輕鏈MRLC2基因(AF363061)同源性比較。圖5-4.和CR-1蛋白相互作用基因片段4與β-烯醇化酶基因(XM008524)同源性比較。圖5-5.和CR-1蛋白相互作用基因片段5與MRIP-1基因(AF359283)同源性比較。圖6.在http//smart.embl-heidelberg.de網(wǎng)站進(jìn)行MRIP1-1氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果。圖7-1.用pGEXT系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)CR-1基因，目的融合蛋白CR1-GST大小約為41KD，GST大小約為26KD。其中蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker97，66，43，31，20，14KD；；1.空載體pGEX-5X-1轉(zhuǎn)化株未誘導(dǎo)；2.空載體pGEX-5X-1轉(zhuǎn)化株誘導(dǎo)；3.pGEX-5X/CR-1轉(zhuǎn)化株未誘導(dǎo)；4.pGEX-5X/CR-1轉(zhuǎn)化株誘導(dǎo)1小時(shí)；5.pGEX-5X/CR-1轉(zhuǎn)化株誘導(dǎo)4小時(shí)。圖7-2.用pGEXT系統(tǒng)，CR-1基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物的Western檢測(cè)結(jié)果。其中，Marker、1、2、3、4、5各條帶均對(duì)應(yīng)圖7-1。圖8.用pET系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)CR-1基因，其中蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker97，66，43，31，20，14KD；1.空載體pET-24a(+)轉(zhuǎn)化株，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；2.pET-CR1轉(zhuǎn)化株，未誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；3.pET-CR1轉(zhuǎn)化株，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；4.pET-CR1-NC轉(zhuǎn)化株，未誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；5.pET-CR1-NC轉(zhuǎn)化株，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；6.pET-CR1-C轉(zhuǎn)化株，未誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；7.pET-CR1-C轉(zhuǎn)化株，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；8.pET-CR1-N轉(zhuǎn)化株，未誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白；9.pET-CR1-N轉(zhuǎn)化株，誘導(dǎo)4小時(shí)取樣菌體總蛋白。圖9.CR-1在畢赤甲醇酵母系統(tǒng)中的表達(dá)，目的融合蛋白α-Factor-CR1大小約為25KD，其中蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker97，66，43，31，20，14KD；1.畢赤甲醇酵母空載體重組整合株GS115-pPIC9，誘導(dǎo)3天上清對(duì)照；2.含CR-1的畢赤甲醇酵母重組整合株GS115-CR1s，誘導(dǎo)1天上清；3.含CR-1的畢赤甲醇酵母重組整合株GS115-CR1s，誘導(dǎo)2天上清；4.含CR-1的畢赤甲醇酵母重組整合株GS115-CR1s，誘導(dǎo)3天上清；圖10-1.一例年青正常人心肌組織中CR-1的表達(dá)(免疫組化)檢測(cè)結(jié)果圖10-2.一例老年心肌梗塞病人心肌組織中CR-1的表達(dá)(免疫組化)檢測(cè)結(jié)果序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>與細(xì)胞重構(gòu)、傳導(dǎo)及凋亡相關(guān)的CR-1基因<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>756<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(145)..(570)<223><400>1gagtagttct cctgggtccg ctctgcgggc ttctgggaga tgtagtttct ggtctgtagg60caggacggaa ggagcggggg aggcccctta cgcaaactac aattcccggc ggggagcgcg 120gtgaagcggg ggtgggatct gaac atg gcg gcg gtg gta gct gct acg gcg 171Met Ala Ala Val Val Ala Ala Thr Ala1 5ctg aag ggc cgg ggg gcg aga aat gcc cgc gtc ctc cgg ggg att ctc 219Leu Lys Gly Arg Gly Ala Arg Asn Ala Arg Val Leu Arg Gly Ile Leu10 15 20 25gca gga gcc aca gct aac aag gct tct cat aac agg acc cgg gcc ctg 267Ala Gly Ala Thr Ala Asn Lys Ala Ser His Asn Arg Thr Arg Ala Leu30 35 40caa agc cac agc tcc cca gag ggc aag gag gaa cct gaa ccc cta tcc 315Gln Ser His Ser Ser Pro Glu Gly Lys Glu Glu Pro Glu Pro Leu Ser45 50 55ccg gag ctg gaa tac att ccc aga aag agg ggc aag aac ccc atg aaa 363Pro Glu Leu Glu Tyr Ile Pro Arg Lys Arg Gly Lys Asn Pro Met Lys60 65 70gct gtg gga ctg gcc tgg gcc atc ggc ttc cct tgt ggt atc ctc ctc 411Ala Val Gly Leu Ala Trp Ala Ile Gly Phe Pro Cys Gly Ile Leu Leu75 80 85 90ttc atc ctc acc aag cgg gaa gtg gac aag gac cgt gtg aag cag atg 459Phe Ile Leu Thr Lys Arg Glu Val Asp Lys Asp Arg Val Lys Gln Met95 100 105aag gct cgg cag aac atg cgg ttg tcc aac acg ggc gag tat gag agc 507Lys Ala Arg Gln Asn Met Arg Leu Ser Asn Thr Gly Glu Tyr Glu Ser110 115 120cag agg ttc agg gct tcc tcc cag agt gcc ccg tcc cct gat gtt ggg 555Gln Arg Phe Arg Ala Ser Ser Gln Ser Ala Pro Ser Pro Asp Val Gly125 130 135tct ggg gtg cag acc tgaggagcgc tgcgaccctc ctaggctatt gactgttaag 610Ser Gly Val Gln Thr140tcctcaggtt tggcccagat tccagttcgt gcctctgagg tccaccagag ggcgcatgaa 670gcccaggctg ttgccaaacc ctaccctgcc ccacaccaag gagccagcca aaggcaaata 730aagttattga gtgtttagta gaaagg756<210>2<211>142<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ala Ala Val Val Ala Ala Thr Ala Leu Lys Gly Arg Gly Ala Arg1 5 10 15Asn Ala Arg Val Leu Arg Gly Ile Leu Ala Gly Ala Thr Ala Asn Lys20 25 30Ala Ser His Asn Arg Thr Arg Ala Leu Gln Ser His Ser Ser Pro Glu35 40 45Gly Lys Glu Glu Pro Glu Pro Leu Ser Pro Glu Leu Glu Tyr Ile Pro50 55 60 65Arg Lys Arg Gly Lys Asn Pro Met Lys Ala Val Gly Leu Ala Trp Ala70 75 80Ile Gly Phe Pro Cys Gly Ile Leu Leu Phe Ile Leu Thr Lys Arg Glu85 90 95Val Asp Lys Asp Arg Val Lys Gln Met Lys Ala Arg Gln Asn Met Arg100 105 110Leu Ser Asn Thr Gly Glu Tyr Glu Ser Gln Arg Phe Arg Ala Ser Ser115120 125Gln Ser Ala Pro Ser Pro Asp Val Gly Ser Gly Val Gln Thr130 135 140
權(quán)利要求
1.與細(xì)胞重構(gòu)、傳導(dǎo)及凋亡相關(guān)的CR-1基因，其特征是所說(shuō)的CR-1基因由425個(gè)核苷酸組成(SEQ ID No3中的編碼區(qū))，編碼142個(gè)氨基酸(SEQ ID No4)。
2.CR-1基因在檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)、參與肌肉收縮、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡相關(guān)性中的應(yīng)用。
3.CR-1基因表達(dá)產(chǎn)物的制備，其特征是采用表達(dá)融合蛋白的方法，如利用含有谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因載體pGEX系統(tǒng)或含有Tag標(biāo)記的pET系列載體，或用真核表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)如pPIC9，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或真核細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物用CR-1抗體進(jìn)行檢測(cè)，用特異性蛋白酶切割融合蛋白，進(jìn)行純化。
4.CR-1抗體的制備，其特征是采用CR-1基因表達(dá)產(chǎn)物或合成的寡肽作為抗原，免疫家兔，獲得抗體。
5.CR-1抗體在制備與心肌或腫瘤相關(guān)疾病診斷劑或治療劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類功能基因，特別是與細(xì)胞重構(gòu)、傳導(dǎo)及凋亡相關(guān)的CR－1基因，該基因是綜合采用cDNA選擇、EST定位、基因組DNA序列分析、PCR反應(yīng)及克隆末端延展技術(shù)等方法得到的，通過(guò)用Northern、Western雜交檢測(cè)CR－1基因在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)免疫組化檢測(cè)CR－1在心肌疾患病人心肌組織中的表達(dá)，采用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與CR－1相互作用的蛋白，CR－1基因在大腸桿菌和真核細(xì)胞中的表達(dá)以及CR－1抗體的制備等實(shí)驗(yàn)，表明該基因有可能作為心肌和腫瘤疾病臨床診斷與治療的靶位。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1417223SQ0215365
公開日2003年5月14日 申請(qǐng)日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者王以光, 李天伯, 金由辛, 胡洋, 李斌, 馮爽, 包慧中 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所