專利名稱：一種核苷類抗生素a201a高產菌株及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海洋微生物基因工程和代謝工程領域，具體涉及一種通過基因工程對 M. thermotolerans SCSIO 00652的鏈霉素中核苷類抗生素A201A的生物合成基因簇進行遺傳改造，使mtdA的基因失活而獲得核苷類抗生素A201A高產的M. thermoto lerans SCSIO 00652 突變株 Ju3001。
背景技術：
在過去的十年間，海洋放線菌已成為新穎生物活性天然產物發(fā)現(xiàn)的新源泉。例如，Salinispora屬放線菌，可產生多種結構新穎和生物活性廣泛的化合物，如海洋放線菌 Salinispora tropica可產生化合物salinosporamide A，作為高效的蛋白酶體抑制劑該化合物已經進入癌癥治療的臨床試驗了。本研究單位(中國科學院南海海洋研究所)從中國南海北部深海海溝的沉積土里分離得到一個放線菌新屬菌種M. thermoto lerans SCSIO 00652，該菌株的發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制作用。與抗生素生物合成相關的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、轉運基因和調控基因。抗生素生物合成基因簇成功克隆后，可利用分子生物學基礎上的組合生物合成 (combinatorialbiosynthesis)禾口代謝工禾呈(metabolic engineering)技術來定向創(chuàng)造新結構、新活性化合物或者提高抗生素的產量，這無疑將大大豐富已有的資源，從而為解決或部分解決臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴重的問題。近年來發(fā)展起來的PCR-Targeting技術和接合轉移技術已在多種鏈霉菌中成功應用。PCR-Targeting技術是以RED重組技術為基礎的，RED同源重組系統(tǒng)由源于λ噬菌體的exo、bet、gam基因組成，在這3個基因產物的作用下，該系統(tǒng)能介導36bp以上的同源片段產生同源重組。接合轉移技術是發(fā)生在大腸桿菌與鏈霉菌之間，可以避開胞外核酸酶的影響，使DNA免遭核酸酶的降解，在某種程度上可以克服宿主對外源DNA的限制性修飾從而提高轉化效率，而且操作程序簡單，因此應用較為廣泛。PCR-Targeting技術和接合轉移技術為通過基因工程對鏈霉素中抗生素生物合成基因簇進行遺傳改造提供了一種方便而有效的途徑。核苷類抗生素A201A，其結構如式(I)所示，具有廣譜抑菌性，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制作用，對Maphylococcus aureus具有抗菌活性，對鹵蟲(Artemia salina)
具有致死性。
權利要求
1.一種核苷類抗生素A201A高產菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001， 其特征在于，該核苷類抗生素A201A高產菌株Μ. thermotolerans SCSIO 00652突變株 Ju3001是mtdA基因失活的Μ. thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如 SEQ IDN0. 1 所示。
2.一種權利要求1所述的核苷類抗生素A201A高產菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的構建方法，其特征在于，是將M. thermotolerans SCSIO 00652的 mtdA基因失活，由此獲得核苷類抗生素A201A高產菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據權利要求2所述的核苷類抗生素A201A高產菌株MthermotoleransSCSIO 00652突變株Ju3001的構建方法，其特征在于，所述的將Μ. thermotolerans SCSIO 00652 的 mtdA 基因失活是以 MtdAdelF 5' -gccgacctgctggagaccttctccgtcctggccgaggtgattccg gggatccgtcgacc-3 ； MtdAdelR 5' -gcacagccagttctcgacctccaggacgtgcatggtggctgtaggct ggagctgcttc-3'作為mtdA基因敲除引物，用PCR-Targeting進行同源重組，將同源重組的 cosmid與野生型的M. thermotolerans SCSIO 00652進行接合轉移對mtdA基因進行閱讀框取代，而構建得到mtdA基因失活的M. thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001。
4.一種在抗生素A201A生物合成作為負性調控子發(fā)揮作用的mtdA基因，其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.一種權利要求4所述的mtdA基因編碼的蛋白質，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開一種核苷類抗生素A201A高產菌株及其構建方法。核苷類抗生素A201A高產菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001是mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的通過失活M.thermotolerans SCSIO 00652的核苷類抗生素A201A生物合成基因簇上游的負性調控子mtdA基因而得到mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001，該M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的核苷類抗生素A201A產量是野生型的M.thermotolerans SCSIO 00652菌株的25倍。因此，該抗生素A201A高產菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突變株Ju3001的成功構建使抗生素A201A的產業(yè)化成為可能。
文檔編號C12N15/31GK102373171SQ20111034090
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權日2011年11月1日
發(fā)明者張長生, 朱清華, 李軍, 田新朋, 鞠建華, 馬俊英 申請人:中國科學院南海海洋研究所