專利名稱：一種高產(chǎn)可德膠菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種高產(chǎn)可德膠菌株及其制備方法。
背景技術(shù)：
多糖是由十個(gè)以上單糖通過苷鍵連接而成的聚糖，多糖資源豐富、來源廣泛，如可從陸地植物、海藻中提取，也可通過微生物發(fā)酵進(jìn)行生物合成。通常具有生物活性和凝膠化特性是一些多糖大分子具有的兩個(gè)最主要的性質(zhì)。生物活性是指多糖在參與生命過程中表現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、抗AIDS和抗氧化作用等。多糖的凝膠化是指多糖溶液或溶膠在一定條件下形成凝膠的性質(zhì)。目前，在食品、醫(yī)藥、化妝品、化工等工業(yè)領(lǐng)域，多糖已被廣泛用做膠凝劑、增稠劑、藥物載體、乳化劑、穩(wěn)定劑、膜材料等。多糖種類繁多，A-i， 3-d-glucan葡聚糖是多糖家族中最重要的成員之一。1964年，日本的原田篤也(Tokuya Harada)教授從土壤中分離了得到了糞產(chǎn)堿菌變種 10 CXAlcaligenes faecal is var. myxogenes 10 C3)，這種微生物能在 10% 的乙二醇為碳源的培養(yǎng)基中生成一種粘性物，里面含有琥珀?；嗵?。1966年，原田教授在制備琥珀酰多糖的過程中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加的葡萄糖完全被消耗，并且生成大量白色沉淀。他們認(rèn)為是有機(jī)體發(fā)生了變異而產(chǎn)生了這種不溶解的物質(zhì)，通過進(jìn)一步研究，分離出了所謂變異物種，發(fā)現(xiàn)它含有一種僅僅由A-l，3-d-葡聚糖苷鍵組成的聚合物，當(dāng)其水懸浮液加熱會(huì)形成一種彈性凝膠。根據(jù)其高溫凝固(Curdle) 的特性，將其命名為Curdlan(可德膠)。這也是世界上首次發(fā)現(xiàn)的唯一完全由A-l，3-d-葡聚糖苷鍵組成，并能在加熱情況下形成凝膠的多糖大分子。1968年起，日本武田(Takeda)化學(xué)股份有限公司(大阪，日本)開始與原田教授合作開展可德膠在食品工業(yè)上的應(yīng)用研究工作。分別就可德膠本身是否致癌，有無動(dòng)物體突變反應(yīng)等問題進(jìn)行了安全性測試，證實(shí)了可德膠為安全無毒性的物質(zhì)。在Takeda公司的要求下，美國的IRDC (國際研發(fā)協(xié)作組織)也對(duì)可德膠進(jìn)行了進(jìn)一步的安全測試，發(fā)現(xiàn)它安全無毒，并且具有提高人體免疫力，抗腫瘤的生物活性。美國FDA (食品藥物管理局)已經(jīng)推薦將其應(yīng)用于食品行業(yè)，成為繼黃原膠、結(jié)冷膠之后，第三個(gè)可直接作為食品添加劑用于食品配料中的多糖。1989年起，日本武田公司以Pureglucan TM為可德膠的商品名，在美國、日本、韓國、臺(tái)灣等地廣泛生產(chǎn)使用。我對(duì)于可德膠的研究起步較晚，但目前開展較廣泛的研究，并主要集中在發(fā)酵、分離、生產(chǎn)以及多糖合成的氮信號(hào)調(diào)控機(jī)制等方面。目前商用的可德膠， 其結(jié)構(gòu)中99%以上是由d-葡萄糖通過A-1，3葡萄糖苷鍵構(gòu)成的葡聚糖。在自然狀態(tài)下， 可德膠是以圓環(huán)狀的小顆粒形式存在的，與淀粉的結(jié)構(gòu)相類似。干燥的可德膠是一種無嗅、 無味的白色或灰白色粉末狀固體。從溶解性看，長鏈的可德膠不溶于水、醇類及許多有機(jī)溶劑，但可溶解于堿液、甲酸、二甲基亞砜、鎘乙二胺(cadoxen)溶液及25%碘化鉀溶液等通常易破壞氫鍵的物質(zhì)的溶液中，相反低聚合度(短鏈)的可德膠是水可溶的。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)活性葡聚糖多具有1，3糖苷鍵主鏈。目前國內(nèi)外對(duì)產(chǎn)可德膠合成菌株的基礎(chǔ)性研究較多，且主要集中于菌株篩選、發(fā)酵及可德膠(curdlan)提取、分離和純化，而應(yīng)用方面研究較少，目前可德膠生產(chǎn)存在產(chǎn)量低成本高的缺點(diǎn)，本發(fā)明正是基于此，通過物理與化學(xué)的誘變方法，結(jié)合特異性的篩選方法，獲得高產(chǎn)可德膠的發(fā)酵菌株來解決目前可德膠大規(guī)模生產(chǎn)中產(chǎn)量低成本高的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)可德膠菌株及其制備方法。本發(fā)明利用產(chǎn)可德膠ATCC31749的通過紫外線照射(UV)、亞硝基胍(NTG)和 UV+NTG復(fù)合處理等突變方法進(jìn)行改良，并結(jié)合苯酚藍(lán)染色來進(jìn)行篩選，從而獲得可德膠高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的高產(chǎn)可德膠菌株于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 5103，分類命名為產(chǎn)熱凝膠農(nóng)桿菌 {Agrobac teriumsp.)
上述的高產(chǎn)可德膠菌株的制備方法如下
利用UV (紫外線照射)、NTG (亞硝基胍)，UV + NTG復(fù)合誘變處理篩選突變農(nóng)桿菌菌株(ATCC31749)的菌體細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行同步誘變，在以蔗糖為主要碳源的培養(yǎng)基中，通過與可德膠有專一性結(jié)合苯胺藍(lán)染色，篩選出菌落大(生長速度快)、染色深(可德膠高產(chǎn))， 發(fā)酵周期時(shí)間縮短，遺傳性能穩(wěn)定，連續(xù)翻接5代后發(fā)酵性能維持良好的優(yōu)良菌株。具體步驟如下
1)將廣泛用于可德膠生產(chǎn)的出發(fā)菌株(Agrobacteriumsp. ATCC31749)接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，稀釋涂LB平板，于30°C培養(yǎng)3天；
2)菌懸液的制備在生長良好的LB平板上，加入5mL的生理鹽水，洗下菌體移入裝有15 mL生理鹽水的250 mL三角瓶中，震蕩使菌體充分分散，用無菌脫脂棉過濾至裝有30 mL生理鹽水的無菌三角瓶中，用顯微鏡觀測并通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌體細(xì)胞濃度為 IO6個(gè)/mL備用；
3)UV+ NTG復(fù)合誘變處理將處于對(duì)數(shù)期的菌懸液10 mL放入離心管中，加入NTG至 10 30 yg/mL，混勻，靜止30 min，然后吸取0. 5毫升加入到平底平板中，在預(yù)熱好的紫外燈下照射60 120 s ；
4)將上述照射液進(jìn)行離心(4000rpm, 10 min)，去上清，取沉淀；
5)用滅菌的10%甘油懸浮沉淀后，冰上放置10min, 4000 rpm 10 min離心離心去上清，取沉淀；
6重復(fù)上述第5步驟兩次后獲得的沉淀，重懸于10%的甘油中，稀釋涂布到高糖產(chǎn)膠培養(yǎng)指示平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺藍(lán)，培養(yǎng)基組成(g/L)蔗糖 100，KH2PO4 5. 0，MgSO4 · 7H20 0. 5，檸檬酸 5，瓊脂糖 15，1% (ν/ν) 無機(jī)鹽濃縮液(稱取I^eCl3, MnCl2, NaCl, CaCl2各1 g，加入去離子水溶解并定容至1L，調(diào) pH=5. 5飛.0)培養(yǎng)3天；
7)初篩在高糖指示平板上挑選菌落較大，粘稠，變藍(lán)較深的菌株來進(jìn)行復(fù)篩；
8)復(fù)篩將經(jīng)初篩選得的菌株先接到LB平板上，搖瓶發(fā)酵以確定發(fā)酵產(chǎn)可德膠較高的誘變菌株；
經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得一株發(fā)酵周期短，遺傳性能穩(wěn)定高產(chǎn)可德膠菌株(CGMCC No. 5103)。本發(fā)明的高產(chǎn)可德膠菌株蔗糖轉(zhuǎn)化率為72.6%，可德膠膠產(chǎn)量為34. 5 g/L。該菌株能利用蔗糖為唯一碳源高產(chǎn)可德膠，且遺傳性能穩(wěn)定，發(fā)酵周期短。以其它產(chǎn)可德膠菌株相比，利用該菌株生產(chǎn)可德膠具有生產(chǎn)成本低，可德膠產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短及性能穩(wěn)定等特點(diǎn)ο


圖1是誘變菌株的菌落形態(tài)。保藏登記號(hào)為CGMCC No. 5103的高產(chǎn)可德膠菌株于2011年8月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
具體實(shí)施例方式1)將出發(fā)菌株(Agrobacterium sp. ATCC31749)接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天， 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)液稀釋涂平板，于30°C培養(yǎng)3天；
2)菌懸液的制備在生長良好的LB純種斜面培養(yǎng)基中，加入5mL的生理鹽水，洗下菌體移入到裝有15 mL生理鹽水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，震蕩使菌體充分分散，用無菌脫脂棉過濾至裝有30 mL生理鹽水的無菌三角瓶中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為IO6個(gè) /mL備用；
3)UV+ NTG復(fù)合誘變處理將處于對(duì)數(shù)期的菌懸液10 mL放入離心管中，加入NTG 10 μ L/mL，混勻，靜止30 min，然后吸取5毫升加入到平底平板中，在預(yù)熱好的紫外燈下照射 6(Tl20s ；
4)將上述照射液進(jìn)行離心4000rpmUO min，去上清，取沉淀；
5)用滅菌的10%甘油懸浮沉淀后，冰上放置10min,4000 rpmUO min離心去上清，取
沉淀；
6)重復(fù)上述第5步驟兩次后獲得的沉淀，重懸于10%的甘油中，稀釋涂布到高糖產(chǎn)膠培養(yǎng)指示平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺藍(lán)，培養(yǎng) 3天；
7)初篩在高糖指示平板上挑選菌落較大，粘稠，變藍(lán)較深的菌株來進(jìn)行復(fù)篩；
8)復(fù)篩將經(jīng)初篩選得的菌株先接到LB平板上，搖瓶發(fā)酵以確定發(fā)酵產(chǎn)可德膠較高的誘變菌株；
經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得一株發(fā)酵周期短，遺傳性能穩(wěn)定高產(chǎn)可德膠菌株(CGMCC No. 5103)。連續(xù)翻接5代后發(fā)酵性能維持良好的高產(chǎn)可德膠農(nóng)桿菌。菌體形態(tài)觀察將篩選到的菌株稀釋涂平板，在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)定時(shí)進(jìn)行觀察，在高糖指示培養(yǎng)平板上生長快，產(chǎn)可德膠膠多，呈凸起狀，菌落光滑圓形。在平板上培養(yǎng)開始時(shí)菌體生長，菌落呈白色。當(dāng)可德膠產(chǎn)出時(shí)，菌落顏色加深。菌體的革蘭氏染色觀察取少量菌與載玻片上的一滴水混合涂片，用常規(guī)法進(jìn)行加熱固定，用草酸銨結(jié)晶紫染色1分鐘后水洗，然后滴加路哥氏碘液染2分鐘，水洗并吸干后用95%的乙醇進(jìn)行脫色，再水洗吸干，最后用0. 5%的番紅染色液染色25 s，用水沖洗，干燥后進(jìn)行鏡檢。結(jié)果顯示該試驗(yàn)菌株呈革蘭氏陰性。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)可德膠菌株，其特征在于該菌株保藏登記號(hào)為CGMCC No. 5103，分類命名Agrobacterium sp. 0
2.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)可德膠菌株的制備方法，其特征在于利用紫外線照射+亞硝基胍復(fù)合誘變處理篩選突變農(nóng)桿菌菌株ATCC31749的菌體細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，在以蔗糖為主要碳源的培養(yǎng)基中，通過與可德膠有專一性結(jié)合苯胺藍(lán)染色，篩選出菌落大、生長速度快、染色深、發(fā)酵周期時(shí)間縮短、遺傳性能穩(wěn)定，連續(xù)翻接5代后發(fā)酵性能維持良好的優(yōu)良菌株；具體步驟如下1)將出發(fā)菌株Agrobacteriumsp. ATCC31749接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)液稀釋涂平板，于30°C培養(yǎng)3天；2)菌懸液的制備在生長良好的LB純種斜面培養(yǎng)基中，加入生理鹽水，洗下菌體移入到裝有生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，震蕩使菌體充分分散，過濾至裝有生理鹽水的無菌三角瓶中，調(diào)整濃度為IO6個(gè)/mL備用；3)紫外線照射+亞硝基胍復(fù)合誘變處理將處于對(duì)數(shù)期的菌懸液放入離心管中，加入亞硝基胍到終濃度為10 30 yg/mL，混勻，靜止30 min，然后吸取5毫升加入到平底平板中，在預(yù)熱好的紫外燈下照射60 120 s ；4)將上述照射液進(jìn)行離心4000rpmUO min，去上清，取沉淀；5)用滅菌的10%甘油懸浮沉淀后，冰上放置10min,4000 rpmUO min離心去上清，取沉淀；6)重復(fù)上述第5步驟兩次后獲得的沉淀，重懸于10%的甘油中，稀釋涂布到高糖產(chǎn)膠培養(yǎng)指示平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，指示平板上加入20 μ L /50 mL苯胺藍(lán)，培養(yǎng) 3天；7)初篩在高糖指示平板上挑選菌落較大，粘稠，變藍(lán)較深的菌株來進(jìn)行復(fù)篩；8)復(fù)篩將經(jīng)初篩選得的菌株先接到LB平板上，搖瓶發(fā)酵以確定發(fā)酵產(chǎn)可德膠較高的誘變菌株；經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得一株發(fā)酵周期短，遺傳性能穩(wěn)定高產(chǎn)可德膠菌株CGMCC No. 5103。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)可德膠菌株的制備方法，其特征在于4)步驟中的發(fā)酵產(chǎn)膠培養(yǎng)基的組成為g/L 蔗糖100，KH2PO4 5. 0，MgSO4 · 7Η20 0. 5，檸檬酸5，1% ν/ν無機(jī)鹽濃縮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)可德膠菌株的制備方法，其特征在于所述的無機(jī)鹽濃縮液為用！^eCl3,MnCl2,NaCl,CaCl2各1 g，加入去離子水溶解并定容至1 L，調(diào)ρΗ=5· 5 6. O。
全文摘要
本發(fā)明是一種高產(chǎn)可德膠菌株及其制備方法。該菌株保藏登記號(hào)為CGMCC No.5103，分類命名為農(nóng)桿菌Agrobacteriumsp.。本發(fā)明的高產(chǎn)可德膠菌株蔗糖轉(zhuǎn)化率為72.6%，可德膠膠產(chǎn)量為34.5g/L。該菌株能利用蔗糖為唯一碳源高產(chǎn)可德膠，且遺傳性能穩(wěn)定，發(fā)酵周期短。以其它產(chǎn)可德膠菌株相比，利用該菌株生產(chǎn)可德膠具有生產(chǎn)成本低，可德膠產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短及性能穩(wěn)定等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102296045SQ20111027824
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者尚海麗, 李興義, 楊發(fā)祥, 毛自朝 申請(qǐng)人:云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司