專利名稱：一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預處理木質纖維素及發(fā)酵產氫的方法。
背景技術：
目前，世界能源需求主要由化石燃料滿足。然而，大量的科學證據表明，這種隨意使用化石燃料引起的全球氣候變化，具有潛在的災難性影響。因此，開發(fā)一種新型能源勢在必行，氫氣作為一種新型能源載體，具有可回收利用，清潔無污染以及燃燒值高等優(yōu)點。生產氫氣的方法有很多種，其中發(fā)酵法生物制氫技術以其較高的產氫速率和發(fā)酵過程節(jié)能環(huán)保，受到廣泛的關注。為了使發(fā)酵法生物制氫更具經濟競爭力，尋求一種可再生且廉價的基質是關鍵。木質纖維素原料例如農業(yè)廢棄物，廢紙和木片是地球上最廉價、最豐富的可再生資源之一。亞洲國家具有巨大的利用農業(yè)廢棄物生物制氫的潛力，僅我國每年農業(yè)廢棄物 (玉米秸稈、稻草和麥秸等)的產量可達7億噸左右，能量相當于5億噸標煤。據統(tǒng)計，其中，秸稈類利用率為33 %，但經過一定技術處理后利用的僅占2. 6 %，其余大部分只是作為燃料等直接利用。因此，選用秸稈類物質作為發(fā)酵產氫基質，開發(fā)前景非常廣闊。由木質纖維素到氫氣的轉化采用同步糖化發(fā)酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)工藝，即將纖維素的酶水解糖化過程與厭氧發(fā)酵產氫同步進行以節(jié)省時間并提高空間利用率。由于秸稈表層蠟質的保護作用、木質素和半纖維素的空間障礙效應以及纖維素的高結晶度和聚合度影響秸稈的生物轉化效率。因此，要充分有效利用農作物秸稈資源，就必須對秸稈進行預處理，破壞秸稈的表層蠟質、木質素-半纖維素的共價結合、纖維素的結晶結構等，使纖維素與木質素及半纖維素相互分離，增加纖維素分子與微生物或酶的接觸概率，實現提高秸稈生物轉化效率的目的。傳統(tǒng)的物理/化學預處理方法(如酸、堿高溫高壓預處理，蒸汽爆破、氨纖維爆破等)需要昂貴的儀器或設備，具有較高的能源需求，在預處理過程中產生大量的對后續(xù)發(fā)酵有抑制作用的糠醛類物質，同時損失大量的纖維素和半纖維素并且整個預處理過程成本高，對環(huán)境造成極大污染。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決現有發(fā)酵產氫過程中木質纖維素預處理能源需求高，污染環(huán)境以及產生發(fā)酵抑制物的問題，而提供一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法。生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法按以下步驟實現一、將白腐真菌接種于木質纖維素液體培養(yǎng)基中，在^TC的有氧條件下懸浮培養(yǎng) 10 20天，然后水洗，再置于105°C烘箱中烘干至恒重，獲得預處理后纖維素；二、將3L產氫菌營養(yǎng)鹽溶液與7L綠色木霉粗酶液混合，加入150 350g的預處理后纖維素，獲得同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基，然后通入純度為99. 99 %的氮氣，再接種產氫菌的種子液，在初始pH 值為6. 5、溫度為60°C、攪拌速度為150r/min的條件下進行厭氧發(fā)酵產氫M 72h ；即完成生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫；
其中步驟一中白腐真菌為Phanerochaete chrysosporium5. 776，保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心；步驟一中木質纖維素液體培養(yǎng)基每L由0. OOSg的FeS04、7. 5g的酵母粉、3g的 KH2P04、0. 034g的CaCl2、20g的葡萄糖、20g的木質纖維素、Iml的維生素液和余量的蒸餾水組成；所述木質纖維素稻草、麥秸或玉米秸稈粉；所述維生素液由25g的肌醇、Ig的煙堿酸、 Ig的泛酸、Ig的鹽酸吡哆醇、Ig的硫胺素鹽酸鹽、0. 2g的4-氨基苯甲酸和0. 05g的生物素溶于IOOOml蒸餾水中制成；步驟二中產氫菌營養(yǎng)鹽溶液每L由1. Og的氯化銨、1. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、1. 5g的磷酸二氫鉀、0. 5g的半胱氨酸、0. 5g的MgCl2 · 6H20、0. 2g的氯化鉀、2g的酵母粉、2g的蛋白胨、Iml的微量金屬元素貯液、Iml的維生素貯液和Iml的0. 1%。(w/v)刃天青組成；所述微量金屬元素貯液每L由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、0. Ig 的 MnCl2 · 4H20、2mg 的 CuCl2 · 2H20、0. 19g 的 CoCl2 · 6H20、24mg 的 NiCl2 · 6H20、36mg 的 Na2MO4 · H20、15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2SeO4 · 5H20組成；所述維生素貯液每L由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇組成；步驟二中綠色木霉粗酶液的制備綠色木霉在液體產酶培養(yǎng)基中，于^°C、150r/ min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天，然后在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，分離得到上清液即為綠色木霉粗酶液；所述綠色木霉的孢子接種量為1 X IO12 1 X IO16個/L，綠色木霉為Trichoderma viride3. 2876,分離號為糖研37，來源于廣東省甘蔗科學研究所；所述的液體產酶培養(yǎng)基每 L 由 2. Og 的 KH2PO4U. 4g 的(NH4) 2S04、0. 3g 的 MgSO4 ·7Η20、0. 3g 的 CaCl2、 20g的麩皮、IOg的玉米秸稈、5g的豆餅粉、Iml的微量金屬元素貯液和余量的蒸餾水組成； 所述的微量金屬元素貯液每L由5. Og的FeSO4 · 7H20、1. 6g的MgSO4U. 4g的ZnSO4 · 7H20、 2. Og的CoCl2和余量的蒸餾水組成；步驟二中產氫菌的種子液為接種量是4%的生長至對數期的液體懸濁液。本發(fā)明優(yōu)點①使用完全的生物方法完成由木質纖維素到氫氣的轉化過程，減少了木質纖維素產氫過程中的能源消耗，減少設備投入，不產生發(fā)酵抑制物，將產氫過程可能對環(huán)境造成的破壞減小到最低；②同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基中使用了對纖維素有較高降解能力的綠色木霉粗酶液，它對預處理后纖維素進行水解糖化，糖化率(糖化率是產糖量與纖維素中纖維素與半纖維素的比值)可以達到60-75%，沒有采用商品酶，使產氫的成本降低了 60% ；③本發(fā)明采用白腐真菌處理進行生物預木質纖維素取得較好的效果，木質素相對去除率達到55. 7%，產氫量為72. 6ml/g。


圖1為本發(fā)明中白腐真菌預處理15天后的玉米秸稈的掃描電鏡圖，圖2為未處理的玉米秸稈的掃描電鏡圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法按以下步驟實現
一、將白腐真菌接種于木質纖維素液體培養(yǎng)基中，在^rc的有氧條件下懸浮培養(yǎng) 10 20天，然后水洗，再置于105°c烘箱中烘干至恒重，獲得預處理后纖維素；二、將3L產氫菌營養(yǎng)鹽溶液與7L綠色木霉粗酶液混合，加入150 350g的預處理后纖維素，獲得同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基，然后通入純度為99. 99 %的氮氣，再接種產氫菌的種子液，在初始pH 值為6. 5、溫度為60°C、攪拌速度為150r/min的條件下進行厭氧發(fā)酵產氫M 72h ；即完成生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫；其中步驟一中白腐真菌為Phanerochaete chrysosporium5. 776，保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心；步驟一中木質纖維素液體培養(yǎng)基每L由0. OOSg的FeS04、7. 5g的酵母粉、3g的 KH2P04、0. 034g的CaCl2、20g的葡萄糖、20g的木質纖維素、Iml的維生素液和余量的蒸餾水組成；所述木質纖維素稻草、麥秸或玉米秸稈粉；所述維生素液由25g的肌醇、Ig的煙堿酸、 Ig的泛酸、Ig的鹽酸吡哆醇、Ig的硫胺素鹽酸鹽、0. 2g的4-氨基苯甲酸和0. 05g的生物素溶于IOOOml蒸餾水中制成；步驟二中產氫菌營養(yǎng)鹽溶液每L由1. Og的氯化銨、1. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、1. 5g的磷酸二氫鉀、0. 5g的半胱氨酸、0. 5g的MgCl2 · 6H20、0. 2g的氯化鉀、2g的酵母粉、2g的蛋白胨、Iml的微量金屬元素貯液、Iml的維生素貯液和Iml的0. 1%。(w/v)刃天青組成；所述微量金屬元素貯液每L由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、0. Ig 的 MnCl2 · 4H20、2mg 的 CuCl2 · 2H20、0. 19g 的 CoCl2 · 6H20、24mg 的 NiCl2 · 6H20、36mg 的 Na2MO4 · H20、15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2SeO4 · 5H20組成；所述維生素貯液每L由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇組成；步驟二中綠色木霉粗酶液的制備綠色木霉在液體產酶培養(yǎng)基中，于^°C、150r/ min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天，然后在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，分離得到上清液即為綠色木霉粗酶液；所述綠色木霉的孢子接種量為1 X IO12 1 X IO16個/L，綠色木霉為Trichoderma viride3. 2876,分離號為糖研37，來源于廣東省甘蔗科學研究所；所述的液體產酶培養(yǎng)基每 L 由 2. Og 的 KH2PO4U. 4g 的(NH4) 2S04、0. 3g 的 MgSO4 ·7Η20、0. 3g 的 CaCl2、 20g的麩皮、IOg的玉米秸稈、5g的豆餅粉、Iml的微量金屬元素貯液和余量的蒸餾水組成； 所述的微量金屬元素貯液每L由5. Og的FeSO4 · 7H20、1. 6g的MgSO4U. 4g的ZnSO4 · 7H20、 2. Og的CoCl2和余量的蒸餾水組成；步驟二中產氫菌的種子液為接種量是4%的生長至對數期的液體懸濁液。本實施方式步驟一中木質纖維素液體培養(yǎng)基中所述的玉米秸稈粉為玉米秸稈風干后，使用粉碎機粉碎過60目篩，然后再105°C下烘干至恒重。實驗一、將白腐真菌接種于木質纖維素液體培養(yǎng)基(采用玉米秸稈粉)中，在^TC的有氧條件下懸浮培養(yǎng)15天，然后水洗，再置于105°C烘箱中烘干至恒重，獲得預處理后纖維素；二、將3L產氫菌營養(yǎng)鹽溶液與7L綠色木霉粗酶液混合，加入150g的預處理后纖維素， 獲得同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基，然后通入純度為99. 99%的氮氣，再接種產氫菌的種子液， 在初始PH值為6. 5、溫度為60°C、攪拌速度為150r/min的條件下進行厭氧發(fā)酵產氫M 72h ；即完成生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫；
結果為，白腐真菌預處理15天后的玉米秸稈如圖1所述，與未處理的玉米秸稈 (見圖2、相對比，可見，未處理的玉米秸稈表觀結構緊密規(guī)整；而處理15天后的玉米秸稈木質纖維素結構遭到嚴重的破壞，存在很多的裂隙和空洞，這說明白腐真菌降解了一部分木質纖維素，據圖推測，其降解的主要是半纖維素和木質素，同時也可以看到，纖維素的基本骨架沒有被摧垮，這說明白腐真菌對木質纖維素進行了降解，但降解的纖維素量很少。使用白腐真菌預處理的玉米秸稈纖維素與木質素及半纖維素相互分離，增加了纖維素分子與酶的接觸概率，實現了提高秸稈酶解效率的目的。步驟二中24h后開始有氣體產出，對產出的氣體經過SC II型氣相色譜儀(上海分析儀器)檢測證明為氫氣；7 后氣體停止產出，通過計算可知最后的產氫量為72. 6ml/ g，木質素相對去除率達到61. 3%。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同點是步驟一中白腐真菌接種采用的是濃度為2X IO6個孢子/ml的孢子懸液，每瓶接種量為2X107個孢子。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同點是步驟二中產氫菌的種子液中的產氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌W16 (Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticumff16), Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16 在 2008 年第 33 期第 61M-6132 頁的《hternational Journal of Hydrogen Energy)) 中干丨J 登的名禾爾為"Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16，，的文章中公開。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法，其特征在于生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法按以下步驟實現一、將白腐真菌接種于木質纖維素液體培養(yǎng)基中，在^rc的有氧條件下懸浮培養(yǎng) ο 20天，然后水洗，再置于105°C烘箱中烘干至恒重，獲得預處理后纖維素；二、將3L產氫菌營養(yǎng)鹽溶液與7L綠色木霉粗酶液混合，加入150 350g的預處理后纖維素，獲得同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基，然后通入純度為99. 99 %的氮氣，再接種產氫菌的種子液，在初始pH值為 6. 5、溫度為60°C、攪拌速度為150r/min的條件下進行厭氧發(fā)酵產氫M 72h ；即完成生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫；其中步驟一中白腐真菌為 Phanerochaete chrysosporium5. 776 ；步驟一中木質纖維素液體培養(yǎng)基每L由0. OOSg的FeS04、7. 5g的酵母粉、3g的ΚΗ2Ρ04、0.034g的CaCl2、20g的葡萄糖、20g的木質纖維素、Iml的維生素液和余量的蒸餾水組成； 所述木質纖維素稻草、麥秸或玉米秸稈粉；所述維生素液由25g的肌醇、Ig的煙堿酸、Ig的泛酸、Ig的鹽酸吡哆醇、Ig的硫胺素鹽酸鹽、0. 2g的4-氨基苯甲酸和0. 05g的生物素溶于 IOOOml蒸餾水中制成；步驟二中產氫菌營養(yǎng)鹽溶液每L由1. Og的氯化銨、1. Og的氯化鈉、3g的磷酸氫二鉀、1.5g的磷酸二氫鉀、0. 5g的半胱氨酸、0. 5g的MgCl2 · 6H20、0. 2g的氯化鉀、2g的酵母粉、 2g的蛋白胨、Iml的微量金屬元素貯液、Iml的維生素貯液和Iml的0. 1%。(w/v)刃天青組成；所述微量金屬元素貯液每L由1. 5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、0. Ig 的 MnCl2 · 4H20、2mg 的 CuCl2 · 2H20、0. 19g 的 CoCl2 · 6H20、24mg 的 NiCl2 · 6H20、36mg 的 Na2MO4 · H20、15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2SeO4 · 5H20組成；所述維生素貯液每L由50. Omg 的硫辛酸、20. Omg的生物素、0. 35g的煙酸、5. Omg的鹽酸硫胺素、50. Omg的對氨基苯甲酸、 20. Omg的葉酸、50. Omg的泛酸鈣、1. Omg的維生素B12和100. Omg的鹽酸吡哆醇組成；步驟二中綠色木霉粗酶液的制備綠色木霉在液體產酶培養(yǎng)基中，于^TC、150r/min 的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天，然后在4°C、8000r/min條件下離心lOmin，分離得到上清液即為綠色木霉粗酶液；所述綠色木霉的孢子接種量為1 X IO12 1 X IO16個/L，綠色木霉為 Trichoderma viride3.觀76，分離號為糖研37，來源于廣東省甘蔗科學研究所；所述的液體產酶培養(yǎng)基每 L 由 2. Og 的 KH2PO4U. 4g 的(NH4)2S04、0. 3g 的 MgSO4 · 7H20、0. 3g 的 CaCl2、 20g的麩皮、IOg的玉米秸稈、5g的豆餅粉、Iml的微量金屬元素貯液和余量的蒸餾水組成； 所述的微量金屬元素貯液每L由5. Og的FeSO4 · 7H20、1. 6g的MgSO4U. 4g的ZnSO4 · 7H20、2.Og的CoCl2和余量的蒸餾水組成；步驟二中產氫菌的種子液為接種量是4%的生長至對數期的液體懸濁液。
2.根據權利要求1所述的一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法，其特征在于步驟一中白腐真菌接種采用的是濃度為2 X IO6個孢子/ml的孢子懸液，每瓶接種量為2 X IO7個孢子。
3.根據權利要求1所述的一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法，其特征在于步驟二中產氫菌的種子液中的產氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌 W16(Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W 16)，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16在2008年第33期第6124-6132頁的《Hiternational Journal of Hydrogen Energy》中干丨J登的名禾爾為“Dark fermentation of xylose and glucose mixusing isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum W16"的文章中公開。
全文摘要
一種生物預處理木質纖維素及同步糖化發(fā)酵產氫的方法，它涉及一種預處理木質纖維素及發(fā)酵產氫的方法。本發(fā)明解決了現有發(fā)酵產氫過程中木質纖維素預處理能源需求高，污染環(huán)境以及產生發(fā)酵抑制物的問題。方法一、白腐真菌接種于木質纖維素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經水洗、烘干后得預處理后纖維素；二、產氫菌營養(yǎng)鹽溶液與綠色木霉粗酶液混合，加入預處理后纖維素，得同步糖化發(fā)酵產氫培養(yǎng)基，然后通入氮氣，再接種產氫菌的種子液進行厭氧發(fā)酵產氫即完成。本發(fā)明減少了木質纖維素產氫過程中的能源消耗，減少設備投入，不產生發(fā)酵抑制物，將產氫過程可能對環(huán)境造成的破壞減小到最低；本發(fā)明中木質素相對去除率達到55.7％，產氫量為72.6ml/g。
文檔編號C12P3/00GK102321671SQ20111027817
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權日2011年9月19日
發(fā)明者任南琪, 任宏宇, 曹廣麗, 王愛杰, 趙磊 申請人:哈爾濱工業(yè)大學