專利名稱：人胸腔積液中中期因子熒光定量pcr檢測試劑盒的開發(fā)及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域；本發(fā)明揭示中期因子在肺癌引起的惡性胸腔積液中的重要作用，闡明中期因子可以作為惡性胸腔積液的輔助診斷指標，以及中期因子的表達水平在惡性胸腔積液化學治療中的作用。
背景技術：
惡性胸腔積液是肺癌的常見臨床表現(xiàn)，其出現(xiàn)常提示預后不良。目前診斷惡性胸腔積液的標準方法仍然是基于細胞病理學檢查。然而，即使重復的胸腔穿刺取樣可在一定程度上提高病理檢出率，通常情況下該方法診斷的敏感性只有50% -70%。在細胞學診斷陰性的情況下，隨機胸膜活檢在約7%的伴發(fā)胸水的病人中可提高其檢出率，然而卻有很高的手術相關并發(fā)癥的危險，難以得到廣泛應用。在臨床中，我們常常遇到反復病理學檢查陰性而臨床表現(xiàn)高度懷疑為惡性體腔積液的病人；甚至在有些小量積液的情況下不能滿足反復病理送檢的要求而使得積液的性質難以明確。此外，以藥物遺傳學為平臺檢測藥物療效相關基因的表達及變異情況在惡性腫瘤化療藥物選擇上有著極大的指導潛力。因此，如何充分利用惡性胸腔積液中的分子生物學信息以利于患者的診斷和治療吸引了越來越多的關注。中期因子(Midkine，MK)屬于肝素結合生長因子家族中的一員，是一種重要的生長分化因子。近年研究發(fā)現(xiàn)MK基因及蛋白可在多種惡性實體瘤中高表達，而在正常組織中低表達。這種高度組織分布特異性決定了其在腫瘤早期診斷中的重要價值。MK的表達與腫瘤發(fā)展的進程及嚴重程度密切相關，MK可能通過誘發(fā)瘤細胞的發(fā)生、促纖溶和細胞趨化、促進腫瘤血管的形成及增強腫瘤細胞的耐藥性等機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近的研究表明，MK分子的表達與化療藥物Imatinib的療效密切相關。然而相關的研究均局限在實體瘤水平。MK作為一種可分泌的因子，在腫瘤患者的尿液和血液中均可檢出，而在胸腔積液這一體液中尚未明確MK的具體作用，也未有研究報道其與惡性胸腔積液診斷和治療的關系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供中期因子基因檢測的方法和用途，用于作為肺癌引起的惡性胸腔積液的輔助診斷指標，或者作為惡性腫瘤治療藥物篩選的靶點。本發(fā)明的第一個方面，提供一種檢測良惡性胸腔積液上清中中期因子基因表達的方法，其特征在于，可從Iml胸腔積液上清中檢測出中期因子mRNA的表達水平，敏感性高，
可重復性強。本發(fā)明的第二個方面，提供一種中期因子基因的用途，用于作為惡性胸腔積液的輔助診斷指標；其特征在于，利用胸腔積液中中期因子和癌胚抗原的聯(lián)合檢測提高診斷惡性胸腔積液的敏感性、特異性和準確性。本發(fā)明的第三個方面，提供一種惡性胸腔積液個體化治療的方法，其特征在于，利、用惡性胸腔積液中中期因子的水平預測化療藥物順鉬的療效。


圖一惡性胸腔積液患者積液上清中MK的表達量顯著高于良性積液患者；圖二惡性胸腔積液患者積液上清中CEA的表達量顯著高于良性積液患者；圖三CEA (A)和MK⑶診斷價值的ROC曲線；圖四CEA和MK診斷性指標的敏感性、特異性和準確性；圖五肺癌細胞系中MK表達與藥物敏感性的關系A. MK mRNA在三株肺癌細胞系的表達水平；B.順鉬、健擇和多西紫杉醇對三株肺癌細胞系的藥物敏感性；圖六順鉬(A)、多西紫杉醇⑶和健擇(C)對惡性胸腔積液中原代腫瘤細胞的抑制率與MK表達水平的相關性分析。
具體實施例方式本發(fā)明經(jīng)過廣泛的研究，首次證明了中期因子基因與惡性胸腔積液密切相關，并且中期因子基因可以作為惡性胸腔積液的一個輔助診斷指標。另外，本發(fā)明還研究了中期因子在惡性腫瘤個體化治療藥物篩選中的作用，從而為治療惡性腫瘤提供了一個藥物靶點。在上述基礎上發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明還涉及定性及定量檢測所述中期因子基因的水平，從而鑒別診斷良惡性胸腔積液的方法，這些方法是本領域所熟知的，它包括(但不限于)游離RNA提取、逆轉錄cDNA、實時熒光定量PCR等。所述中期因子基因的特異性引物也包含在本發(fā)明內(nèi)，它們用于檢測中期因子基因的表達水平?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，所述中期因子基因有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)I.用于制備惡性腫瘤臨床檢測的試劑盒；2.用于作為惡性胸腔積液臨床診斷的輔助指標；3.用于篩選防治惡性胸腔積液的藥物；4.用于評估藥物對于惡性胸腔積液的治療效果、預后分析以及治療手段的挑選；5.直接用其單克隆抗體對惡性胸腔積液進行治療。本發(fā)明的優(yōu)點在于I.首次證明中期因子基因與惡性胸腔積液的相關性，使其可以成為惡性胸腔積液臨床診斷的檢測指標,為該疾病的防治提供了祀點；2.分析了大量惡性胸腔積液患者中中期因子基因的表達水平，并與良性積液相比較,結果準確可靠。材料及方法I.研究對象本發(fā)明共收集168例胸腔積液，均來自南京市胸科醫(yī)院門診與病房患者，其中惡性胸腔積液為107例，患者的原發(fā)腫瘤均為肺腺癌IV期；良性胸腔積液為61例，均為肺結核患者。168例患者中，男性113例，女性55例;< 60歲的89例，> 60歲的79例。
2.標本的采集和處理為提取標本中的游離RNA，在無菌條件下行胸腔穿刺術，最初的200ml液體棄去后再收集液體，以避免導管內(nèi)、皮膚表面的RNA酶污染；以滅菌一次性空針抽取胸水10ml，注入事先加入0. 5ml 3. 8%拘緣酸鈉的無RNA酶管中；4000g，4°C離心10分鐘，小心將上清轉移至新管；4000g，4°C再次離心10分鐘，吸取上2/3的上清至新管，以去除殘存細胞可能；將上清Iml/管分裝，-80°C凍存留待提取RNA用，每個分裝物只能凍融一次。3.胸腔積液標本的生化檢測胸水標本的生化指標由南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生化室檢測并報告，檢測 指標包括白細胞計數(shù)(WBC, X IO9)、中性粒細胞計數(shù)(Neutrophil, %)、淋巴細胞計數(shù)(Lymphocyte % )、總蛋白(Total protein, g/1)、乳酸脫氫酶(LDH, U/1)、腺苷酸脫氫酶(ADA, U/1)。4.胸腔積液標本的腫瘤標記物CEA檢測采用ELISA試劑盒檢測胸水中的CEA表達水平，具體步驟如下取出96孔板，在相應孔中加入50 u I標準品或標本；每孔加100 u I酶結合物，混勻30秒，37°C放置60分鐘；倒出孔內(nèi)混合液；每孔加350 u I洗滌液洗5次，并去除殘余水珠；每孔加TMB 100 U 1，混勻10秒，37°C避光放置15分鐘；每孔加100 ill反應中止液；混勻30秒，在30分鐘內(nèi)用酶標儀測450nm的OD值；用標準曲線計算CEA的表達水平(單位ng/ml)。5.游離RNA的提取和逆轉錄取Iml上清，融化后加入3ml Trizol LS，室溫震蕩15分鐘；12000g，4°C離心15分鐘；棄沉淀，吸取上清至新管，加入3. 2ml氯仿，劇烈震蕩后室溫放置15分鐘；12000g，4°C離心15分鐘；取上層無色水相，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，輕輕顛倒混勻10次，-200C過夜；12000g，4°C離心15分鐘；除上清，用Iml 75%的乙醇洗滌RNA沉淀，用7500g的速度在4°C離心5分鐘，除上清后干燥15分鐘；用不含RNA酶(RNase free)的水溶解RNA，60°C水浴10分鐘，重溶RNA，用核酸定量儀定量。在冰上配制逆轉錄反應液，體系為5XExScript Buffer 4 U I> dNTP MixtureI U I、Random 6mers I u I、ExScriptTM Rtase 0. 5 u 1> RNase Inhibitor 0. 5 u I、總 RNAI U g、ddH20 12 ill。逆轉錄反應條件如下42°C 15分鐘；95°C 2分鐘。cDNA于_20°C保存。6.實時熒光定量PCR加樣體系為SYBRGreen Master Mix 10yl、引物(上游 I ii 1，下游 I U I)、稀釋好的模板cDNA 2iil、ddH20 6 u I0每個樣設3個復孔并設定P-actin作為內(nèi)參。RealTime PCR循環(huán)參數(shù)95°C預變性10分，95°C變性15秒，60°C 30秒，72°C 30秒，40個循環(huán)。熔融曲線的循環(huán)參數(shù)95°C I分鐘，從55°C到95°C以0. 1°C/秒升溫。根據(jù)公式2_AAeHf算目的基因mRNA的表達。7.引物設計本發(fā)明引物根據(jù)Genebank提供的cDNA序列，利用Lasergene軟件設計如下了引物MK普通PCR引物上游5，ATG CAG CAC CGA GGC TTC CT 3，SEQ ID 2下游5，ATC CAG GCT TGG CGT CGT CTA GT 3，SEQ ID :3
MK實時熒光定量PCR引物上游5，TGCCCTGCAACTGGAAGAA 3，SEQ ID 4下游5，CTTGGTGACGCGGATGGT 3，SEQ ID :5引物由Invitrogen公司合成。8.原代腫瘤細胞的分離和培養(yǎng)
無菌條件下行胸腔穿刺術，消毒留置導管接口后接引流袋，控制引流速度，收集液體總量至200 800ml ;將收集的胸腔積液分裝至50ml離心管中，1500rpm離心10分鐘，棄上清(留少量上清重懸細胞)；在151111離心管中將7ml細胞懸液小心加至7ml Ficoll之上，2200rpm離心25分鐘；吸取中間白膜層至新管；加入40ml D_Hank’s洗漆細胞，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清；如沉淀中含有較多的紅細胞，加入紅細胞裂解液20ml，輕輕吹打后4°C靜置5分鐘后IOOOrpm離心10分鐘，血性標本需重復2 3次；用含抗生素的RPMI 1640洗漆細胞，IOOOrpm離心10分鐘,棄上清；加入洗漆液30ml,輕輕吹打，1500rpm離心10分鐘，棄上清；細胞沉淀用含抗生素的RPMI 1640重懸，臺盼蘭染色計算細胞活力；細胞計數(shù)，調整密度為I X 105/ml用于CCK8法藥物敏感性測定，并留取適量細胞用于后續(xù)RNA抽提。9. CCK8法藥物敏感性測定取I. 0 X 105/ml上述原代細胞接種于96孔U型懸浮培養(yǎng)板中，每孔100 U I細胞懸液；加入含藥物的培養(yǎng)液(每組濃度設立3個復孔)100 u 1，并同時設立等量細胞不加藥物的對照組和不含細胞的空白組?？瞻捉M和對照組加入等量培養(yǎng)液；將細胞置于37°C、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育72小時后取出；每孔加入10 u I的含WST-8的CCK8顯色劑，繼續(xù)孵育4小時；置于自動酶標儀上，自動酶標儀以490nm波長測定各孔的吸光度(OD)值，用復孔吸光度平均值進行比較；用測定的吸光度(OD)值進一步計算腫瘤細胞抑制率)。抑制率(Inhibition Rate, IR)=(對照孔A值-實驗孔A值)/ (對照孔A值-空白孔A值)X100%。實施例I :惡性胸腔積液患者積液上清中MK的表達量顯著高于良性積液患者；本發(fā)明取了 107例肺腺癌患者和61例肺結核患者的胸腔積液標本，離心取積液上清，利用Trizol提取出總RNA，用反轉錄酶反轉錄成cDNA，然后利用實時定量PCR檢測了 MK的mRNA的水平。結果發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液中MK的mRNA水平要顯著良性積液(圖I)。實施例2 :惡性胸腔積液患者積液上清中CEA的表達量顯著高于良性積液患者；將上述168例良惡性胸腔積液標本進行常規(guī)胸水生化檢測(包括白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、總蛋白、乳酸脫氫酶和腺苷酸脫氫酶)，良惡性標本沒有明顯差異。將上述168例良惡性胸腔積液標本離心，取積液上清，用ELISA法檢測腫瘤標記物CEA的水平。結果表明，惡性胸腔積液中CEA的水平要顯著良性積液(圖2)。實施例3 =CEA(A)和MK⑶診斷價值的ROC曲線；我們進一步用ROC曲線及曲線下面積來分析MK在良惡性胸腹腔積液中的診斷價值。ROC(receive operating characteristic curve)曲線，全稱受試者工作特征曲線，是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，是用構圖法揭示敏感性和特異性的相互關系。它通過將連續(xù)變量設定出多個不同的臨界值，從而計算出一系列敏感性和特異性，再以敏感性為縱坐標、(I-特異性)為橫坐標繪制成曲線，曲線下面積越大，診斷準確性越高。我們以168例標本中CEA和MK的表達水平分別繪制了 ROC曲線。CEA的ROC曲線下面積為 0. 88(95% Cl = 0. 82 0. 94) ,MK 的 ROC 曲線下面積為 0. 92(95% Cl = 0. 85 0. 97)，高于CEA?？梢奀EA和MK的表達均可用于良惡性胸腔積液的診斷(圖3)。 實施例4 =CEA和MK診斷性指標的敏感性、特異性和準確性；ROC曲線的另一個潛在的作用是檢測的最佳閾值。我們進一步取ROC曲線的最左上方點為臨界值(Cut-off value)評估CEA和MK的各項診斷指標。CEA的臨界值為12. 5ng/ml, MK的臨界值為0. 05。在此臨界值下，CEA的敏感性為72. 9%，特異性為90. 2%，陽性預測值92.9%,陰性預測值65.5%,準確性為79. 2%0 MK的敏感性為77.5%,特異性為 88. 5%,陽性預測值92. 2%,陰性預測值69. 2%,準確性為81.5%。將CEA和MK兩者聯(lián)合敏感性為86. 9%，特異性91. 8%，準確性為88. 7% (圖4)。與CEA相比，MK作為診斷指標具有較高的敏感性和較低的特異性。而將兩個分子聯(lián)合檢測，無論是診斷的敏感性、特異性還是準確性都顯著提高。實施例5 :肺癌細胞系中MK表達與藥物敏感性的關系；本發(fā)明為證實MK表達水平與藥物敏感性的關系，首先在三株肺癌細胞系中用RT-PCR方法檢測了 MK基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)MK在A549細胞中表達最高，在SPC-Al細胞中其次，在LTEP-A2細胞中表達最低(圖5A)。將臨床三種常見的化療藥物順鉬、多西紫杉醇和健擇分別作用于三株腫瘤細胞48h后，分析藥物對腫瘤細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)。結果表明，順鉬對三株細胞的IC5tl值與MK表達水平趨勢一致，而多西紫杉醇和健擇對細胞的作用與MK表達水平無關(圖5B)。實施例6 :化療藥物對惡性胸腔積液中原代腫瘤細胞的抑制率與MK表達水平的相關性分析。本發(fā)明進一步在惡性胸腔積液原代細胞中驗證了 MK表達水平與藥物作用的相關性。取46例惡性胸腔積液的細胞懸液，用密度梯度離心法取白膜層的混合細胞，利用無血清培養(yǎng)法和懸浮細胞培養(yǎng)法獲取腫瘤細胞，CCK-8法測定化療藥物對原代腫瘤細胞的抑制率，并與MK表達水平進行相關性分析。結果表明，MK的表達水平與順鉬的抑制率呈顯著負相關(R = -0. 72，P < 0. 01)，而與多西紫杉醇或健擇的抑制率無相關性。根據(jù)這些實施例，本發(fā)明證明了中期因子與惡性胸腔積液的密切關系，在肺腺癌患者的惡性胸腔積液中，能夠檢測到高水平的MK基因表達，這揭示了其可以作為惡性胸腔積液的一個輔助診斷指標。本發(fā)明還通過腫瘤細胞系和原代腫瘤細胞實驗，證明了 MK表達水平與化療藥物順鉬的作用顯著相關，這也使得MK基因成為了惡性胸腔積液治療中預測化療藥物療效的一個靶點。在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領域的技術人員可以對本發(fā)明作各種改動，這些等價形式同樣落于本申請所附的權利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種利用分子生物學技術檢測胸腔積液上清中中期因子基因表達方法，其特征在于，可從Iml胸腔積液上清中檢測出中期因子mRNA的表達水平。所述的中期因子具有SEQID 1所示的序列。
2.一種用于胸腔積液中中期因子的熒光PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒含有0. 5ml3. 8%拘緣酸鈉的無RNA酶管、3ml Trizol LS、異丙醇、75%的乙醇、RNA保存液、逆轉錄反應液、正常人對照cDNA、SYBR Green Master Mix以及權利要求I中的引物。
3.—種良惡性胸腔積液鑒別診斷的方法，其特征在于，利用胸腔積液中中期因子和癌胚抗原的聯(lián)合檢測診斷惡性胸腔積液。其中，中期因子基因檢測采用權利要求2所述的方法。
4.一種惡性胸腔積液個體化治療的方法，其特征在于，利用惡性胸腔積液中中期因子的水平預測化療藥物順鉬的療效。其中，中期因子基因檢測采用權利要求2所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，公開了一種中期因子mRNA在胸腔積液游離上清中的檢測方法及其試劑盒。其方法特征在于，從GenBank中找出已知的人中期因子的mRNA全序列，設計一對熒光定量PCR引物，利用熒光PCR儀對胸腔積液中中期因子的mRNA含量進行檢測。本發(fā)明還提供了基于本方法的試劑盒對胸腔積液中期因子游離mRNA進行檢測，并結合癌胚抗原的檢測對惡性胸腔積液進行診斷。本方法及試劑盒診斷的敏感性(86.9％)、特異性(91.8％)和準確性(88.7％)，并可對順鉑的個體化用藥起指導作用。
文檔編號C12Q1/68GK102634570SQ20111017393
公開日2012年8月15日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權日2011年6月27日
發(fā)明者侯亞義, 呂明明, 王婷婷 申請人:南京大學