專利名稱：：通過trem-1的炎癥治療、檢測和監(jiān)控的制作方法通過TREM-1的炎癥治療、檢測和監(jiān)控相關(guān)申請的交叉引用本申請主張2007年11月2日遞交的美國臨時專利申請No.61/001，687、2007年4月11日遞交的美國臨時專利申請No.60/923，131、2007年2月28日遞交的美國臨時專利申請No.60/904，264和2007年1月16日遞交的美國臨時專利申請No.60/880，804的優(yōu)先權(quán)，其完整公開通過引用作為參考。
背景技術(shù)：
：雖然RA的確切病因不明，已有人提出RA的形成涉及傳染病或環(huán)境暴露(Firestein(2005)JClin，Rheumatology11(3Supp.):S39-44)。先天免疫的局部誘導(dǎo)可以激活滑膜內(nèi)層中的細胞并準(zhǔn)備好遺傳性易感個體中后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的區(qū)域(Firestein(2005)JClin.Rheumatology11(3supp.):S39-44)。已確診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜的特征在于顯著的滑膜內(nèi)膜內(nèi)層增生、血管分布增加和內(nèi)層之下炎性細胞的積聚。對RA滑膜的活檢也揭示了許多促炎細胞因子，如TNF-a，IL-l(J，IL-6，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的自發(fā)產(chǎn)生(Feldman等。(1996)Ann.Rev.Immunol.14:397-440)。發(fā)現(xiàn)中和TNF-a活性的抗體取消了多種細胞因子的產(chǎn)生，這導(dǎo)致了新型抗TNF-a療法治療RA的發(fā)現(xiàn)。最近的臨床結(jié)果顯示了RA的不一致性，并提示了其他因素髓樣細胞表達的觸發(fā)受體-1(TREM-1)是最近發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白樣細胞表面受體，主要表達在中性粒細胞和CD14*單核細胞的亞群上(Colo腿等。(2000年)SeminarsinImmunol.12(2):121-27)。TREM-1有短的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，且TREM-1信號傳導(dǎo)是通過銜接蛋白DAP12/TyproBP介導(dǎo)的。DAP12/TyroBP是一種具有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的跨膜蛋白，并作為銜接蛋白行使功能，與TREM-1和其他跨膜受體結(jié)合。在急性炎癥過程中，TREM-1表達凈皮各種Toll樣受體(TLR)配體上調(diào)(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Bleharski等人(2003)丄Immunol.170(7):3812-18;Murakami等人(2006)54(2):455-62)。例如，已經(jīng)暗示TREM-1涉及與膿毒癥相關(guān)的急性炎癥(Colonna(2003)Nat.Rev.Immun.3(6):445-53)。在膿毒癥中，細胞表面TREM-1和可溶性TREM-1的表達以一種與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)的方式升高(Gibot等人(2005)NewEnglandJ.Med.350(5):451-58;Gibot等人(2005)CriticalCareMed.33(4):792-96)。在尿酸一鈉(MSU)誘導(dǎo)的痛風(fēng)炎癥才莫型中，在浸潤的腹膜巨噬細胞和中性粒細胞中快速誘導(dǎo)TREM-1的表達。此外，TREM-1的活化刺激多種促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。此外，TREM-1與TLR和Nod樣受體在這些細胞因子產(chǎn)生中的協(xié)同效應(yīng)放大了炎癥反應(yīng)(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Bleharski等人(20(B)J.Immunol.170(7):3812畫18;Netea等人(2006)J.LeukocyteBiol.80(6):1454-61)。這些數(shù)據(jù)表明了增加的TREM-1表達和TREM-1表達細胞向炎癥位點的遷移可能通過炎癥反應(yīng)的放大而促成急性炎癥。TREM-1在急性炎癥反應(yīng)中的作用，還通過使用TREM-1胞外域-Fc融合蛋白或TREM-1胞外域合成肽保護小鼠免于致死性LPS或細菌誘導(dǎo)的膿毒性休克而證實(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Gibot等人(2004)J.Exp.Med.200(11):1419-26)。TREM畫l曙FC的也可防止酵母多糖-A誘導(dǎo)的肉芽腫形成，這表明TREM-1可以在慢性炎癥以及急性炎癥中發(fā)揮作用(Nochi等人(2003)Am.J.Path.162(4):1191-201)。此外，越來越多的證據(jù)表明，可溶形式TREM-1的循環(huán)水平是針對多種炎癥性疾病的生物標(biāo)志物，包括膿毒癥、肺炎、急性胰腺炎、消化性潰瘍(Gibot等人(2005)IntensiveCareMed.31(4):594-97;Gibot等人(2004)NewEnglandJ.Med.350(5):451-58;Wang等人(2004)WorldJ.ofGastroenterology10(18):2744-46;Koussoulas等人(2006)Eur.J.Gastroenterology&Hepatology18(4):375-79),發(fā)明概述本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)TREM-1和/或DAP12/TyroBP的過表達與自身免疫性疾病和/或炎癥性疾病的出現(xiàn)有關(guān)。因此，TREM-1和/或Dapl2/TyroBP是用于自身免疫性疾病和炎癥性疾病的預(yù)防和治療的新型治療耙標(biāo)。一方面，本發(fā)明涉及4吏用TREM-1和/或DAP12/TyroBP拮抗劑治療或預(yù)防炎癥性疾病。能夠用于本發(fā)明的拮抗劑包括，例如，抗體(包括例如抗體片段、單鏈抗體Fv、產(chǎn)生自任何物種的單結(jié)構(gòu)域抗體，所述物種包括例如人、小鼠、駱駝、駱馬、鯊魚、山羊、兔和牛，更詳細的說明見下文)；可溶性受體(包括截短的受體、天然可溶性受體、或包含與笫二蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白的Fc部分)融合的受體(或其片段)的融合蛋白)；肽抑制劑；小分子；配體融合物和結(jié)合蛋白。TREM-1和DAP12/TyroBP是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效生物標(biāo)志物，因為這些基因在患有類風(fēng)濕性性關(guān)節(jié)炎的個體中#達。TREM-1是表達在特定細胞類型上的細胞受體，如中性粒細胞和單核細胞亞群，而且TREM-1也以可溶性形式存在。TREM-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由銜接蛋白DAP12/TyroBP介導(dǎo)。TREM-1的活化誘導(dǎo)促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。因此，TREM-1提高的表達可能會導(dǎo)致或促使在RA、哮喘和其它炎癥疾病中觀察到的炎癥，如慢性炎癥性疾病和呼吸系統(tǒng)炎癥/疾病。所以，TREM-1和/或DAP12/TyroBP是用于治療、調(diào)節(jié)和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它炎癥疾病相關(guān)的癥狀有前途的治療靶標(biāo)?！矫妫景l(fā)明提供了一種通過減少TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來治療炎癥性疾病的方法，這種炎癥性疾病諸如，例如，慢性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哮喘)。減少TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括調(diào)節(jié)、抑制和/或拮抗TREM-1受體和/或涉及TREM-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他分子(如DAP12/TyroBP)，從而減輕、治療、預(yù)防、緩和和/或改善與TREM-1介導(dǎo)的炎癥相關(guān)的癥狀。在一些實施方案中，通過抑制TREM-1轉(zhuǎn)錄、選擇性切割內(nèi)源性TREM-lmRNA或抑制內(nèi)源性TREM-1mRNA翻譯來降低TREM-1蛋白表達。例如，TREM-1蛋白的表達可以通過給予干擾RNA來降低，例如shRNA(如，SEQIDNO:9-22中任意一個編碼的shRNA)或siRNA(例如SEQIDNO:23-26中的任意一個)。在其他的實施方案中，TREM-1的活化通過給予小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、結(jié)合TREM-1的抗體或抗體片段、結(jié)合TREM-1配體的抗體或抗體片段、可溶性TREM-1受體或其配體結(jié)合部分、或可溶性TREM-1受體融合蛋白來抑制。本發(fā)明其它實施方案提供通過直接抑制TREM-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的非TREM-1成員(例如，TREM-1輔助蛋白DAP12/TyroBP)治療炎癥性疾病的方法，該炎癥性疾病i者如，例如，性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哞喘)。在一些實施方案中，通過在受試者中對內(nèi)源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而在受試人中降低TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可對受試者施用包含佐劑和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，以引發(fā)對該內(nèi)源性蛋白的免疫應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明提供了SEQIDNO:9-22中任意一個編碼的shRNA。0012本發(fā)明指出，TREM-1的活化導(dǎo)致許多基因的差異表達，如分泌型磷蛋白1(SPP1)，它可以作為TREM-1活性的標(biāo)志物。因此，在另一方面，本發(fā)明提供特異性針對TREM-1活性和對TREM-1活性有指示性的標(biāo)志物。一個或多個這些標(biāo)志物水平的變化與TREM-1的活性變化相關(guān)。因此，本發(fā)明還提供通過檢測這些標(biāo)志物中的一個或多個的水平來評價TREM-1的活性，和/或評價給予需要這種治療的患者(例如病人)TREM-1調(diào)節(jié)劑的療效的方法。例如，可在患者或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白1(SPP1,也稱為骨橋蛋白(OPN)、骨涎蛋白I(BSPI)、早期T-淋巴細胞活化蛋白1(ETA-1)或MGC110940)的水平，而且SPP1水平的變化與TREM-1的信號變化相關(guān)。SPP1水平可以在患者或來自患者的任何臨^目關(guān)樣本中檢測，如體液樣本(如血清、滑液、氣管液，唾液)。在一個實施方案中，該方法進一步包括將SPP1水平與參考水平比較的步驟，其中與參考水平相比SPPI水平的增加可以是TREM-1活性增加的指征，其中相對于參考水平SPP1水平的下降可以是TREM-1活性降低的指征。該參考水平可以是，例如，在給予TREM-1調(diào)節(jié)劑之前患者或來自患者的樣本中檢測的SPP1水平。下面較詳細的說明了根據(jù)本發(fā)明可用于評估TREM-1活性的其他標(biāo)志物，如圖8A所示。本發(fā)明還提供了通過如下步驟在受試者(如人)中檢測諸如慢性炎癥性疾病(諸如RA或哮喘等)等炎癥性疾病存在的方法檢測TREM-1或DAP12/TyroBP在受試者或來自受試者的樣本中的表達和將受試者或樣本中的TREM-1或DAP12/TyroBP表達與參考水平比較。比較的結(jié)果(例如表達的增加)是炎癥性疾病存在的指征。參考水平可以是炎癥性疾病存在的指征，或是區(qū)分正常表達和表達升高的閾值等。另一方面，本發(fā)明提供了在受試者(例如人)中監(jiān)測諸如慢性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哞喘)等炎癥性疾病的方法。該方法受益于如下了解TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性在受試者中隨時間的變化(對受試者或來自受試者的樣本在不同時間測定)可以用作疾病狀態(tài)改變的指征。該方法包括在兩個或更多個不同的時間(此處有時稱為第一時間和后來的第二時間)檢測受試者或來自受試者的樣本的TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性，并比較觀察到的表達或活性。TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性隨時間的降低可以作為炎癥性疾病減輕的指征，而TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性隨著時間的增加則可以是炎癥性疾病嚴(yán)重的指征。本發(fā)明這些和其他方面，以及實施方案也在本申請的下列部分中詳細說明，這些說明只是為了突出說明本發(fā)明的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書限定。附圖簡要說明圖6顯示了成簇分析調(diào)節(jié)大于2倍，p小于0.01的基因的示例性ANOVA熱圖(ANOVAheatmap)。個體供體示于左側(cè)，平均平均值強度示于右側(cè)。圖7顯示了所有存在的基因的示例性散點圖("回應(yīng)(calls)")。針對TREM-1(x-軸)和LPS(y-軸)標(biāo)繪Ln倍數(shù)改變(Lnfoldchanges)，下調(diào)轉(zhuǎn)換為負值。選擇的基因突出顯示。其45。軸分開兩種治療可比調(diào)節(jié)的基因。圖9a為列出了共同上調(diào)大于4倍的示例性基因的表格，也就是說，這些基因是在TREM-1活化和在用LPS處理時都上調(diào)的基因。圖15為顯示在mTREM-l-hFC轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中應(yīng)答K/BxN血清轉(zhuǎn)移的踝增厚的圖表。圖16為顯示mTREM-l-hFC轉(zhuǎn)基因小鼠在第14天應(yīng)答K/BxN血清轉(zhuǎn)移的踝增厚的圖表。圖18是表示在用mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠中以抗IgE抗體攻擊后耳肺脹的圖表。圖19是表示在用mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠中以抗IgE抗體攻擊后耳朵腫脹的劑量反應(yīng)的圖表。本文中所使用的術(shù)語"反義"是指與特定DNA或RNA序列互補的核苷酸序列。術(shù)語"反義鏈"是用來指與"正義，，鏈互補的核酸鏈。反義分子可通過任何方法制備，包括通過以顛倒的方向?qū)⒛康幕蚺c病毒啟動子連接，這允許互補鏈的合成。一旦引入細胞中，這種經(jīng)轉(zhuǎn)錄的鏈結(jié)合細胞產(chǎn)生的天然序列形成二倍體。然后這些二倍體進一步阻斷轉(zhuǎn)錄或翻譯。"-"負標(biāo)識有時用于指代反義鏈，和"+"正標(biāo)識有時用于指代正義鏈。本文提到的術(shù)語"受試者，，和"患者，，是指任何人類或非人類的哺乳動物。本文提到的術(shù)語"慢性炎癥性疾病"是指炎癥反應(yīng)長期持續(xù)(例如，幾周，幾月，甚至無限期)的任何疾病，且其延長的時間段是由組織中炎癥的成因刺激物持續(xù)刺激引起的。術(shù)語"慢性炎癥性疾病"包括，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本文提到的術(shù)語"PCR"指聚合雜式反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法用于證明TREM-1蛋白水平在人RA樣本中不但可檢測到而且是升高的。RA患者血漿來自于第二階段、雙盲、安慰劑對照、平行、隨機，多中心、門診病人、比較研究中，該研究在患有活性RA并且對于恒定劑量的(每周一次7.5-20毫克)氨甲蝶呤(MTX)應(yīng)答不足的受試者中進行。受試者招募自世界范圍的81個地點。在選定的地點，32名同意自愿參與收集樣本的受試者，為生物標(biāo)志物的探索性研究提供血液樣本。在此報告的數(shù)據(jù)是從第1天(給藥前)采取的血漿樣本。對照組血漿采集自健康志愿者多中心、具前瞻性、非介入觀察研究所招募的受試者。每個臨床站點的機構(gòu)審查委員會或倫理委員會均允許了的這些研究，并且在獲得每個病人的知情同意前沒有執(zhí)行任何程序。用于檢測人體臨床血漿樣本可溶性TREM-1的ELISA方法改編自DuoSetELISA開發(fā)系統(tǒng)，購自R&DSystems(Minneapolis,MN;目錄號DY1278)。改編的ELISA方法減少了假陽性，并提高了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性動態(tài)范圍。簡單地說，ELISA以夾心形式進行，捕獲抗體為4.0ng/ml和檢測抗體為200ng/ml。血漿樣本按l:2倍稀釋于購自MesoScaleDiscovery(Gaithersburg，Maryland;目錄號R54BB國3)的GF1緩沖液中。標(biāo)準(zhǔn)品也按1:2用GF1緩沖液稀釋純凈血漿。以范圍為1.37至1000pg/ml的R2為0.999的四參數(shù)曲線擬合(XL-FitIDBS,Burlington,MA)，檢測限為1.37pg/ml。此外，檢測到升高的血漿TREM-1水平與類風(fēng)濕因子升高水平之間的顯著關(guān)聯(lián)性。實施例5:交聯(lián)TREM-1后促分裂原激活的蛋白激酶的活化純化的人單核細胞接種入同種型匹配對照抗體或a-TREM-l交聯(lián)抗體預(yù)包被的孔中，以確定是否TREM-1受體激活觸發(fā)促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化。簡單地說，健康志愿者的人leukopacks(血沉棕黃層蟾蜍色素(Buffycoats))，獲自馬薩諸塞州總醫(yī)院臨^jk液學(xué)實驗室(MassachusettsGeneralHospitalClinicalHematologyLaboratory,Boston,MA)。血沉棕黃層蟾繚色素存放于4。C過夜以便第二天細胞分離。單核細胞以RosetteSep(StemCellTechnologies,Vancouver,BC;15068)依產(chǎn)品方法經(jīng)Histopaque(SIGMA，H8889)密度離心通過負選擇分離。所有培養(yǎng)都在37*€組織培養(yǎng)箱，維持5。/。C02條件下進行。純化的單核細胞置于含有10%的熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。組織培養(yǎng)處理的平板用5ng/ml的a-TREM-l交聯(lián)抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN;MAB1278)PBS溶液處理，組織培養(yǎng)箱中過夜。對照孔以柔嫩艾美耳球蟲(五.^1^//fl)的同種型匹配抗體(Wyeth，Madison，NJ)進行相似處理。臨加入細胞前用PBS洗兩次培養(yǎng)孔。經(jīng)5至180分鐘的時間以標(biāo)準(zhǔn)方法進行蛋白質(zhì)印跡(見圖5)。a-磷-ERK、a-磷-p38和a-磷-JNK抗體購自CellSignalingTechnologies(Danvers，MA;分別為9101、9211和9251)，a-肌動蛋白抗體購自Sigma(St.Louis,MO;A2103)。如圖5所示，交聯(lián)抗體對TREM-1的激活使MAPK廣泛激活。以前未知p38和JNK對TREM-1激活有響應(yīng)。在純化的人單核細胞中，這些廣泛促炎癥反應(yīng)由TREM-1激活引起的整體基因表達的變化所確認(見實施例10)。實施例6:a-TREM-l和LPS處理后的轉(zhuǎn)錄i普分析00115用轉(zhuǎn)錄鐠分析來鑒別在TREM-1受體激活的情況下差異表達的基因。利用轉(zhuǎn)錄鐠，分泌型磷蛋白1(SPP1，也稱為骨橋蛋白(OPN)，骨涎蛋白(BSPI)，早期T-淋巴細胞活化蛋白1(ETA-l)，或MGC110940)被鑒定為TREM-1激活的特異性標(biāo)記，而不是作為一個必要的促炎癥結(jié)果(readout)。組織培養(yǎng)物的制備和RNA分離圖6顯示了轉(zhuǎn)錄語數(shù)據(jù)的熱圖聚類分析。在圖6中，個體供體顯示在左邊(每列代表一個個體供體)和平均均值強度在右邊顯示，每行代表個體限定基因。顯示熒光強度。a-TREM-l處理的樣本與對照抗體處理的樣本進行比較，和LPS處理的樣本與未經(jīng)處理的進行比較。分層聚類算法用于進行具有相似表達模式的限定基因的分組。在圖6中，括號內(nèi)的區(qū)域表明對應(yīng)于由TREM-1激活上調(diào)的，LPS上調(diào)的，共同下調(diào)的，TREM-1激活下調(diào)的或LPS下調(diào)的限定基因的熱圖區(qū)域。TREM-1偏向基因的總結(jié)如圖8A所示，這些基因響應(yīng)TREM-1激活而上調(diào)大于4倍。圖中提供的是在TREM-1激活(TREM)，LPS(LPS)，和TREM-1激活加LPS組合(雙重)下的倍數(shù)變化，按照TREM-1/LPS的比例排列。TREM-1激活上調(diào)大于4倍的基因的p值在7.7xl0"到2.6xl0"的范圍內(nèi)。被確定為優(yōu)先由TREM-1激活誘導(dǎo)的基因包括SPRY2，細胞因子及相關(guān)分子(TNFSF14、CSF1、SPP1、CCL7、IL1F5、LIF)，金屬硫蛋白(MT1K、MT1E、MT1F)，磷酸酶(DUSP14、DUSP4)，轉(zhuǎn)錄因子(EGR2、ATF3)，參與脂質(zhì)代謝和/或信號傳遞的因子(EDG3、LPL、PPAP2B、PLCXD1、NPC1、FABP3、ACSL3)，MMP19和PPARG。這些基因中，響應(yīng)于TREM-1的激活，SPP1上調(diào)了28.0倍(p=1.2x10_°7)(見圖8A及11E)，但LPS處理后沒有明顯上調(diào)。因此，SPP1不是必要的促炎癥結(jié)果，而可以在患者(或患者樣本)中作為TREM-1活性的標(biāo)志和在篩選檢測中用于鑒定TREM-1調(diào)節(jié)劑。此外，對于患者的炎癥或慢性炎癥(如RA)治療，SPP1也可作為TREM-1治療的療效或潛在療效的指征。對于可被用作TREM-1活性標(biāo)記的其它基因列在圖8A,23和24。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖8A中列出的那些基因包括C6orf114，C6orgl28，C9orf47，KIAA1199，KIAA1393,LOC440995和MGC33212。一般情況下，由TREM-1激活優(yōu)先誘導(dǎo)的基因很大程度上不受LPS處理影響?？偨Y(jié)的LPS偏向性基因如圖8B所示，這些基因響應(yīng)LPS處理耳^皮上調(diào)大于4倍。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1活化和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)LPS/TREM-1比例排列。該表中用LPS處理后上調(diào)大于4倍的基因的p值在1.2xi(T3-3.6x10-14范圍內(nèi)。被鑒定為優(yōu)先由LPS誘導(dǎo)的基因包括白介素(IL23A、IL12B、EBI3、IL1F9、IL10、ILIA、IL18)、白介素受體(IL15RA、IL2RA、IL7R)、細胞因子和相關(guān)分子(CSF3、CCL23、CXCL1、TSLP、CCL5、CLC、EREG、TNFSF9)、參與脂質(zhì)代謝和/或信號傳遞的因子(SGPP2、PLA1A、MGLL)、激酶(MAP3K8、RIPK2、MAP3K4、TBK1、PIM3)、NF-kB信號調(diào)節(jié)子(TNIP3、NFKBIZ)、CCR7和CIAS1。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖8B中列出的那些基因包括C10orf78、C21orf71、FLJ14490、FLJ23231、FLJ25590、FLJ32499、KIAA0286、KIAA0376、LOC90167、LOC123872、LOC285628、LOC338758、LOC341720、LOCLOC374443、LOC387763、LOC400581、LOC441366、MGC10744和MGC11082。圖9A顯示共同上調(diào)基因的總結(jié)(即通過TREM-1激活和LPS處理而上調(diào)的基因)。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)TREM-1激活而誘導(dǎo)的倍數(shù)排列。TREM-1激活處理后而上調(diào)大于4倍的基因的p值在1.7x10-3-1.5x10-1()范圍內(nèi)，用LPS處理后上調(diào)大于4倍的基因的p值在4.1x1(T3~2.0x10-14范圍內(nèi)。被鑒定為共同上調(diào)的基因包括TNF超家族成員和調(diào)節(jié)因子(TNFSF15,BRE、TNF)、趨化因子(CXCL3、CXCL2、CCL20、CXCL5、CCL3)、其他細胞因子和促有絲分裂因子(CSF2、IL-6、AREG)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP10)和PTGS2/COX2。這些結(jié)果既符合TREM-1激活也符合LPS引發(fā)的促炎癥反應(yīng)。還有INHBA，凝血和血管生成因子(F3、EDN1、TFPI2、SERPINB2)，轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)合因子(HES4、EGR1、FOSLl、E2F7、EGR3、MAFF、ETS2、HES1),脂質(zhì)代謝和/或信號傳遞涉及的因子(PLD1、ELOVL7、SYNJ2、GLA、STARD4)。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖9A中列出的那些基因包括C20orfB9，KIAA1718，LOC348938，LOC401151，LOC401588，LOC92162和MGC4504。在組合(雙重)處理方法中，在圖9A中的大多氣基因的表達變化在單獨處理中的那些的總和的2倍以內(nèi)。一個例外是CSF2(即GM-CSF)，在組合處理方法中，其mRNA誘導(dǎo)就單獨處理而言顯著增高(以TREM-1激活，LPS和組合處理的增高分別為9.6，18.9和192.4倍)。或者TREM-1激活或者LPS處理導(dǎo)致的倍數(shù)變化小于-4(即下調(diào)大于4倍)的基因總結(jié)如圖9B所示。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)TREM-1激活誘導(dǎo)的倍數(shù)排列。該表中用TREM-1激活處理后下調(diào)大于4倍的基因的p值在5.6xl(T3-5.7x10"2范圍內(nèi)，用LPS處理后下調(diào)超過4倍的基因的p值在2.4x10-3-1.1xl(T"范圍內(nèi)。如圖6所示，在我們的分析中，雖然在這些基因中處理特異性更少，但是與上調(diào)基因一樣，有相當(dāng)數(shù)量的基因出現(xiàn)下調(diào)。被鑒定為下調(diào)的基因包括趨化因子受體(CCR2，CX3CR1)，轉(zhuǎn)錄因子(OLIGl，ZNF555，OLIG2)，免疫相關(guān)蛋白的GTP酶(GIMAP6,GIMAP7,GIMAP8,GIMAP1)和CCL8。CCR2在a-TREM-l和LPS處理中都是下調(diào)的(參見圖9B),它的下調(diào)是單核細胞對巨噬細胞分化的一個標(biāo)記。此外，TLRl和NOD樣受體(CARD12,NALP12)也下調(diào)。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖9B中列出的那些基因包括C9orf59,FLJ12442，F(xiàn)LJ33641，LOC卯120，MGC2941和MGC17791?？紤]到mRNA半衰期對于分析有限的動力作用，正如預(yù)期的那樣，下調(diào)的動態(tài)范圍低于上調(diào)的。此外，TREM-1和LPS差異地調(diào)節(jié)CSF生成，M-CSF是TREM-1偏向的，G-CSF是LPS特異性的(見圖7，8A-B)。實施例7:細胞吞嗟試驗將人THP-1細胞用a-TREM-l和LPS處理以比較a-TREM-l處理和LPS處理對THP-1細胞形態(tài)和行為的影響。按照建i義的增殖方法培養(yǎng)人THP-1細胞(ATCC，TIB-202)。為加強可視化，在進行所述處理之前，對THP-1細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)表達GFP慢病毒，組織培養(yǎng)處理孔內(nèi)培養(yǎng)5天。吞嗟試驗通過力口入FluoresbriteTMpolychromaticred1.0微米微球(Polysciences，Inc.,Warrington,PA;18660)，組織培養(yǎng)箱中孵育30分鐘、成像前以培養(yǎng)基洗滌以去除未吞噬的微珠來進行。a-TREM-l處理引起THP-1細胞的形態(tài)學(xué)變化(圖10a)。此外，a-TREM-l和LPS處理都誘導(dǎo)了標(biāo)記的微^J^噬(ljiM珠顯示紅色)，與TREM-1活化在刺激免疫應(yīng)答中的作用一致(圖10B)。實施例8:基因表達的ELISA分析傳在一項實驗中，表達可溶性mTREM-l-hFc融合蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠用K/BxN血清攻擊，以評估是否可溶性TREM-1減少關(guān)節(jié)炎的炎癥。簡言之，C57BL/6的背景下制備TREM-1轉(zhuǎn)基因("Tg")小鼠以表達受控于CAGGS啟動子的可溶性mTREM-l-hFc融合蛋白，這是一個廣泛性的強大融合啟動子，由CMV增強子和p-肌動蛋白啟動子組成。整體構(gòu)造是CAGGS/mTREM-l-hFc/兔p-球蛋白polyA。轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中可溶性mTREM-l-hFc蛋白水平約為l-2mg/ml。TREM-1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(n=7)和野生型雄性小鼠(n=7)在第0天和第2天自內(nèi)注射(ip)150^1的K/BxN血清。踝直徑定期測量直到第14天。用于產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，可包括，但不僅限于，啟動子序列，核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄啟始和終止序列，翻譯啟動和終止序列，和增強子或激活子序列。在一個實施方案中，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄啟始和終止序列。啟動子序列可編碼組成型或誘導(dǎo)型啟動子。啟動子可以是天然產(chǎn)生的啟動子或雜合啟動子。雜合啟動子，其中集成了一個以上的啟動子元件，也是本領(lǐng)域所熟知的，并可在本發(fā)明使用。其它的實驗動物可以通過mTREM-l-hFc雜合子小鼠與野生型小鼠回交而產(chǎn)生，野生型后代可以作為同窩對照。實驗動物可在多種本領(lǐng)域所知的炎癥性疾病的動物模型中進行測試，例如，LPS和CIA，以確定是否各種mTREM-l-hFc構(gòu)建體對炎癥性疾病有保護。mTREM-l-hFc構(gòu)建體可以是組成型表達的，或mTREM-l-hFc構(gòu)建體的表達可以在用LPS和CIA攻擊之前、同時、和/或之后的一個或多個時間點得到誘導(dǎo)。也可制備表達TREM-1受體的可溶性形式的轉(zhuǎn)基因小鼠以篩選炎癥性疾病推定的抑制劑。在內(nèi)毒素休克的脂多糖(LPS)模型中，對實驗動物注射LPS以確定mTREM-l-hFc構(gòu)建體在減少對LPS豫導(dǎo)的震擾響應(yīng)的炎癥的有效性。此外，實驗動物可以在CIA模型中進行測試，例如在實施例2中，以確定mTREM-l-hFc構(gòu)建體在減少對CIA響應(yīng)的炎癥的有效性。在人類RA滑膜培養(yǎng)物檢測中，篩選抗-hTREM-l抗體抑制促炎性細胞因子產(chǎn)生的能力。RA和哮喘模型，如實施例9和實施例12中所示，已被成功地用作炎性疾病模型，來開發(fā)中和炎癥反應(yīng)的一個或多個方面的治療性抗體。部分基于TREM-1與炎癥疾病如RA和哮喘的相關(guān)性，預(yù)期抗-hTREM-l抗體在RA滑膜培養(yǎng)物檢測和哮喘模型中抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生。同樣，施用適當(dāng)抗體給患有炎癥性疾病(如RA或譯喘)的人類受試者，應(yīng)減少炎癥疾病的嚴(yán)重程度和/或減輕疾病的癥狀。實施例12:TREM-1和用抗IgE抗體的攻擊如圖18所示，與對照相比，以可溶性mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠減少了耳的腫脹。此外，如圖19所示，耳腫脹減少是劑量依賴性的。這些數(shù)據(jù)進一步表明，可溶性TREM-l減少了與抗IgE攻擊相關(guān)的炎癥，而TREM-1和/或TREM-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑，例如，可溶性TREM-1融合蛋白和/或抗-TREM-l抗體，可施用給病人以治療與抗IgE的攻擊相關(guān)的炎癥。例如，可溶性TREM-1和/或抗-TREM-l抗體，預(yù)計將有效調(diào)節(jié)哮喘、過敏反應(yīng)、急性和慢性蕁麻疹(風(fēng)疹)、血管性水腫、變應(yīng)性鼻炎有效、昆蟲叮咬變應(yīng)性和特應(yīng)性。在TREM-1敲除小鼠中的抗IgE攻擊為了說明RNA干擾為基礎(chǔ)的治療在炎癥性疾病中的用途，在shRNA及siRNA敲除后測量THP-1單核細胞中TREM-l的表達。簡單地說，產(chǎn)生多種人TREM-l和鼠TREM-lshRNA序列，并各個檢測其降低TREM-l表達的能力。典型的shRNA序列如表5所示。通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在THP-1單核細胞中表達shRNA。人TREM-lsiRNA可以從Dharmacon(Lafayette,CO)商購，并通過核轉(zhuǎn)染(nucleofection)引入THP-1單核細胞。代表性siRNA序列見表6。敲除后，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(在shRNA的情況下)或在核轉(zhuǎn)染后48小時(在siRNA的情況下)用TaqManRT-PCR測量TREM-l的表達。圖21是顯示shRNA或siRNA敲除后用RT-PCR測得的TREM-l表達的圖。如圖21，與vGFP和混雜的(scramble)siRNA對照相比，sh247,sh533，sh382,和匯集的TREM-lsiRNA有效地敲除了在THP-1單核細胞中內(nèi)源性TREM-l的表達。因此，shRNA及siRNA敲除是降低TREM-l表達的有效手段，因此可以用于治療炎癥性疾病。圖22A-B顯示了說明在TREM-l過表達細胞系中用慢病毒shRNA敲除TREM-l之后TREM-l表達的代表性蛋白質(zhì)印跡。如圖22A所示，與對照相比，shll4、sh247、sh247、sh280、sh315、sh360、sh450和sh533有效敲除人TREM-l-FLAG過表達，而sh382和sh600在敲除人TREM-l-FLAGit^達中無效。如圖22B所示，與對照相比，sh75、sh284和sh414有效敲除小鼠TREM-l-FLAG過表達，而sh591在敲除小鼠TREM-1-FLAGit^達中無效。因此，shRNA敲除是減少TREM-1it^達進而治療TREM-1相關(guān)的炎性疾病的有效手段。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表6:Dharmacon⑧人TREM-lsiRNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>參考文獻的合并[00157本申請中引用的所有出版物和專利文件如各自單獨合并一樣，均整體合并于此作為參考。權(quán)利要求1、一種治療受試者炎癥性疾病的方法，所述方法包括降低TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述炎癥性疾病由IgE介導(dǎo)。3、如權(quán)利要求l所迷的方法，其中所述炎癥性疾病為呼吸系統(tǒng)疾病。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述疾病為哞喘。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎癥性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述降低步驟包括降低TREM-1的表達。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述降低步驟包括向受試者施用千擾RNA。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干擾RNA為shRNA。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述shRNA包括SEQIDNO:9-18中任一個所編碼的RNA。10、如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干擾RNA為siRNA。11、如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述siRNA包括SEQIDNO:23-26中的任一個。12、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低步驟包括抑制TREM-1活性。13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中通過施用選自小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段、特異性結(jié)合TREM-1配體的抗體或其片段、可溶性TREM-1受體、可溶性TREM-1受體融合蛋白及其組合的化合物來抑制TREM-1活性。14、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述降低步驟包括直接抑制TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的非TREM-1蛋白質(zhì)的表達或活性。15、如4又利要求14所述的方法，其中所述非TREM-1蛋白質(zhì)為DAP12/TyroBP。16、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低步驟包括在受試者中誘導(dǎo)對內(nèi)源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白的免疫應(yīng)答。17、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述降低步驟包括向受試者施用包含佐劑和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物。18、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段。19、如權(quán)利要求18所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單克隆抗體或單克隆抗體片段。20、如權(quán)利要求18所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單結(jié)構(gòu)域抗體。21、一種治療受試者的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求19所述的抗體或其片段的步驟。22、包含SEQIDNO:9-22中任一個所編碼的RNA的shRNA。23、一種治療有需要的受試者的炎癥性疾病的方法，所述方法包括通過施用選自小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段、特異性結(jié)合TREM-1配體的抗體或其片段、可溶性TREM-1受體、可溶性TREM-1受體融合蛋白及其組合的化合物來降低TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。24、評價向有需要的患者所施用TREM-1調(diào)節(jié)劑的功效的方法，所述方法包括在患者中或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白1(SPP1)的水平。25、如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述SPP1水平在來自患者的體液樣本中檢測。26、如權(quán)利要求24所述的方法，進一步包括將SPP1水平與參照比較的步驟，其中與參照相比SPP1水平的升高是TREM-1活性升高的指征，其中與參照相比SPP1水平的降低是TREM-1活性降低的指征。27、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于在施用所述TREM-1調(diào)節(jié)劑之前的時間點在患者或者來自患者的樣本中測得的SPP1水平。28、篩逸能夠調(diào)節(jié)TREM-1信號的候選試劑的方法，所述方法包括步驟將表達TREM-1的細胞與候選試劑接觸；和評價所述表達TREM-1的細胞的分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，以確定所述候選試劑是否調(diào)節(jié)TREM-1活性。29、監(jiān)測治療'隻性炎癥的患者的方法，所述方法包括步驟向有需要的患者施用TREM-1調(diào)節(jié)劑；在患者或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白(SPP1)水平；和將所檢測到的SPP1水平與參照比較，從而監(jiān)測所述患者。30、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述SPPl水平在來自患者的體液樣本中檢測。31、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平的降低是TREM-1介導(dǎo)的炎癥減輕的指征。32、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平?jīng)]有變化是TREM-1介導(dǎo)的炎癥沒有變化的指征。33、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平的升高是TREM-1介導(dǎo)的炎癥加重的指征。34、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于在施用所述TREM-1調(diào)節(jié)劑之前的時間點或同時在患者或來自患者的樣本中檢測的SPP1水平。35、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于已知未患慢性炎癥的對照受試者的SPP1氷平。36、檢測受試者中存在炎癥性疾病的方法，所述方法包括步驟在受試者或來自受試者的樣本中檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性，其中升高的表達或活性是所述炎癥性疾病的指征。37、在受試者中監(jiān)測炎癥性疾病的方法，所述方法包括步驟(a)在第一時間對患者或來自患者的第一樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性；(b)在后來的笫二時間對患者或來自患者的后來的第二樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性；和(c)比較(a)和(b)的所i^達或活性，其中表達或活性的改變是疾病狀態(tài)改變的指征。38、如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述炎癥性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。39、評價受試者中炎癥性疾病的治療的方法，所述方法包括步驟(a)在第一時間對患者或來自患者的第一樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性；(b)在后來的笫二時間對患者或來自患者的后來的第二樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達或活性；(c)在所述后來的第二時間或后來的第二樣本之前進行治療；和(d)比較(a)和(b)的所it^達或活性，其中表達或活性的改變是疾病狀態(tài)改變的指征。40、如權(quán)利要求39所述的方法，其中在第一時間或第一樣本之后給予所述治療。41、如權(quán)利要求39所述的方法，進一步包括基于所述比較的結(jié)果修改對受試者治療的療程。全文摘要本發(fā)明提供了通過抑制/拮抗TREM-1表達/活性/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或DAP12/TyroBP表達/活性而治療受試者炎癥性疾病/紊亂的方法。本發(fā)明還包括通過檢測受試者或來自受試者的樣本中TREM-1和/或DAPl2/TyroBP表達或活性來檢測受試者中炎癥性疾病存在的方法，其中升高的表達或活性是所述炎癥性疾病的指征。本發(fā)明進一步提供了通過檢測患者或來自患者的樣本中分泌型磷蛋白1(SPP1)和/或一種或多種其他生物標(biāo)志物的水平來評價給予患者的TREM-1調(diào)節(jié)劑的功效的方法。文檔編號C07K16/00GK101687916SQ200880008378公開日2010年3月31日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日發(fā)明者C·威廉姆斯,D·D·皮特曼,D·溫克勒,J·L·費爾德曼,K·道爾,M·查特吉-肖基爾,S·A·葉林斯基,林俐伶,軍蒯申請人:惠氏公司