專利名稱：：類鼻疽檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于細菌抗原的檢測
技術領域：
，具體為一種類鼻疽假單胞菌(Swr狄oWer/a;weMctomfl//e/)的檢測鑒定試劑盒，同時還涉及對類鼻疽假單胞菌進行檢測的方法。它既可以應用于醫(yī)院對發(fā)熱病人臨床樣品的定性檢測，也可以應用于對類鼻疽疫原地進行大規(guī)模的流行病學調査。可廣泛應用于醫(yī)學和生物學研究領域。
背景技術：
：類鼻疽是由類鼻疽假單胞菌(5"rA力oWeria;^et/Gb鵬W")引起的一種新發(fā)現的感染性疾?。滑F在被認為是澳大利亞和東南亞一些國家的比較重要的公共衛(wèi)生問題(ChenWT，ChenYS，ChyeSM,etal.SeroprevalenceofmelioidosisindiabeticpatientsinTaiwan.JMicrobiolImmunolInfect2005;38(4):267-70.)。類鼻疽的臨床癥狀有肺炎、皮膚和軟組織化膿、腦積水、肝和脾化膿以及膿血癥，肺炎是其主要的臨床癥狀，一半的類鼻疽病人都會有肺炎癥狀的發(fā)生，容易誤診為肺結核或者其他疾病。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，是一種高致死率的環(huán)境病原菌，近年來我們發(fā)現病例致死率達50%以上，而且入院誤診率高達100%，類鼻疽病的及時診斷和治療是降低病死率的最有效措施。最近的流行病學調査表明，類鼻疽假單胞菌的疫原地主要分布于南北緯20度之間的廣大赤道國家和地區(qū)(RajaNS，AhmedMZ,SinghNN.Melioidosis:anemerginginfectiousdisease.JPostgradMed2005;51(2):140-5.)，包括我國的廣東、廣西、臺灣和海南等省(YangS.MelioidosisresearchinChina.ActaTrop2000;77(2):157-65.)。類鼻疽假單胞菌主要生存在疫原地的稻田、橡膠園和水源地附近。雖然人們對類鼻疽假單胞菌的疫原地進行了廣泛的調査，4但是類鼻疽假單胞菌在全球的分布情況還是不清楚。目前對類鼻疽假單胞菌疫原地的調査方法現在還是以分離、培養(yǎng)、鑒定的方法作為主要方法，是金標準。但是這種方法從土壤的釆集到最終的細菌鑒定結果需要至少一個月的時間，而且需要大量的人力物力。這是不能對類鼻疽假單胞菌在地球上詳細分布情況進行流行病學調查的主要原因。目前類鼻疽的臨床檢驗常用細菌分離培養(yǎng)法。主要是對患者的膿液和血液樣品進行培養(yǎng)后分離鑒定。此方法雖有"金色指標"之稱，但其技術復雜、費時長(通常需l周)，不適合用于早期診斷。免疫學方法雖能達到快速診斷目的，但其靈敏度和特異性變化較大，容易出現假陽性，且某些底物具有致癌作用，使臨床應用受到一定限制。ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據己經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢査，而且由于一天之內可以檢査幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一禾中早期診斷的良好方法(SermswanRW,WongratanacheewinS,AnuntagoolN,SirisinhaS.Comparisonofthepolymerasechainreactionandserologictestsfordiagnosisofsepticemicmelioidosis.AmJTropMedHyg2000;63(3-4):146-9.)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是在于提供了一種類鼻疽假單胞菌的檢測試劑盒，通過直接檢測臨床樣品培養(yǎng)物進行類鼻疽假單胞菌鑒定的ELISA試劑盒，能快速、靈敏、準確的檢測到類鼻疽假單胞藺。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種直接檢測土壤培養(yǎng)物中類鼻疽假單胞菌的抗原檢測的方法，方法易行，操作簡便，可以應用于大規(guī)模對類鼻疽疫原地的流行病學調查。為了解決上述任務，本發(fā)明采取以下措施表達了一種類鼻疽假單胞菌的特異性抗原，并用這種抗原免疫小鼠，獲得針對類鼻疽假單胞菌特異性非常高的單克隆抗體，用此單克隆抗體和針對類鼻疽假單胞菌的多克隆抗體研制成類鼻疽假單胞菌檢測試劑盒。該試劑盒包括預包被反應板、酶標抗體、洗液20X、底物溶液A,B和終止液。使用該試劑盒，首先將樣品放入5ml含有粘桿菌素和慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后取培養(yǎng)液上清100ul用于ELISA檢測。其發(fā)明過程是1.從中國獸醫(yī)獸藥監(jiān)查所購買了一株類鼻疽假單胞菌的標準菌株CMCC53001(標準株)。并設計了一對表達類鼻疽假單胞菌鞭毛抗原的引物，5'-AAAAGAATTCGCGTCGGCGCTGCMCAGGAACTCG-3'5'-AAAAAAGCTTTTACATCGCCTGGTACGCGCCCGTCTGC-3，引物末端加上了fearI和歷y^III酶切位點。PCR擴增后得到588bp的擴增產物，產物核苷酸序列為SEQIDNO.1。酶切后連接到Pet28a表達載體(Novagon)上，得到重組載體Pet28a-/7允表達載體。誘導表達后得到23KD的含有組氨酸標簽的鞭毛蛋白，BALB/c小鼠，獲得抗鞭毛蛋白的1株特異性單克隆抗體。用全菌體免疫新西蘭大白兔獲得全菌體多克隆抗體。2，用類鼻疽假單胞菌的單克隆抗體和全菌體多抗研制了一種類鼻疽檢測試劑盒，該試劑盒包括酶聯板一塊(96孔)，酶聯板的包被將單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液(50mMPH9.6)稀釋到5yg/ml，100y1/孔包被反應板。4'C冰箱中孵育過夜。洗滌液0.02Mol/LPH7.4Tris—HCl緩沖液。洗滌兩次。加入125u1/孔的封閉液(lOmM磷酸鹽緩沖液含1%(質量比)的牛血清白蛋白(BSA)。室溫(20-25'C，以下相同)放置8個小時。丟掉封閉液，37'C烤箱8個小時后封板。得到預包被反應板。酶標抗體1X20ml/瓶。酶標抗體的制備(HRP標記多克隆抗體)稱取5mg服P溶解于1ml蒸餾水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaI(V溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對lraMra4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4。C過夜。力口20ul0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化捏RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mgIgG(抗體，或SPA5mg)在lml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4°C2小時。將上述液裝入透析袋中，對O.15MPH=7.4PBS透析，4。C過夜。檢測液A:1X10ml/瓶。檢測液B:1X10ml/瓶。購買自濟南天和生物科技有限公司。濃洗滌液1X30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。濃洗滌液的配制NaCl137腿ol/L，KC12.7誦ol/L,Na，O,,4.3畫1/L,KH2P041.4腿ol/L，向燒杯中加入約40ml的去離子水，充分攪拌溶解。滴加濃鹽酸將pH值調節(jié)至8.0，然后加入去離子水將溶液定容至50ml。.終止液1X10ml/瓶(2NH2S04)。終止液量取20ml98%H2S04,緩緩加至80ml雙蒸水中即可。3、一種試劑盒在制備檢測類鼻疽假單胞菌中的試劑的方法，其步驟是ELISA試劑使用前試劑的配制1)、LB液體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分裝到的試管中，高壓(1034X105Pa)下蒸氣滅菌(至少20分鐘)消毒；慶大霉素和粘桿菌素的配制用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20'C保存。2)、取5ml/支LB試管，分別加入慶大霉素和粘桿菌素到100ug/ml。3)、取臨床樣品1g加入試管中，37°C150rpm/min24hous。4)、取IOOul培養(yǎng)液上清用于檢測；5)、取酶聯板(96孔)，加樣每孔加入100u1待測菌液，設陰性對照孔(LB)。置37°C60min;洗液沖洗五次。6)、酶標加入100ul酶標抗體，37°C30min后洗液沖洗五次。7)、顯色每孔加底物溶液各一滴顯色(檢測液A與檢測液B)，置室溫37'C30min,左右(可根據顯色情況而定)。8)、終止每孔加終止液50ul。結果判定-比色法選波長450nm，空白孔校零。用酶聯免疫檢測儀對每孔進行比色，并記錄其OD值。樣品孔OD值^1.00時，該孔樣品為陽性。反之為陰性。陰性對照7孔OD值<0.10。本試劑盒的特異性檢測，對20種病原菌培養(yǎng)液的檢測結果如下(表1)。表l,對本實驗室所保存的20種病原菌培養(yǎng)物進行檢測，除了腸球菌有弱反應外，別的病原菌均沒有明顯反應。OD值為三次反應得平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>敏感度檢測為了確定該ELISA檢測試劑盒檢測土壤中類鼻疽假單胞菌的數量，我們稀釋了四個細菌梯度分別接種到類鼻疽假單胞菌為陰性的稻田土壤中，然后在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后，用試劑盒檢測菌液，結果該試劑盒的最低檢測濃度為6-10CFU/g土壤樣品。本發(fā)明與現有技術相比，具有下列優(yōu)點(1)特異性高。通過對多種細菌的特異性檢測結果表明，特異性達到100%。(2)敏感度高，可以檢測到土壤中6-10CFU/g的類鼻疽假單胞菌。(2)可一次性處理96個樣品，適用于大規(guī)模流行病學調查。(3)也可以對少量臨床樣品進行定性檢測。(4)檢測速度快。相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，此方法可以在28小時內給出檢測結果。具體實施例方式實施例1:用類鼻疽假單胞菌的單克隆抗體和全菌體多抗研制了一種類鼻疽檢測試劑盒，該試劑盒包括酶聯板一塊(96孔)，酶聯板的包被將單克隆抗體3#用碳酸鹽緩沖液(50mMPH9.6)稀釋到5iig/ml，100y1/孔包被反應板。4'C冰箱中孵育過夜。洗滌液O.02Mol/L7.4Tris—HCl緩沖液。洗滌兩次。加入125y1/孔的封閉液(10mM磷酸鹽緩沖液含P/。(質量比)的牛血清白蛋白(BSA)。室溫(20-25'C，以下相同)放置8個小時。丟掉封閉液，37'C烤箱8個小時后封板。得到預包被反應板。酶標抗體1X20ml/瓶。酶標抗體的制備(HRP標記多克隆抗體)稱取5mg服P溶解于1ml蒸餾水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNal04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對lmMHI4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4。C過夜。加'20ul0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化程RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mgIgG(抗體，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。加0.1ml新配的4rag/mlNaBH4液，混勻，再置4°C2小時。將上述液裝入透析袋中，對O.15MPH7.4PBS透析，4'C過夜。檢測液A:1X10ml/瓶。檢測液B:1X10ml/瓶。購買自濟南天和生物科技有限公司。濃洗滌液1X30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。濃洗滌液的配制NaCl137誦1/L，KC12.7腸1/L，Na2HP044.3函1/L，KH2P041.4腸1/L，向燒杯中加入約40ml的去離子水，充分攪拌溶解。滴加濃鹽酸將pH值調節(jié)至8.0，然后加入去離子水將溶液定容至50ml。終止液1X10ml/瓶(2NH2S04)。終止液量取20ml98%H2S04,緩緩加至80ml雙蒸水中即可3、ELISA試劑使用前試劑的配制LB液體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分裝到的試管中，高壓(1034X105Pa)下蒸氣滅菌(至少20分鐘)消毒。慶大霉素和粘桿菌素的配制用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20。C保存。一種試劑盒在制備檢測類鼻疽假單胞菌中的試劑的方法，該檢測方法包括下列步驟1)、ELISA試劑使用前試劑的配制LB液體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5inl/支分裝到的試管中，高壓(1034X105Pa)下蒸氣滅菌(至少20分鐘)消毒；慶大霉素和粘桿菌素的配制用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20。C保存。2)、取5ml/支LB試管，分別加入慶大霉素和粘桿菌素到100yg/ml。3)、取臨床樣品1g加入試管中，37°C150rpm/min24hous。4)、取IOOul培養(yǎng)液上清用于檢測；(其檢測步驟是)5)、取酶聯板(96孔)，加樣每孔加入飾1待測菌液，設陰性對照孔(LB)。置37°C60min;洗液沖洗五次。6)、酶標加入100ii1酶標抗體，37°C30min后洗液沖洗五次。7)、顯色每孔加底物溶液各一滴顯色(檢測液A與檢測液B)，置室溫37°C30min左右(可根據顯色情況而定)。8)、終止每孔加終止液50yl。結果判定比色法選波長450nm,空白孔校零。用酶聯免疫檢測儀對每孔進行比色，并記錄其OD值。樣品孔OD值S1.00時，該孔樣品為陽性。反之為陰性。陰性對照孔OD值〈0.10。實施例2:一種直接檢測土壤培養(yǎng)物中類鼻疽假單胞菌的抗原檢測的方法，該檢測方法包括下列步驟(對已經鑒定過的154份廣西省采集土壤樣品進行檢測)1.用一次性湯匙取1g土壤樣品，接于添加了慶大霉素和粘肝菌素的5mlLB2.37。C，150rpm/min，24hours。3.取土壤培養(yǎng)液1ml，靜置1hour，取上清100y1用于ELISA檢測。4.取與反應96孔板一塊，分別加入檢測樣品100ul,設置一個陰性對照(100ulLB培養(yǎng)液)，置37。C60min;5.洗液沖洗五次，后加入100y1酶標抗體，37°C30min后洗液沖洗五次。6.每孔加底物溶液各一滴檢測液(A與B)，置室溫37°C30rain左右(可根據顯色情況而定)。7.每孔加終止液50ul。測0D450值。8.樣品孔0D值^1.00時，該孔樣品為陽性。反之為陰性。9.結果分離培養(yǎng)的方法檢測到13個樣品含有類鼻疽假單胞菌，并且細菌的含量從23—521CFU/g土壤。而用本試劑盒檢測得到相同試驗結果。敏感度100%,特異性100%。實施例3:一種直接檢測發(fā)熱病人血液中類鼻疽假單胞菌抗原檢測的方法，該檢測方法包括下列步驟1.將發(fā)熱病人的血液1ml注入添加了慶大霉素和粘肝菌素的5mlLB試管中。2.37°C，150rpm/min，24hours。3.取血液培養(yǎng)液lml，靜置lhour,取上清100ul用于ELISA檢測。4.取與反應96孔板一塊，分別加入檢測樣品100ul，設置一個陰性對照(100ulLB培養(yǎng)液)，置37°C60min;5.洗液沖洗五次，后加入100ul酶標抗體，37°C30rain后洗液沖洗五次。6.每孔加底物溶液各一滴檢測液(A與B)，置室溫37°C30min左右(可根據顯色情況而定)。7.每孔加終止液50nl。測0D450值。8.結果，血液樣品0D值為2.301，陰性對照為0.023，此病人為類鼻疽假單胞菌感染。應該立即進行抗生素治療。12SEQUENCELISTING《110>中國科學院武漢病毒研究所<120>類鼻疽檢測試劑盒及檢測方法'<130>類鼻疽檢測試劑盒及檢測方法<160>1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>588<212>DNA<213>Bulbinesucculenta〈400〉1gcgtcggcgctgcaacaggaactcgcgcagcagatctcggaagtgaaccgtatcgcttcg60cagacgaactacaacggcaa'gaacatcctcgacggctcggcaggcacgctgagcttccag120gtcggcgcgaacgtcggccagacggtctccgtcgacctcacgcaaagcatgtcggcggcg180aagatcggcggcggcatggttcagacgggccagacgctcggcacgatcaaggtggcgatc240gactcgagcggcgcggcctggtcgtcgggcagcaccggccaggagacgacgcagatcaac300gtcgtgtcggacggcaagggcggcttcacgttcaccgatcagaacaaccaggcgctgtcg360tcgacggccgtgaccgccgtgttcggctcgtcgaccgccggcacgggcacggcggcctcg420ccgtcgttccagacgctggcgctgtcgacttcggcaaccagcgcgctgtccgcgacggac480caggcgaacgccacggcgatggttgcgcagatcaacgcggtcaacaagccgcaaacggtc540tcgaacctcgacatcagcacgcagacgggcgcgtaccaggcgatgtaa588權利要求1，一種類鼻疽假單胞菌的檢測試劑盒，該試劑盒包括酶聯板一塊，酶聯板的包被將單克隆抗體3#用碳酸鹽緩沖液稀釋到5μg/ml，100μl/孔包被反應板，4℃冰箱中孵育過夜，洗滌液洗滌兩次，加入125μl/孔的封閉液的牛血清白蛋白，室溫放置8個小時，丟掉封閉液，37℃烤箱8個小時后封板，得到預包被反應板；酶標抗體1×20ml/瓶，酶標抗體的制備，稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，將上述溶液裝入透析袋中，對1mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，加20μl0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化程RP的PH升高到9.0～9.5，然后加入10mgIgG在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4℃2小時，將上述液裝入透析袋中，PBS透析，4℃過夜；檢測液A1×10ml/瓶，檢測液B1×10ml/瓶；濃洗滌液1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍，濃洗滌液的配制NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，向燒杯中加入約40ml的去離子水，攪拌溶解，滴加濃鹽酸將pH值調節(jié)至8.0，然后加入去離子水將溶液定容至50ml；終止液1×10ml/瓶，終止液量取20ml98％H2SO4，加至80ml雙蒸水中。2、權利要求1所述的一種試劑盒在制備檢測類鼻疽假單胞菌中的方法，其步驟是1)、ELISA試劑使用前試劑的配制LB液體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分裝到的試管中，高壓下蒸氣滅菌消毒；慶大霉素和粘桿菌素的配制用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20'C保存；2)、取5ml/支LB試管，分別加入慶大霉素和粘桿菌素到100ug/ml;3)、取臨床樣品1g加入試管中，37°C150rpm/min24hous;4)、取100iU培養(yǎng)液上清用于檢測；5)、酶聯板加樣每孔加入100iil待測菌液，設陰性對照孔，置37°C60min;洗液沖洗五次；6)、酶標加入IOOtil酶標抗體，37°C30min后洗液沖洗五次；7)、顯色每孔加底物溶液各一滴顯色檢測液A與檢測液B,置室溫37°C15min;8)、終止每孔加終止液50u1。全文摘要本發(fā)明公開了一種類鼻疽檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒包括預包被反應板、酶標抗體、洗液20×、底物溶液A，B和終止液。使用該試劑盒，首先將樣品放入5ml含有粘桿菌素和慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后取培養(yǎng)液上清100μl用于ELISA檢測。檢測包括取LB試管，分別加入慶大霉素和粘桿菌素；取臨床樣品加入試管中；取培養(yǎng)液上清用于檢測，加樣，每孔加入待測菌液，設陰性對照孔；洗液沖洗五次；酶標加入酶標抗體，沖洗；顯色每孔加底物溶液各一滴顯色A與B；終止每孔加終止液。本發(fā)明檢測速度快，操作方便安全，省時效率高，從而達到了早期診斷和治療類鼻疽的感染；也可以應用于類鼻疽假單胞菌疫原地進行大規(guī)模的流行病學調查。文檔編號G01N33/543GK101504412SQ20091006113公開日2009年8月12日申請日期2009年3月17日優(yōu)先權日2009年3月17日發(fā)明者蔡全信,袁志明,鄭大勝,閻建平,馬廣強申請人:中國科學院武漢病毒研究所