專利名稱：一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生物絮凝劑的方法。
背景技術：
生物絮凝劑(Bioflocculant，BF)是一類由微生物產(chǎn)生的天然生物高分子聚合物，對于液體中的細菌、細胞、固體顆粒、膠體顆粒等懸浮物具有絮凝和沉降功能。與化學絮凝劑相比，生物絮凝劑具備許多優(yōu)點，如高效、無毒、發(fā)酵成本低、無二次污染、可生物降解、 降解產(chǎn)物無害、產(chǎn)品易于固液分離等，新型環(huán)保的生物絮凝劑滿足現(xiàn)今可持續(xù)發(fā)展的要求， 對人類健康及環(huán)境保護都具有重要現(xiàn)實意義，已經(jīng)成為絮凝劑研發(fā)的重要方向之一，是一類新型的綠色凈水劑。目前有關生物絮凝劑研究集中在生物絮凝劑產(chǎn)生菌的分離鑒定與培養(yǎng)、絮凝效能影響因素、絮凝機理以及絮凝劑的化學結(jié)構(gòu)等方面，關于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及實際應用的研究較少，現(xiàn)有生物絮凝劑的發(fā)酵方法，普遍存在能耗高、生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)成本高的問題，不適合大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有生物絮凝劑的發(fā)酵方法存在能耗高、生產(chǎn)效率低、 生產(chǎn)成本高、不適合大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的問題，而提供了一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法。以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法按以下步驟進行一、將放射根瘤菌和球形芽孢桿菌按1 1體積比混合后接種到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為20 30°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得產(chǎn)絮菌種子液；二、將黑曲霉的孢子懸液接種到裝有IOOmL菌絲球培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)1 7d，獲得成熟的菌絲球；三、成熟的菌絲球用滅菌的磷酸鹽溶液沖洗后加入到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，然后按照 10%的體積比加入產(chǎn)絮菌種子液，置于溫度為25 35°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min 的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得混合菌絲球；四、以24h為一個發(fā)酵周期，每一個發(fā)酵周期結(jié)束后將混合菌絲球取出倒入裝有IOOmL新鮮產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為 25 35°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)Mh ；五、重復操作步驟四30 35次，即完成以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑；其中步驟一中放射根瘤菌，屬于lihizobium radiobacter，保藏在美國模式培養(yǎng)物集存庫，保藏編號為ATCC 4525 ；步驟一中球形芽孢桿菌，屬于Bacillus sphaeicus，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 1. 270 ；步驟二中黑曲霉，屬于Aspergillus niger，保藏編號為CGMCC 3. 39260本發(fā)明以菌絲球作為生物質(zhì)載體，通過產(chǎn)絮菌(即放射根瘤菌和球形芽孢桿菌) 與菌絲球(即黑曲霉)的混合培養(yǎng)使產(chǎn)絮菌吸附在菌絲球表面及內(nèi)部孔隙中，獲得混合菌絲球，達到了使游離態(tài)產(chǎn)絮菌固定化的目的，發(fā)酵過程中只需一次性投加產(chǎn)絮菌種子液，實現(xiàn)了生物絮凝劑的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明以發(fā)酵液的絮凝率作為考察指標，24h為一個發(fā)酵周期，僅更換新鮮培養(yǎng)基，無二次投加產(chǎn)絮菌種子液，縮減了種子液準備時間，減少雜菌污染機會，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)能耗；固定化的產(chǎn)絮菌連續(xù)制備生物絮凝劑至少可達30 35個周期。本發(fā)明在保證絮凝率穩(wěn)定的前提下，減少了種子液需求量，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率(絮凝率為90%以上)，對生物絮凝劑的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義。


圖1為具體實施方式
十三30個發(fā)酵周期中菌體生長情況及絮凝率變化圖，其中灰表示產(chǎn)絮菌在30個發(fā)酵周期中的菌濁，柱形圖□表示30個發(fā)酵周期中發(fā)酵液的絮凝率；圖 2為具體實施方式
十三1個發(fā)酵周期中菌體生長、絮凝率及生物絮凝劑粗提物干重的變化圖，其中▲表示產(chǎn)絮菌在固定化發(fā)酵過程中菌濁隨發(fā)酵時間的變化，柱形圖□表示發(fā)酵過程中絮凝率的變化，■表示生物絮凝劑粗提物的干重隨發(fā)酵時間的變化。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法按以下步驟進行一、將放射根瘤菌和球形芽孢桿菌按1 1體積比混合后接種到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為20 30°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得產(chǎn)絮菌種子液；二、將黑曲霉的孢子懸液接種到裝有IOOmL菌絲球培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，置于溫度為觀 32°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)1 7d，獲得成熟的菌絲球；三、成熟的菌絲球用滅菌的磷酸鹽溶液沖洗后加入到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，然后按照1 % 10%的體積比加入產(chǎn)絮菌種子液，置于溫度為25 35°C、轉(zhuǎn)速為 120 160r/min的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得混合菌絲球；四、以24h為一個發(fā)酵周期，每一個發(fā)酵周期結(jié)束后將混合菌絲球取出倒入裝有IOOmL新鮮產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為25 35°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)Mh ；五、重復操作步驟四 30 35次，即完成以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑；其中步驟一中放射根瘤菌，屬于lihizobium radiobacter，保藏在美國模式培養(yǎng)物集存庫，保藏編號為ATCC 4525 ；步驟一中球形芽孢桿菌，屬于Bacillus sphaeicus，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 1. 270 ；步驟二中黑曲霉，屬于Aspergillus niger，保藏編號為CGMCC 3. 39260本實施方式中放射根瘤菌、球形芽孢桿菌和黑曲霉均可以購買得到。本實施方式中涉及的所有培養(yǎng)基均在112°C下滅菌30min。本實施方式步驟三中磷酸鹽溶液由0. 2mol/L的Na2HPO4和0. 2mol/L的NaH2PO4按體積比18 7混合而成，pH值為7. 2。本實施方式步驟五重復操作步驟四30 35次，即可達到連續(xù)制備生物絮凝劑的目的，直至混合菌絲球破裂結(jié)束制備。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中置于溫度為 20°C、轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中培養(yǎng)30h，獲得產(chǎn)絮菌種子液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中置于溫度為 30°C、轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中培養(yǎng)18h，獲得產(chǎn)絮菌種子液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中置于溫度為 25°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)20h，獲得產(chǎn)絮菌種子液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中置于溫度為^°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)7d，獲得成熟的菌絲球。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中置于溫度為32°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)2d，獲得成熟的菌絲球。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)3d，獲得成熟的菌絲球。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟二中黑曲霉的孢子懸液的0D_值為0. 5 1。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟二中黑曲霉的孢子懸液接種采用的接種量為25 50 μ L。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟一、三和四中產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基成本相同，均是由8 12g的葡萄糖、4 6g的K2HPO4U 3g的ΚΗ2Ρ04、 0. 1 0. 3g 的 MgSO4 · 7Η20、0· 05 0. 15g 的 NaCl.O. 4 0. 6g 的尿素和 0. 4 0. 6g 的酵母膏溶于IOOOmL的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH到6. 5 7. 5。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一至十之一不同的是步驟二中菌絲球培養(yǎng)基由8 IOg的葡萄糖、0. 5 1. 5g的ΚΗ2Ρ04、0. 8 1. 2g的NH4Cl和0. 2 0. 6g 的MgSO4溶于IOOOmL蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至十之一相同。
具體實施方式
十二 本實施方式與具體實施方式
一至十一之一不同的是步驟三中置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)25h，獲得混合菌絲球。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至十一之一相同。
具體實施方式
十三本實施方式以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法按以下步驟進行一、將放射根瘤菌和球形芽孢桿菌按1 1體積比混合后接種到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)25h，獲得產(chǎn)絮菌種子液；二、將黑曲霉的孢子懸液接種到裝有IOOmL菌絲球培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)3d，獲得成熟的菌絲球；三、成熟的菌絲球用滅菌的磷酸鹽溶液沖洗后加入到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，然后按照5% 的體積比加入產(chǎn)絮菌種子液，置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)Mh，獲得混合菌絲球；四、以24h為一個發(fā)酵周期，每一個發(fā)酵周期結(jié)束后將混合菌絲球取出倒入裝有 IOOmL新鮮產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為32°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)Mh ；五、重復操作步驟四30次，即完成以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑；其中步驟一中放射根瘤菌，屬于lihizobium radiobacter，保藏在美國模式培養(yǎng)物集存庫，保藏編號為ATCC 4525 ；步驟一中球形芽孢桿菌，屬于Bacillus sphaeicus，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 1. 270 ；步驟二中黑曲霉，屬于Aspergillus niger，保藏編號為CGMCC 3. 39260本實施方式即完成以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑，取發(fā)酵液，采用傳統(tǒng)的混凝杯罐試驗，測定其對IOOOmL高嶺土懸液(5g/L)的絮凝率，其中生物絮凝劑發(fā)酵液投加量為 IOmL, pH為8，10%質(zhì)量分數(shù)的CaCl2溶液投加量為1. 5mL ；在160r/min條件下攪拌120s, 再以40r/min的速度攪拌120s后，室溫下靜沉20min，空白對照除不加生物絮凝劑發(fā)酵液之外其他處理都相同，測定上清液在波長550nm下的吸光度值，按照下式計算絮凝率；
權利要求
1.一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法按以下步驟進行一、將放射根瘤菌和球形芽孢桿菌按1 1體積比混合后接種到裝有IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為20 30°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得產(chǎn)絮菌種子液；二、將黑曲霉的孢子懸液接種到裝有 IOOmL菌絲球培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)1 7d，獲得成熟的菌絲球；三、成熟的菌絲球用滅菌的磷酸鹽溶液沖洗后加入到裝有 IOOmL產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，然后按照 10%的體積比加入產(chǎn)絮菌種子液， 置于溫度為25 :35°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)18 30h，獲得混合菌絲球； 四、以24h為一個發(fā)酵周期，每一個發(fā)酵周期結(jié)束后將混合菌絲球取出倒入裝有IOOmL新鮮產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于溫度為25 35°C、轉(zhuǎn)速為120 160r/min的搖床中培養(yǎng)Mh ；五、重復操作步驟四30 35次，即完成以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑；其中步驟一中放射根瘤菌，屬于Miizobium radiobacter，保藏在美國模式培養(yǎng)物集存庫，保藏編號為ATCC 4525 ；步驟一中球形芽孢桿菌，屬于Bacillus sphaeicus，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 1. 270 ；步驟二中黑曲霉，屬于 Aspergillus niger，保藏編號為 CGMCC 3.3926。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟一中置于溫度為25°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)20h，獲得產(chǎn)絮菌種子液。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟二中置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)3d，獲得成熟的菌絲球。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟二中黑曲霉的孢子懸液的0D_值為0. 5 1。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟二中黑曲霉的孢子懸液接種采用的接種量為25 50μ L。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟一、三和四中產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基成本相同，均是由8 12g的葡萄糖、4 6g的K2HPO4U 3g 的 ΚΗ2Ρ04、0· 1 0. 3g 的 MgSO4 · 7Η20、0· 05 0. 15g 的 NaCl.O. 4 0. 6g 的尿素和 0. 4 0. 6g的酵母膏溶于IOOOmL的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH到6. 5 7. 5。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟二中菌絲球培養(yǎng)基由8 IOg的葡萄糖、0. 5 1. 5g的ΚΗ2Ρ04、0. 8 1. 2g的NH4Cl和 0. 2 0. 6g的MgSO4溶于IOOOmL蒸餾水組成。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，其特征在于步驟三中置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為140r/min的搖床中培養(yǎng)25h，獲得混合菌絲球。
全文摘要
一種以菌絲球為載體發(fā)酵生物絮凝劑的方法，它涉及一種發(fā)酵生物絮凝劑的方法。它解決了現(xiàn)有生物絮凝劑的發(fā)酵方法存在能耗高、生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)成本高、不適合大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的問題。方法一、放射根瘤菌和球形芽孢桿菌混合培養(yǎng)，得產(chǎn)絮菌種子液；二、黑曲霉培養(yǎng)為成熟的菌絲球；三、成熟的菌絲球與產(chǎn)絮菌種子液混合培養(yǎng)，得混合菌絲球；四、以24h為一個發(fā)酵周期，每一個發(fā)酵周期結(jié)束后將混合菌絲球取出倒入新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)；五、重復操作步驟四30～35次即完成。本發(fā)明在保證絮凝率穩(wěn)定的前提下，減少種子液需求量，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)能耗，對生物絮凝劑的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義。
文檔編號C12R1/07GK102260729SQ201110173489
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權日2011年6月24日
發(fā)明者張斯 , 張淑娟, 李昂, 楊基先, 王繼華, 王金娜, 邢潔, 馬放 申請人:哈爾濱工業(yè)大學