專利名稱：：結(jié)合于psca蛋白的用于癌癥診斷的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文所描述的發(fā)明涉及結(jié)合于被稱為PSCA的蛋白質(zhì)的抗體及其結(jié)合片段、及由其工程化改造得到的分子。本發(fā)明還涉及用于治療表達PSCA的癌的診斷、預(yù)測、預(yù)防和治療方法和組合物。
背景技術(shù)：
：癌癥是僅次于冠心病的第二大人類死亡原因。世界范圍內(nèi)每年有數(shù)百萬人死于癌癥。僅在美國，如美國癌癥協(xié)會的報告，癌癥每年造成50萬以上的人死亡，同時每年有120萬人被新診斷患有癌癥。雖然死于心臟病的人數(shù)明顯減少，但死于癌癥的人數(shù)正在逐漸上升。在下世紀初，預(yù)計癌癥將成為頭號死亡原因。世界范圍內(nèi)，有幾種癌癥是主要的殺手。尤其是肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌，它們是癌癥死亡的主要原因。這些癌以及事實上所有其它癌都具有相同的致命特征。幾乎沒有例外地，轉(zhuǎn)移性癌疾病是致命的。此外，即便對于那些在原發(fā)性癌中存活下來的癌癥患者而言，一般經(jīng)驗顯示，他們的生活都發(fā)生了顯著的改變。許多癌癥患者由于擔(dān)心復(fù)發(fā)或治療失敗而產(chǎn)生了強烈的焦慮感。許多癌癥患者在治療后身體虛弱。此外，許多癌癥患者會經(jīng)歷復(fù)發(fā)。世界范圍內(nèi)，前列腺癌是男性第四大流行癌癥。在北美和北歐，它幾乎是男性中最常見的癌癥，同時是造成男性癌癥死亡的第二大原因。僅在美國，每年有30，000以上的男性死于這種疾病-僅次于肺癌。除了這些數(shù)字數(shù)值巨大，還沒有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效治療方法。外科前列腺切除術(shù)、放療、激素注射治療、手術(shù)閹割和化療仍然是主要的治療手段。不幸的是，這些治療方法對于許多人無效，并且常常會帶來不快結(jié)果。就診斷而言，缺乏能準確檢測早期局限性腫瘤的前列腺腫瘤標記仍舊是這種疾病診斷和治療中的一個重要限制。盡管血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測已經(jīng)成為一種有效工具，但廣泛認為它在一些重要方面缺乏特異性和通用性。通過產(chǎn)生可再現(xiàn)小鼠中疾病不同階段的前列腺癌異種移植物促進了其它前列腺癌特異性標記的鑒定。LAPC(洛杉磯前列腺癌)異種移植物是在嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中有存活傳代的前列腺癌異種移植物，并顯示出模擬從雄激素依賴轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に夭灰蕾囆?Klein等，1997，Nat.Med.3:402)。最近鑒定的前列腺癌標記包括PCTA-I(Su等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7252)、前列腺特異性膜(PSM)抗原(Pinto等，ClinCancerRes1996-9-2(9)1445-51)、STEAP(Hubert等，ProcNatlAcadSciUSA.1999-12-7；96(25):14523-8)和前列腺干細胞抗原(PSCA)(Reiter等，1998，Proc.Natl.Acad.ki.USA95:1735)。盡管以前鑒定的標記如PSA、PSM、PCTA和PSCA具有有助于診斷和治療前列腺癌的作用，但還需要鑒定出前列腺癌和相關(guān)癌癥的其它標記和治療靶以進一步促進診斷和治療。腎細胞癌(RCC)占到成人惡性腫瘤的約3%。一旦腺瘤的直徑達到2-3cm就可能惡化。在成人中，兩種主要的惡性腎腫瘤是腎細胞腺癌和腎盂或輸尿管移行細胞癌。估計在美國腎細胞腺癌的發(fā)病率超過29，000例，并且1998年有超過11，600名患者死于這種疾病。移行細胞癌較為少見，其在美國的發(fā)病率約為每年500例。數(shù)十年來，手術(shù)一直是腎細胞腺癌的主要治療方法。直到最近，轉(zhuǎn)移性疾病還很難用任何全身療法來控制。隨著最近全身療法尤其是免疫療法的發(fā)展，持續(xù)性應(yīng)答可能會在合適的患者中進攻轉(zhuǎn)移性腎細胞癌。不過，仍然需要治療這些患者的有效方法。在美國所有的新癌癥病例中，膀胱癌在男性中約占5%(第五種最常見的瘤)，在女性中占3%(第八種最常見的瘤)。該發(fā)病率緩慢增加，且隨著老年人口的增加這一數(shù)字也在升高。在1998年，估計有M，500病例，其中包括39，500名男性和15，000名女性。在美國，這種年齡調(diào)整發(fā)病率為每100，000男性32人，每100，000女性8人。歷史上男性/女性31的比例可能會由于女性吸煙而降低。估計1998年有11，000人死于膀胱癌(7，800名男性和3，900名女性)。膀胱癌的發(fā)病率和死亡率隨著年齡增加而急劇上升，并且隨著人口老齡化而成為日益嚴重的問題。大多數(shù)膀胱癌在膀胱中會復(fù)發(fā)。膀胱癌通過經(jīng)尿道膀胱切除術(shù)(TUR)和膀胱內(nèi)化療或免疫療法的組合來治療。膀胱癌的多病灶和復(fù)發(fā)特性指出了TUR的局限性。大多數(shù)肌肉浸潤性癌癥不能僅通過TUR治愈。根治性膀胱切除術(shù)和尿流改道術(shù)是最有效的根治這種癌癥的方法，但會對泌尿和性功能造成不可否認的影響。顯然還需要對膀胱癌患者有益的治療方法。估計2000年美國共發(fā)生130，200例結(jié)腸直腸癌，包括93，800例結(jié)腸癌和36，400例直腸癌。結(jié)腸直腸癌是男性和女性中的第三大癌癥。在1992-1996年間其發(fā)病率顯著減低(每年降低2.1%)。研究表明，這些降低是由于檢查和息肉切除增加，從而防止了息肉發(fā)展成浸潤性癌癥。估計2000年有56，300人死亡07，700人死于結(jié)腸癌，8，600人死于直腸癌)，占美國癌癥死亡總?cè)藬?shù)的約11%。目前，外科手術(shù)是最常見的治療結(jié)腸直腸癌的方法，對于還未擴散的癌癥經(jīng)常采用這種方法。對于大多數(shù)已經(jīng)深度腸壁穿孔或已經(jīng)擴散到淋巴結(jié)的癌癥患者，通常在手術(shù)前或手術(shù)后進行化療，或化療加放療。對結(jié)腸癌有時也需要永久性結(jié)腸造口術(shù)(在腹部形成一開口以排除人體廢物)，同時直腸癌也偶爾需要這種手術(shù)。仍需要有效的診斷和治療結(jié)腸直腸癌的方法。估計2000年新增164，100例肺和支氣管癌癥，占美國總癌癥診出人數(shù)的14%。肺和支氣管癌癥癥的發(fā)病率在男性中顯著降低，從1984年的86.5/100，000降低到1996年的70.0。在20世紀90年代，女性中發(fā)病率的增加勢頭開始放慢。在1996年，女性中的發(fā)病率為42.3/100，000。估計2000年肺和支氣管癌癥造成156，900人死亡，占總癌癥死亡人數(shù)的觀％。1992-1996年間，肺癌的死亡率在男性中顯著降低(每年降低1.7%)，而在女性中該比例卻顯著上升(每年0.9%)。從1987年以來，相比乳腺癌，每年有更加多的女性死于肺癌，而乳腺癌在過去40年中都是女性癌癥死亡的主要原因。肺癌發(fā)病率和死亡率降低很大可能與過去30年吸煙率降低有關(guān)；然而，女性吸煙率的降低滯后于男性。需要關(guān)注的是，盡管成年人的吸煙率已經(jīng)慢慢降低，但青年人的吸煙率卻又在升高。肺和支氣管癌癥的治療方案是由癌癥的類型和階段決定的，其中包括手術(shù)、放療和化療。對許多局限性癌癥而言，通常選擇手術(shù)治療。由于這種疾病通常隨發(fā)現(xiàn)時間而擴散，放療和化療通常需要與手術(shù)聯(lián)合使用?？蛇x擇化療本身或與結(jié)合放療來治療小細胞肺癌；采用這種方案時，大多數(shù)患者的癥狀會緩解，其中有些是長效的。然而，仍舊需要有效的治療和診斷肺和支氣管癌癥的方法。2000年，估計美國婦女中有182，800例新發(fā)乳腺癌病例。此外，估計2000年在男性中新診斷出約1，400例乳腺癌病例。在20世紀80年代，女性中乳腺癌的發(fā)病率每年增加約4%，而在90年代該發(fā)病率比較平穩(wěn)，約為每100，000人110.6例。僅在美國，估計2000年有41，200人(40，800名女性，400名男性)死于乳腺癌。乳腺癌在女性癌癥死亡中位居第二位。根據(jù)最新數(shù)據(jù)，無論是白人還是黑人，該死亡率在1992-1996年間顯著降低，同時在年輕婦女中降低程度最大。這些降低可能是由于早期檢查和治療方法改進的結(jié)果?？紤]到醫(yī)療環(huán)境和患者的狀況，乳腺癌的治療方法可包括局部病灶切除術(shù)(局部切除腫瘤)并除去手臂下的淋巴結(jié)；乳房切除術(shù)(手術(shù)切除乳房)并除去手臂下的淋巴結(jié)；放療；化療；或激素療法。通常可聯(lián)合使用兩種或多種方法。大量研究顯示，對于早期疾病，局部病灶切除術(shù)加放療后的長期存活率與乳房改良根治術(shù)后的存活率類似。重建技術(shù)的重大進步能夠在乳房切除術(shù)后提供一些關(guān)于乳房再造術(shù)的選項。最近，這種再造術(shù)已經(jīng)與乳房切除術(shù)同時進行。局部切除導(dǎo)管原位癌(DCIS)及周圍適量正常乳房組織可防止DCIS復(fù)發(fā)。照射乳房和/或他莫昔芬治療可降低剩余乳房組織發(fā)生DCIS的機會。這是重要的，因為如果DCIS不治療的話將發(fā)展成浸潤性乳腺癌。而且，這些治療方法有嚴重的副作用或后遺癥。因此，需要有治療乳腺癌的有效方法。估計2000年在美國新發(fā)23，100例卵巢癌。這占所有婦科癌癥的4%并且是第二大婦科癌癥。1992-1996年間，卵巢癌發(fā)病率顯著降低。卵巢癌的結(jié)果是，估計2000年有14，000人死亡。相比婦女生殖系統(tǒng)的其它癌癥，卵巢癌造成更多人死亡。治療卵巢癌的方法有手術(shù)、放療和化療。手術(shù)通常包括除去一側(cè)或兩側(cè)的卵巢、輸卵管(輸卵管-卵巢切除術(shù))以及子宮(子宮切除術(shù))。在一些非常早期的腫瘤中，只有有關(guān)卵巢會被切除，尤其是對于那些希望生孩子的年輕女性。在晚期疾病中，需要除去腹內(nèi)所有疾病部位以增強化療效果。有效治療卵巢癌的方法仍是重要需求。估計2000年在美國新發(fā)28，300例胰腺癌。在過去20年中，男性胰腺癌的發(fā)病率有所降低。女性發(fā)病率仍保持幾乎恒定，但也可能開始減低。估計2000年在美國胰腺癌造成觀，200人死亡。在過去20年中，男性中死亡率有輕微但明顯的降低(每年約降低0.9%)，而該比例在女性中輕微升高。可通過手術(shù)、放療和化療來治療胰腺癌。在大多數(shù)患者中，這些治療方法可延長存活時間和/或緩解癥狀，但不可能全部治愈。迫切需要有其它治療和診斷癌癥的方法。這些方法包括將抗體、疫苗和小分子用作治療形式(modality)。此外，還需要將這些形式用作癌癥治療和研究所有領(lǐng)域中診斷、檢測、監(jiān)測的研究工具，和技術(shù)發(fā)展水平。人們已認識到單克隆抗體(MAbs)的治療用途(G.Kohler和C.Milstein,Nature256:495-497(1975))。目前，單克隆抗體已獲批準用于移植、癌癥、傳染病、心血管疾病和炎癥的治療中。不同的同種型具有不同的效應(yīng)子功能。這些功能上的不同對應(yīng)于各種免疫球蛋白同種型的不同三維結(jié)構(gòu)(P.M.Alzari等，AnnualRev.Immunol.，6555-580(1988))。由于將小鼠用于免疫和識別大多數(shù)異質(zhì)的人抗原中十分便利，針對具有治療潛力的人靶標的MAbs通常均為鼠源性。然而，鼠MAbs在人類治療中本身具有缺陷。由于MAbs在人體中的循環(huán)半衰期比人抗體短，需要更頻繁地給予MAbs。更關(guān)鍵的是，重復(fù)將鼠抗體給予人免疫系統(tǒng)會造成人免疫系統(tǒng)通過將小鼠蛋白質(zhì)識別為異質(zhì)物并產(chǎn)生人抗小鼠抗體(HAMA)的應(yīng)答。這種HAMA應(yīng)答會造成過敏反應(yīng)，并從免疫系統(tǒng)中迅速清除鼠源抗體，從而使得采用鼠源抗體的治療無效。為了避免這種影響，已進行了在小鼠中建立人免疫系統(tǒng)的嘗試ο在初期的嘗試中希望建立能以具有人序列的抗體應(yīng)答抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見Bruggemann等，Proc.Nat'1.Acad.Sci.USA86:6709-6713(1989))，但卻受限于能由可用的克隆載體所穩(wěn)定保持的DNA的量。采用酵母人工染色體(YAC)克隆載體開辟了將人Ig座位的大種系片段導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因哺乳動物的道路?；旧洗蟛糠秩薞、D和J區(qū)域基因以在人基因組中發(fā)現(xiàn)的相同間隔排列，并采用YAC將人恒定區(qū)導(dǎo)入小鼠。已知一種此類轉(zhuǎn)基因小鼠品系稱作XenoMouse(r)小鼠，其可購自Abgenix，he.(FremontCA)。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了結(jié)合于PSCA蛋白和PSCA蛋白多肽片段的抗體及其結(jié)合片段和它們經(jīng)工程化改造所得到的分子。本發(fā)明包括多克隆和單克隆抗體、鼠和其它哺乳動物抗體、嵌合抗體、人化和全長人抗體、以及用可檢測標記或治療劑標記的抗體。在某些實施方式中，前提是圖3的核酸序列不被整個編碼和/或圖2的氨基酸序列不被整個制備。在某些實施方式中，編碼圖3的整個核酸序列和/或制備圖2的整個氨基酸序列，兩者中的任一均為各自的人單位劑型。本發(fā)明還提供了檢測各種生物樣品中PSCA多核苷酸和蛋白質(zhì)的存在及狀態(tài)的方法，以及鑒定表達PSCA的細胞的方法。本發(fā)明的一個實施方案提供了監(jiān)測含有或疑有某些生長失調(diào)形式如癌癥的組織或血液樣品中的PSCA基因產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還提供了各種免疫原性或治療性組合物以及治療表達PSCA的癌癥(如表I中列出的組織的癌癥)的方法，包括針對抑制PSCA轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工或發(fā)揮功能的療法，以及癌癥疫苗。一方面，本發(fā)明提供了組合物和包含組合物的方法，以治療病人表達PSCA的癌癥，其中所述組合物包含適合人使用的載體和人單位劑量的一種或多種抑制PSCA制造或功能的試劑。優(yōu)選所述載體是單一人載體。在本發(fā)明的另一方面，所述試劑是與PSCA蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的部分。這種部分的非限制性例子包括但不限于抗體(如單鏈、單克隆、多克隆、人源化、嵌合或人抗體)、其功能等價物(包括天然產(chǎn)生或合成的)以及它們的組合。所述抗體可與診斷性或治療性部分綴合。在另一方面，所述試劑是上面定義的小分子。圖1。PSCA(也稱為PSCAv.1”或“PSCA變體1”)的cDNA(SEQIDNO1)和氨基酸序列(SEQIDNO2)示于圖1A。Kozak序列以黑體表示，起始的甲硫氨酸用下劃線表示。開放閱讀框從18號氨基酸延伸到389號氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體2(也稱為“PSCAv.2")的cDNA(SEQIDNO3)和氨基酸序列(SEQIDNO4)示于圖IB中。Kozak序列以黑體表示，起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開放閱讀框從56號氨基酸延伸到427號氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體3(也稱為“PSCAν·3”)的cDNA(SEQIDNO:5)和氨基酸序列(SEQIDNO6)示于圖IC中。Kozak序列以黑體表示，起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開放閱讀框從423號氨基酸延伸到707號氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體4(也稱為“PSCAν·4”)的cDNA(SEQIDNO:7)和氨基酸序列(SEQIDNO8)示于圖ID中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開放閱讀框從4M號氨基酸延伸到993號氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體5(也稱為“PSCAν·5”)的cDNA(SEQIDNO:9)和氨基酸序列(SEQIDNO10)示于圖IE中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開放閱讀框從910號氨基酸延伸到1479號氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體6(也稱為“PSCAv.6”)的cDNA(SEQIDNO:11)和氨基酸序列(SEQIDNO12)示于圖IF中。Kozak序列以黑體表示，起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開放閱讀框從83號氨基酸延伸到427號氨基酸，其中包括了終止密碼子。圖IG0PSCAv.2、PSCAv.7至v.18的SNP變體。PSCAv.7至v.18蛋白質(zhì)含有123個氨基酸。變體PSCAv.7至v.18是有一個核苷酸不同于PSCAv.2的變體，并編碼與v.2相同的蛋白質(zhì)。雖然分別顯示了這些SNP變體，但它們也可以上面圖1A-1F中列出的任何組合和任何轉(zhuǎn)錄變體存在。圖1H。PSCAv.4、PSCAv.19至v.30的SNP變體。PSCAv.19至v.30蛋白質(zhì)含有189個氨基酸。變體PSCAv.19至v.30是有一個核苷酸不同于PSCAv.4的變體。PSCAv.9、v.10、v.11、v.24和v.25蛋白質(zhì)只有一個氨基酸不同于PSCAν·1。PSCAv.23、v.28、v.29和v.30編碼與v.4相同的蛋白質(zhì)。雖然分別顯示了這些SNP變體，但它們也可以任何組合和以任何轉(zhuǎn)錄變體v.3和v.4存在。圖II。PSCA變體的表達。(11(a))設(shè)計引物來區(qū)分PSCAv.1/v.2/v.4,PSCAv.3和PSCAv.5。圖中在外顯子上方用小箭頭標示出的是引物A和B，通過這些引物得到PSCAv.1/v.2/v.4的425bp的PCR產(chǎn)物、PSCAv.3的300bp的PCR產(chǎn)物和PSCAv.5的910bp的PCR產(chǎn)物。(11(b))制備的第一鏈cDNA，其得自正常膀胱、腦、心、腎、肝、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰、結(jié)腸、胃、前列腺癌混合物、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌。通過PCR用肌動蛋白的引物進行標準化。使用變體特異性引物以30輪擴增進行半定量PCR。結(jié)果顯示，PSCAv.5主要在乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌中表達，而在結(jié)腸癌和肺癌表達水平較低。在前列腺癌、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌中檢出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物。在正常組織中，僅在前列腺和胃中檢出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物，在腎和肺中水平較低，而未在任何正常組織中檢出PSCAv.5。未在任何測試樣品中檢出PSCAv.3的PCR檢測產(chǎn)物。圖1J。PSCAv.4和PSCAv.5的表達。IJ(a)設(shè)計如圖中箭頭所示標記為B和C的引物來區(qū)分PSCAv.4和PSCAv.5。PSCAv.4特異性引物產(chǎn)生了460bp的PCR產(chǎn)物、而PSCAv.5特異性引物產(chǎn)生了大小為94^p的PCR產(chǎn)物。lj(b)制備的第一鏈cDNA得自正常膀胱、腦、心、腎、肝、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰、結(jié)腸、胃、前列腺癌混合物、膀胱癌和多種異種移植物混合物(前列腺癌、腎癌和膀胱癌異種移植物)。通過PCR用肌動蛋白的引物進行標準化。使用變體特異性引物以30輪擴增進行半定量PCR。結(jié)果顯示，PSCAv.4在前列腺癌、膀胱癌以及多種異種移植物混合物、正常腎臟和前列腺中表達。僅在正常前列腺和膀胱癌中檢出PSCAv.5。圖2。PSCA抗體的氨基酸。圖2A。Ha1-4.117VH的氨基酸序列(SEQIDNO13)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2B。Hal-4.117VL的氨基酸序列(SEQIDN0:14)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2C。Ha1-4.120VH的氨基酸序列(SEQIDNO:15)。圖2D。Ha1-4.120VL氨基酸序列(SEQIDN0:16)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2E。Hal_5.99VH的氨基酸序列(SEQIDNO17)ο下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2F。Hal_5.99VL的氨基酸序列(SEQIDNO:18)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2G。Hal-4.121VH的氨基酸序列(SEQIDN0:19)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2H。Hal-4.121VLc.5的氨基酸序列(SEQIDNO:20)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖21。Hal-4.121VLc.26的氨基酸序列(SEQIDNO21)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2J。Hal-1.16VH的氨基酸序列(SEQIDNO:22)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖I。Hal-L16VL的氨基酸序列(SEQIDNO23)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2L。Hal-4.5VH的氨基酸序列(SEQIDNO24)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2M。Hal_4.5VL的氨基酸序列(SEQIDNO25)下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2N。Hal_4.40VH的氨基酸序列(SEQIDNO:26)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖20。Hal-4.40VL的氨基酸序列(SEQIDNO:27)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2P。Hal-4.37VH的氨基酸序列(SEQIDNO:28)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2Q。Hal-4.37VL的氨基酸序列(SEQIDNO:29)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2R。Hal-1.43VH的氨基酸序列(SEQIDNO:30)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2S。Hal-1.43VL的氨基酸序列(SEQIDN0:31)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2T。Hal-1.152VH的氨基酸序列(SEQIDN0:32)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2U。Hal_l.152VL的氨基酸序列(SEQIDN0:33)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3。PSCA抗體的核苷酸和氨基酸序列。圖3A。Hal_4.117VH的cDNA(SEQIDNO34)和氨基酸序列(SEQIDNO:35)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3B。Hal_4.117VL的cDNA(SEQIDNO:36)和氨基酸序列(SEQIDNO:37)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3C。Hal-4.120VH的cDNA(SEQIDNO38)和氨基酸序列(SEQIDNO39)。下劃線處為重鏈恒9定區(qū)。圖3D。Hal-4.120VL的cDNA(SEQIDNO:40)和氨基酸序列(SEQIDNO:41)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3E。Hal-5.99VH的cDNA(SEQIDNO:42)和氨基酸序列(SEQIDNO43)ο下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3F。Hal-5.99VL的cDNA(SEQIDNO:44)和氨基酸序歹丨J(SEQIDN0:45)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3G。Hal_4.121VH的cDNA(SEQIDNO:46)和氨基酸序列(SEQIDN0:47)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3H。Hal_4.121VLc.5的cDNA(SEQIDNO:48)和氨基酸序列(SEQIDNO:49)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖31。Hal-4.121VLc.26的cDNA(SEQIDNO50)和氨基酸序列(SEQIDNO51)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3J。Hal-L16VH的cDNA(SEQIDNO52)和氨基酸序列(SEQIDNO53)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3K。Hal-1.16VL的cDNA(SEQIDNO:54)和氨基酸序列(SEQIDNO55)ο下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3L。Hal-4.5VH的cDNA(SEQIDNO:56)和氨基酸序列(SEQIDN0:57)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3M。Hal_4.5VL的cDNA(SEQIDNO58)和氨基酸序歹Ij(SEQIDN0:59)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3N。Hal_4.40VH的cDNA(SEQIDN0:60)和氨基酸序列(SEQIDNO:61)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖30。Hal-4.40VL的cDNA(SEQIDNO:62)和氨基酸序列(SEQIDNO:63)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3P。Hal-4.37VH的cDNA(SEQIDNO:64)和氨基酸序列(SEQIDNO65)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3Q。Hal-4.37VL的cDNA(SEQIDNO:66)和氨基酸序列(SEQIDNO:67)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3R。Hal-1.43VH的cDNA(SEQIDNO:68)和氨基酸序列(SEQIDNO:69)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3S。Hal-1.43VL的cDNA(SEQIDNO:70)和氨基酸序列(SEQIDN0:71)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3T。Hal-1.152VH的cDNA(SEQIDNO72)和氨基酸序列(SEQIDNO73)。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3U。Hal-1.152VL的cDNA(SEQIDNO74)和氨基酸序列(SEQIDNO:75)。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖4。PSCA抗體與種系V-D-J序列的的比對。圖4A。Hal-4.117VH(SEQIDNO:13)與人VH4-31的比對。圖4B。Hal-4.117VL(SEQIDNO:14)與人L19的比對。圖4C。Hal-4.120VH(SEQIDNO:15)與人VH4-31的比對。圖4D。Hal_4.120VL(SEQIDNO:16)與人02的比對。圖4E。Hal-5.99VH(SEQIDNO:17)與人VH4-34的比對。圖4F。Hal_5.99VL(SEQIDNO18)與人A27的比對。圖4G。Hal-4.121VH(SEQIDNO:19)與人VH4-34的比對。圖4H。Hal-4.121c.5VL(SEQIDNO:20)與人08的比對。圖41。Hal-4.121c.26VL(SEQIDNO21)與人A3的比對。圖4J。Hal-1.16VH(SEQIDNO:22)與人VH6-1的比對。圖4K。Hal-1.16VL(SEQIDNO:23)與人B3的比對。圖4L。Hal_4.37VH(SEQIDNO:28)與人VH4-31的比對。圖4M。Hal-4.37VL(SEQIDNO:29)與人02的比對。圖5。重組小鼠、大鼠和人細胞系中PSCA蛋白的表達。所示的小鼠、大鼠和人細胞系用載有人PSCAcDNA和新霉素抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染或用僅載有新霉素抗性基因的對照病毒感染。在G418的存在下篩選穩(wěn)定的重組細胞系。采用1G8抗-PSCAMAb(5μg/ml)染色的FACS測定PSCA的表達。所示為各細胞系中的FACS分布圖，顯示熒光漂移僅在受PSCA感染的細胞系中存在，指示PSCA在細胞表面表達。這些細胞系可在MAb開放中用作免疫源、MAb篩選試劑，以及用在功能分析中。圖6。獲自大腸桿菌的PSCA蛋白的純化。用編碼PSCAcDNA21_94氨基酸的pET_21b載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21pLysS。通過用IPTG誘導(dǎo)對數(shù)生長期培養(yǎng)來表達PSCA蛋白，并從裂解細菌的可溶性或不溶性部分中用親和層析法純化該蛋白。所示為洗脫部分的SDS-PAGE考馬斯藍染色凝膠。該蛋白質(zhì)可用作MAb和pAb免疫原以及用作抗體篩選試劑。圖7。由細胞表達的重組糖基化PSCA蛋白的純化。用載有編碼PSCAcDNA^-lOO氨基酸的psecTag2載體轉(zhuǎn)染細胞。通過用潮霉素B進行藥物篩選建立穩(wěn)定的重組PSCA-分泌型細胞系。通過采用1G8MAb的親和層析法純化存在于條件培養(yǎng)基中的PSCA蛋白。所示為低ρΗ洗脫部分的考馬斯藍染色SDS-PAGE凝膠。在內(nèi)源表達的PSCA中觀察到的寬分子量蛋白質(zhì)拖尾指示了重組PSCA蛋白的糖基化。圖8。獲自大腸桿菌的GST-PSCA蛋白的純化。用編碼融合于谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶(GST)的PSCA的18-98氨基酸的pGEX_2T轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21DE3。在對數(shù)生長期培養(yǎng)物中用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)GST-PSCA蛋白，并從裂解的細菌中用谷胱甘肽葡聚糖基質(zhì)親和層析法來純化該蛋白。所示為含有GST-PSCA的谷胱甘肽洗脫部分的SDS-PAGE考馬斯藍染色凝膠。表明存在完整的GST-PSCA融合蛋白和少量含GST的降解產(chǎn)物。該蛋白質(zhì)可用作MAb和pAb免疫原以及用作Ab篩選試劑。圖9A-B。采用FACS的人PSCA抗體篩選。采用ELISA測定上清液中抗體濃度。將(純)50μ1/孔加入96孔FACS板中，并進行系列稀釋。加入表達PSCA的細胞(內(nèi)源或重組，50，000個細胞/孔)，在4°C下孵育該混合物2小時。孵育后，用FACS緩沖液洗滌細胞，然后于4°C下在100μ1檢測抗體(抗-hlgG-PE)中孵育45分鐘。孵育結(jié)束后，用FACS緩沖液洗滌細胞，甲醛固定，用FACScan分析。采用CellQuestPro軟件分析數(shù)據(jù)。實心直方圖表示獲自陰性對照細胞的數(shù)據(jù)，空心直方圖表示獲自PSCA陽性細胞的數(shù)據(jù)。圖10。通過FACS測定的PSCAMAb相對親和力等級。在4°C下，將21個系列12稀釋的各個PSCA抗體與SW780細胞(50，000個細胞/孔)孵育過夜(MAb終濃度為40nM-0.038pM)。孵育結(jié)束后，洗滌細胞，于抗_hIgG_PE檢測抗體共同孵育。洗去未結(jié)合的二抗后，用FACS分析細胞，采用CellQuestPro軟件得出各點的平均熒光強度。采用S型劑量響應(yīng)(可變斜率)公式，以GraphpadPrism軟件計算親和力。圖中所示為描述PSCAMAb4.121結(jié)合滴度的代表性FACS分析。圖11。細胞中小鼠和獼猴PSCA的表達以及采用抗人PSCAMAb的識別。用載有小鼠PSCAcDNA、猿猴PSCAcDNA的pCDNA3.1載體或空載體(新，neo)瞬時轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后2天，收集細胞并用人抗PSCAMAbHal-4.117或小鼠MAb168(5μβ/πι1)染色。所示為FACS分布圖，顯示了由人PSCA蛋白產(chǎn)生的MAbHal-4.117結(jié)合于在細胞中表達的小鼠和猿猴PSCA蛋白。小鼠1G8MAb結(jié)合于猿猴PSCA，但不結(jié)合小鼠PSCA。該結(jié)果表明可與其它物種的抗原交叉反應(yīng)的所選MAb的能力。交叉反應(yīng)的MAb可用于那些物種的表達和毒性研究中。圖12。與MAb4.121共同孵育后的PSCA內(nèi)化作用。在4°C下，將PSCAMAb4.121與PC3-PSCA共同孵育90分鐘，以使所述抗體結(jié)合于所述細胞表面。然后將細胞分成兩等份，在37°C(使得抗體內(nèi)化)或4°C(無內(nèi)化對照)下孵育。在37°C或4°C下孵育后，用酸洗去除結(jié)合于細胞表面的殘留PSCAMAb4.121。隨后的檢測二抗?jié)B透和孵育使得內(nèi)化的PSCAMAb4.121得以檢測。采用FACS分析細胞或在熒光顯微鏡下進行觀察。在37°C下孵育2小時后，約30%的PSCAMAb4.121被內(nèi)化。圖13。PSCA表達細胞中的PSCA抗體介導(dǎo)皂草素依賴性殺傷。在第一天時將B300.19細胞(750個細胞/孔)接種入96孔板。第二天在各孔中加入等體積的含2X濃度的指示一抗和2倍過量的連接有皂草素毒素的抗人(Hum-Zap)或抗山羊(山羊-Zap)多克隆抗體(AdvancedTargetingSystems,SanDiego,CA)在37°C下孵育細胞5天。孵育期結(jié)束后，向各孔中加入MTS(Promega)，并繼續(xù)孵育4小時。測定450nM的OD0圖13(A)中的結(jié)果顯示在B300.19-PSCA細胞中存在PSCA抗體HA1-4.121和HA1-4.117介導(dǎo)的皂草素依賴性細胞毒性，而在對照非特異性IgGl抗體中則無作用。圖13(B)中的結(jié)果顯示加入不能識別人Fc的皂草素結(jié)合的二抗，不能介導(dǎo)細胞毒作用。圖14是B300.19/PSCA中幼兔補體介導(dǎo)的細胞毒作用(100，000個細胞/孔)。用RHB緩沖液(RPMI1640,GibcoLifeTechnologies,20mMHEPES)稀釋PSCA抗體(0-50μg/ml)。在RHB緩沖液中洗滌表達B300.19-PSCA的細胞，以IO6個細胞/ml的密度重新懸浮。在典型試驗中，將50μ1PSCA抗體、50μ1稀釋的兔補體血清(Cedarlane，Ontario，Can)和50μ1的細胞懸液同時加入到平底組織培養(yǎng)96孔板中。在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育混合物2小時以促進補體介導(dǎo)的細胞裂解。將50μ1的Alamar藍(BiosourceIntl.Camarillo,CA)加入各孔中，在37°C下繼續(xù)孵育4-5小時。用96孔熒光計在530nm處激發(fā)、590nm處發(fā)射讀取各孔的熒光值。結(jié)果顯示具有IgGl(HA1-4.121)或IgG2同種型(HA1-5.99.1)而不是IgG4同種型(HA1-6.46)的PSCA抗體能介導(dǎo)靶細胞的補體依賴性裂解。圖15。通過胃蛋白酶消化產(chǎn)生MAbHa1-4.121的F(ab，)2片段。將2Omg的MAbHa1-4.121的20mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)與和不與固定化的胃蛋白酶(Pierce.RockfordIL)孵育指定的時間。通過蛋白A層析去除完整的MAb和消化的Fc片段。所示為完整的未經(jīng)消化、未被還原的MAb、在指定時間取出的未還原等份的經(jīng)消化的材料以及最終消化F(ab')2產(chǎn)物的還原樣品的PAGE考馬斯染色凝膠。圖16。通過流式細胞計量術(shù)測定的重組抗PSCA人MAb于PSCA的結(jié)合。(16A)用編碼抗PSCA人MAb重鏈和輕鏈的表達構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細胞。48小時后收集上清，分析與PSCA的結(jié)合。(16Β)從雜交瘤上清液中純化抗PSCA人MAb并用于PSCA結(jié)合分析。如下測試PSCA的結(jié)合性。將PC3親本或PC3-PSCA細胞與如上所述的抗PSCA人MAbs在冰上一起孵育30分鐘。洗滌細胞，與PE結(jié)合的抗人Ig在冰上共同孵育30分鐘。洗滌細胞，然后用流式細胞計量術(shù)進行分析。圖17。通過免疫組化法對PSCA蛋白的檢測。使用抗體ΗΑ1-4.117檢測PSCA蛋白在獲自癌癥患者的腫瘤標本中的表達。將經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切成4微米的切片，置于玻璃載玻片上。對切片進行脫蠟、重新水化并用抗原回收溶液(AntigenRetrievalCitraSolution；BioGenex,4600NorrisCanyonRoad，SanRamon，CA，94583)在高溫下處理。然后在4°C下將切片孵育在熒光素結(jié)合的人單克隆抗PSCA抗體Hal-4.117中16小時。在緩沖液中洗滌所述載玻片3次，再與兔抗熒光素共同孵育1小時，在緩沖液中洗滌后，浸漬在DAKOEnVision+過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔免疫球蛋白二抗(DAK0Corporation，Carpenteria，CA)中30分鐘。然后在緩沖液中洗滌切片，用DAB試劑盒(SIGMAChemicals)顯影，用蘇木精復(fù)染，采用亮視野顯微術(shù)進行分析。結(jié)果顯示PSCA在前列腺癌(圖A、圖B)、膀胱移行細胞癌(圖C)和胰導(dǎo)管腺癌(圖D)的腫瘤細胞中表達。這些結(jié)果表明PSCA在人癌癥中表達，抗這一抗原的抗體可用作診斷試劑。圖18。PSCAMAbHa1-4.120對皮下前列腺癌異種移植物生長的抑制。將LAPC-9AI腫瘤細胞O.0X106個細胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。將小鼠隨機分組(各組中的η=10)，按照指示在第0天時，通過腹膜內(nèi)注射(i.p.)HAl-4.120或同種型MAb對照開始治療。每周對動物進行2次治療，總共給藥7次，直至研究的第觀天。按照指示每3-4天用測徑儀檢測腫瘤的生長。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Hal-4.120顯著地抑制了SCID小鼠中皮下植入的人前列腺癌異種移植物的生長(P<0.05)。圖19。PSCAMAbHal_5.99對SCID小鼠中建立的前列腺癌異種移植物生長的抑制。將LAPC-9AI腫瘤細胞O.OXlO6個細胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。當腫瘤體積達到50mm3時，將小鼠隨機分組(各組中的n=10)，按照指示腹膜內(nèi)注射(i.p.)HAl_5.99.1或同種型MAb對照開始治療。每周對動物進行2次治療，總共給藥5次，直至研究的第14天。按照指示每3-4天用測徑儀檢測腫瘤的生長。結(jié)果顯示全人抗PSCA單克隆抗體Hal-5.99顯著抑制了皮下植入SCID小鼠的建立的非雄激素依賴性人前列腺癌異種移植物的生長(ρ<0.05)。圖20。PSCAMAbHA1-4.121對建立的雄激素依賴性人前列腺癌異種移植物生長的抑制。將LAPC-9AD腫瘤細胞(2.5XIO6個細胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。當腫瘤體積達到40mm3時，將小鼠隨機分組(各組中的η=10)，按照指示腹膜內(nèi)注射(i.p.)高濃度的HA1-4.121或同種型MAb對照開始治療。每周對動物進行2次治療，總共給藥7次，直至研究的第21天。按照指示每3-4天用測徑儀檢測腫瘤的生長。本研究的結(jié)果顯示Hal-4.121抑制了皮下植入SCID小鼠中的建立的人雄激素依賴性前列腺癌異種移植物的生長。結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上為顯著的是:300μg劑量組第14、17和21天(ρ<0.05，Kruskal-Wallis檢驗，雙尾α=0.05)和700μg劑量組第10、14、17和21天(ρ<0.05，Kruskal-Wallis檢驗，雙尾α=0.05)。圖21。將獲自患者的雄激素依賴性LAPC-9AD腫瘤細胞(2.0XIO6個細胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣。使腫瘤生長約10天，對小鼠進行隨機分組。在植入腫瘤10天后用500μg人HA1-4.117、HA1-4.121或同種型對照開始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體，總共給藥7次。最后一次給藥4天后，處死動物，取出原發(fā)腫瘤并稱重。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Hal-4.121(ρ<0.01)和Hal-4.117(ρ<0.05)顯著抑制了常位(orthotopically)移植入SCID小鼠的LAPC-9AD前列腺癌異種移植物的生長。圖22。PSCAMAbHA1-4.121對帶有已建立的常位人雄激素依賴性前列腺腫瘤的SCID小鼠存活時間的延長。將獲自患者的雄激素依賴性LAPC-9AD腫瘤細胞O.OXIO6個細胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣中。使腫瘤生長約9天，對小鼠進行隨機分組。隨機分入存活組的動物包括同種型MAb對照的11只小鼠和HA1-4.121治療組的12只小鼠。每周2次用1000μgHal-4.121或1000μg同種型MAb對照經(jīng)腹膜內(nèi)對動物進行治療，共給藥9次。結(jié)果顯示HA1-4.121顯著(對數(shù)分級檢驗p<0.01)延長了帶有人雄激素依賴性前列腺腫瘤的SCID小鼠的存活時間。在最后一次治療后110天，HA1-4.121治療組中的2只小鼠保持無可觸知的腫瘤的狀態(tài)。圖23。HA1-4.21和泰索帝(taxotere)聯(lián)合治療對前列腺腫瘤生長抑制作用的增強。將LAPC-9AI腫瘤細胞QXlO6個細胞/動物)皮下注射入雄性SCID小鼠。當腫瘤體積達到65mm3時，按照指示將動物隨機編成4個不同的組(各組中的η=10)。在第0天時開始每周2次以500μg的劑量腹膜內(nèi)給予Hal-4.121或同種型MAb對照，總共給藥6次。在第17天時給予最后一劑。在第0、3和7天時以5mg/kg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)給予泰索帝。每3-4天用測徑儀檢測腫瘤的生長。本研究的結(jié)果顯示與單用對照抗體治療第觀天相比，Hal-4.121作為單用的藥劑對SCID小鼠中非雄激素依賴性前列腺癌異種移植物的生長抑制達45%(ANOVA/Tukey檢驗p<0.05)。與單獨給予對照抗體治療相比，給予同種型MAb對照加上泰索帝對腫瘤生長的抑制達觀％，不具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。與單獨的對照抗體相比，聯(lián)合給予HA1-4.121和泰索帝具有增強的效果并使得腫瘤生長的抑制達到69%(ANOVA/Tukey檢驗:p<0.01)。當將HA1-4.121與泰索帝的聯(lián)合組與HA1-4.121或同種型MAb對照加上泰索帝組相比時，均顯示出了統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(ANOVA/Tukey檢驗p<0.05)。圖Μ。人PSCAMAb在SCID小鼠/人HPAC中對胰腺癌異種移植物生長的抑制。將胰腺癌細胞OxIO6個/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm,Germantown,NY)。將小鼠隨機分組(n=10只動物/組)，于同一天用指定的人PSCA單克隆抗體開始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體(500mg/小鼠)，總共給藥8次。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Hal-4.121,Hal-4.117和Hal-1.16顯著抑制了移植在SCID小鼠皮下的人胰腺癌異種移植物的生長。使用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析(雙尾，α=0.05)。圖25。PSCAMAbΗΑ1-4.121對SCID小鼠常位移植胰腺腫瘤生長的抑制。將HPAC細胞(3.OXIO6個細胞)常位移植入SCID小鼠的胰腺中。按照指示將小鼠隨機分配為3組(每組的η=9)。在移植當天用ΗΑ1-4.12Κ250μg或ΙΟΟΟμg)或同種型MAb對照(IOOOyg)開始治療。每周2次腹膜內(nèi)給予抗體，總共給藥10次。最后一劑13天后，處死動物，取出原發(fā)腫瘤并稱重。本研究的結(jié)果顯示所測試的兩種劑量水平的HA1-4.121均顯著抑制了SCID小鼠中人胰腺癌異種移植物的常位生長。250μg和1000μgAGS-PSCA分別抑制了腫瘤生長達66%和70%(Kruskal-ffallis/Tukey檢驗分別為ρ<0.01和ρ<0.01)。圖26。PSCAMAbΗΑ1-4.121對轉(zhuǎn)移灶的抑制。在尸體解剖中，在對照抗體治療組中觀察到可見的向淋巴結(jié)和遠端器官的轉(zhuǎn)移灶。在兩個ΗΑ1-4.121治療組中均未觀察到可見的轉(zhuǎn)移灶。從所有動物中取出淋巴結(jié)、肺和肝，組織學(xué)檢測移行性腫瘤的存在。用人細胞角蛋白對取自各動物肺和淋巴結(jié)的切片進行染色，顯微鏡下確定轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。組織學(xué)分析結(jié)果顯示用ΗΑ1-4.121治療的動物中的淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移灶顯著減少(p=0.0152，由Fishers精確性檢驗測得)。轉(zhuǎn)移和侵入的發(fā)生率在用兩種濃度HA1-4.121治療的動物中也顯著降低(P=0.0152,Fishers精確性檢驗測得)。僅用1.Omg劑量的HA1-4.121治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著降低(P=0.0498，由Fishers精確性檢驗測得)。圖27。人PSCAMAb在SCID小鼠中對SW780膀胱腫瘤生長的抑制。將人SW780膀胱癌細胞OxIO6個/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm,Germant0Wn，NY)。將小鼠隨機分組(n=10只動物/組)，在同一天用所示的人PSCAMAb開始治療。每周2次腹膜內(nèi)遞送抗體Q50mg/小鼠)，總共給藥7次。結(jié)果顯示HA1-4.117(p=0.014)、HA1-4.37(p=0.0056)、HAl-l.78(ρ=0.001)、Hal_5.99(ρ=0.0002)和ΗΑ1-4.5(ρ=0.0008)顯著抑制了SCID小鼠中皮下植入的SW780膀胱腫瘤的生長。用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析(雙尾，α=0.05)。發(fā)明詳述14章節(jié)概述I.)定義II.)PSCA多核苷酸II.A.)PSCA多核苷酸的用途II.Α.1.)監(jiān)測遺傳異常II.A.2.)反義實例II.A.3.)引物和引物對II.A.4.)分離編碼PSCA的核酸分子II.A.5.)重組核酸分子和宿主-載體系統(tǒng)III.)PSCA相關(guān)蛋白III·A.)帶有基序的蛋白質(zhì)的實例III.B.)PSCA相關(guān)蛋白的表達III.C.)PSCA相關(guān)蛋白的修飾III.D.)PSCA相關(guān)蛋白的用途IV.)PSCA抗體V.)PSCA細胞免疫應(yīng)答VI.)PSCA轉(zhuǎn)基因動物VII.)檢測PSCA的方法VIII.)監(jiān)測PSCA-相關(guān)基因狀態(tài)及其產(chǎn)物的方法IX.)鑒定與PSCA相互作用的分子X.)治療方法和組合物X.A.)抗癌疫苗X.B.)PSCA作為抗體療法的靶標X.C.)PSCA作為細胞免疫應(yīng)答的靶標X.C.1.小基因疫苗X.C.2.CTL肽和輔助肽的組合X.C.3.CTL肽和T細胞引發(fā)劑的組合X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脈沖的DC的疫苗組合物X.D.)過繼免疫治療X.E.)出于治療或預(yù)防目的的疫苗接種XI.)PSCA的診斷和預(yù)后實施方案XII.)抑制PSCA蛋白的功能XII.A.)用胞內(nèi)抗體抑制PSCAXII.B.)用重組蛋白抑制PSCAXII.C.)抑制PSCA轉(zhuǎn)錄或翻譯XII.D.)治療方法的總體考慮XIII.)PSCA調(diào)節(jié)劑的鑒定、特性分析和用途XIV.)RNAi和小干擾RNA的治療用途(siRNAs)XV.)試劑盒/制品的生產(chǎn)I.)定義:除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語、符號以及其它科學(xué)名詞或術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。一些情況下，具有常規(guī)理解的術(shù)語在這里被定義以便澄清和/或用來參考，本文在的這種定義不應(yīng)該被解釋為它與本領(lǐng)域的通常理解的含義有實質(zhì)性區(qū)別。這里描述或引用的許多技術(shù)和方法是容易理解的并且通?？捎删ū绢I(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)方法來進行，例如廣泛采用的在Sambrook等的《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第二版，1989，ColdSpringHarborLaboratoryI^ress，冷泉港，紐約)中所述的分子克隆法。除非另有說明，使用市售試劑盒和試劑的方法宜通常按照制造商規(guī)定的過程和/或參數(shù)進行。術(shù)語“晚期前列腺癌”、“局部晚期前列腺癌”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已經(jīng)擴展突破前列腺包膜的前列腺癌，包括美國泌尿?qū)W會(AUA)系統(tǒng)定義的第C期疾病、Whitmore-Jewett系統(tǒng)定義的第C1-C2期疾病和Μ(腫瘤、結(jié)節(jié)、轉(zhuǎn)移)系統(tǒng)定義的第Τ3-Τ4期及N+期疾病。通常不推薦對局部晚期疾病患者進行手術(shù)，相比臨床局限性(器官局限性)前列腺癌患者，這些患者的手術(shù)結(jié)果基本上都不好。在臨床上可通過前列腺的外側(cè)緣上有可觸及的硬化或前列腺底部不對稱或硬化來確定局部晚期疾病。如果腫瘤侵入或透過前列腺包膜，擴展到手術(shù)邊緣或侵入精囊，局部晚期前列腺癌目前通過根治性前列腺切除術(shù)進行病理學(xué)檢查作出診斷?！案淖兲烊惶腔Ｊ健痹谶@里是指刪除在天然PSCA序列上發(fā)現(xiàn)的一個或多個糖部分(通過除去潛在的糖基化位點或通過化學(xué)和/或酶方法刪除糖基化位點)，和/或加入一個或多個天然PSCA序列中不存在的糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白質(zhì)糖基化的性質(zhì)改變，包括存在的各種糖部分的性質(zhì)和比例的改變。術(shù)語“類似物”是指與另一分子(例如PSCA相關(guān)蛋白)結(jié)構(gòu)類似或共同具有類似或相應(yīng)屬性的分子。例如，PSCA蛋白的類似物可被特異性結(jié)合PSCA的抗體或T細胞特異性結(jié)合。除非另有說明，術(shù)語“抗體”以最廣泛含義使用。因此，“抗體”可以是天然產(chǎn)生的或人造的，如通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)制造的單克隆抗體。抗-PSCA抗體包括單克隆和多克隆抗體，以及含有這些抗體的抗原結(jié)合域和/或一個或多個互補決定區(qū)的片段。本文所用的術(shù)語"抗體"是指特異性結(jié)合PSCA和/或具有所需生物活性的任何形式的抗體或其片段，該定義具體覆蓋了單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們特異性結(jié)合PSCA和/或顯示所需生物活性。本文所提供的方法和組合物中可使用任何特異性抗體。因此，在一個實施方式中，術(shù)語“抗體”包括如下的分子該分子包含相互結(jié)合的輕鏈免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)和重鏈分子的至少一個可變區(qū)，以形成對靶抗原的特異性結(jié)合位點。在一個實施方式中，所述抗體是IgG抗體。例如，所述抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。用于本發(fā)明方法和組合物的抗體可在細胞培養(yǎng)物、噬菌體或各種動物中產(chǎn)生，所述的動物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴、猩猩、猿。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體是哺乳動物抗體。可采用噬菌體技術(shù)分離原始的抗體或產(chǎn)生具有改變的特異性或親和力特性的變體。這些技術(shù)是常規(guī)的，且在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在一個實施方式中，所述抗體是采用本領(lǐng)域已知的重組方法產(chǎn)生的。例如，可通過用包含編碼抗體的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染宿主細胞來產(chǎn)生重組抗體?？捎靡环N或多種載體在宿主細胞中轉(zhuǎn)染表達至少一個VL和一個VH區(qū)的DNA序列?？贵w發(fā)生和生產(chǎn)重組方法的示例性描述包括Delves，ANTIBODIESPRODUCTION=ESSENTIALTECHNIQUES(Wiley,1997)；ShephardMONOCLONALANTIBODIES(OxfordUniversityPress,2000)；Goding,MONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDPRACTICE(AcademicPress,1993)；CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(JohnWiley&Sons，最近的版本)?？赏ㄟ^重組方法來修飾本發(fā)明的抗體，從而提高該抗體在介導(dǎo)所需功能中的更大效應(yīng)。因此，采用重組方法通過取代來修飾本發(fā)明的抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，所述取代是保守取代。例如，可用不同的殘基取代抗體恒定區(qū)中的至少一個氨基酸。參見，例如美國專利5，624，821、美國專利6，194，551、專利申請WO9958572；以及Angal等，Mol.Immunol.30:105-08(1993)。對氨基酸的修飾包括氨基酸的缺失、插入、取代。在某些情況下，進行這些變化是為了減少不良活性，例如，補體依賴性細胞毒性。經(jīng)常性將抗體與提供可檢測信號的底物共價或非共價連接。已知很多種類的標記和連接技術(shù)，科技和專利文獻對它們作了廣泛的報道。可篩選這些抗體以用于結(jié)合正?；蛴腥毕莸腜SCA。參見例如，ANTIBODYENGINEERING:APRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress,1996)。可通過以下體外分析法來識別具有所需生物活性的適宜抗體，這些分析法包括但不限于增殖、遷移、黏附、軟瓊脂生長、血管生成、細胞-細胞通訊、凋亡、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及以下體內(nèi)分析法，例如腫瘤生長抑制。本文提供的抗體還可用于診斷用途。作為捕獲或非中和抗體，可對它們結(jié)合特異性抗原而不抑制受體結(jié)合或該抗原的生物活性的能力進行篩選。作為中和抗體，所述抗體可用于競爭性結(jié)合分析。它們還可用于PSCA或其受體的定量?！翱贵w片段”被定義為與其靶分子結(jié)合的免疫球蛋白分子的至少部分可變區(qū)，即抗原結(jié)合區(qū)。在一個實施方案中，它特別包括單個抗-PSCA抗體及其克隆(包括激動、拮抗和中和抗體)和具有多表位特異性的抗-PSCA抗體組合物。本文的方法和組合物中的抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體?？贵w可為抗原結(jié)合抗體片段，所述抗體片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈可變區(qū)等。可采用本領(lǐng)域熟知的方法來產(chǎn)生完整分子的片段，包括酶消化和重組方法。如本文所用，可使用任何形式的“抗原”來產(chǎn)生對PSCA特異性的抗體。因此，引發(fā)性抗原(elicitingantibody)可為單抗原表位、多抗原表位或單獨使用或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強劑聯(lián)用的全蛋白。該引發(fā)性抗原可為分離的全長蛋白質(zhì)、細胞表面蛋白(例如，用抗原的至少一部分轉(zhuǎn)染的細胞來進行免疫)或可溶性蛋白(例如，僅用蛋白質(zhì)胞外區(qū)部分免疫)。可在遺傳工程化改造的細胞中產(chǎn)生所述抗原。編碼該抗原的DNA可為基因組的或非基因的(例如，cDNA)和編碼至少部分胞外區(qū)。本文所用的術(shù)語“部分”是指用于構(gòu)建感興趣抗原的免疫原性抗原表位的恰如其分的最少數(shù)量氨基酸或核酸?？刹捎眠m于轉(zhuǎn)化感興趣細胞的任何遺傳載體，包括但不限于腺病毒載體、質(zhì)粒和非病毒載體，例如陽離子脂質(zhì)體。在一個實施方式中，本文的方法和組合物中的抗體特異性結(jié)合感興趣PSCA胞外區(qū)的至少一部分。本文提供的抗體或抗原及其結(jié)合片段可結(jié)合于“生物活性劑”。本文所用的術(shù)語“生物活性劑”是指結(jié)合抗原和/或促進或介導(dǎo)所需生物學(xué)效應(yīng)以增強細胞殺傷毒性的任何合成或天然存在的化合物。在一個實施方式中，用于本發(fā)明的結(jié)合片段是生物學(xué)活性片段。本文所用的術(shù)語“生物學(xué)活性”是指能結(jié)合所需抗原表位和直接或間接賦予生物效應(yīng)的抗體或抗體片段。直接作用包括但不限于調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制生長信號，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制抗凋亡信號，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制凋亡或壞死信號，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制ADCC級聯(lián)反應(yīng)，和調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制CDC級聯(lián)反應(yīng)。在本發(fā)明的方法和組合物中還可使用“雙特異性”抗體。本文所用的術(shù)語“雙特異性抗體”是指對至少兩種不同的抗原表位具有結(jié)合特異性的抗體，通常為單克隆抗體。在一個實施方式中，所述表位來自同一抗原。在另一實施方式中，所述表位來自兩個不同的抗原。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可通過使兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對共表達的方法來產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如，Milstein等，Nature305537-39(1983)。或者，可用化學(xué)連接法制備雙特異性抗體。參見，例如，Brerman等，Science229:81(1985)。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A。90:6444-48(1993)，Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。本文的單克隆抗體具體包括"嵌合"抗體以及該抗體的片段，只要它們特異性結(jié)合靶抗原和/或具有所需的生物活性，該嵌合抗體中的部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w家族或亞家族的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分則與衍生自另一特定物種或?qū)儆诹硪豢贵w家族或亞家族的抗體的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4，816，567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。術(shù)語“化療劑”是指所有有效抑制腫瘤生長的化學(xué)化合物?；焺┑姆窍拗菩岳影ㄍ榛瘎绲?、氮丙啶化合物和烷基磺酸酯；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長春花屬生物堿和鬼白毒素衍生物、細胞毒性抗生素、破壞或干擾DNA表達的化合物、以及生長因子受體拮抗劑。此外，化療劑包括細胞毒劑(如本文所定義)、抗體、生物分子和小分子。術(shù)語“密碼子優(yōu)化序列”是指通過置換在特定種類宿主中使用頻率低于約20%的密碼子而優(yōu)化的核苷酸序列。除密碼子最優(yōu)化之外，通過去除假聚腺苷化序列、去除外顯子/內(nèi)含子剪接信號、去除轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列和/或優(yōu)化GC含量而最優(yōu)化在給定的宿主中的表達的核苷酸序列在這里被稱為“表達增強序列”?！敖M合文庫”是通過化學(xué)合成或生物合成將許多化學(xué)“構(gòu)件”(如試劑)組合而產(chǎn)生的不同化合物的集合。例如，線性組合化學(xué)文庫，如多肽(如突變蛋白)文庫，是用所有可能的方法將一組叫做氨基酸的化學(xué)構(gòu)件組合成給定的化合物長度(即多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)而形成的。大多數(shù)化合物是通過這種化學(xué)構(gòu)件的組合混合合成的(fellop等，J.Med.Chem.37(9)1233-1251(1994))。組合文庫的制備和篩選是精通精通本領(lǐng)域是技術(shù)人員熟知的。這種組合化學(xué)文庫包括但不限于，肽文庫(見例如美國專利第5，010，175號，F(xiàn)urka,Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)，Houghton等，Nature，；354:84-88(1991))、類肽(PCT公布WO91/19735),編碼肽(PCT公布WO93/20242)、隨機生物寡聚物(PCT公布WO92/00091)、苯并二氮雜罩(美國專利號5，沘8，514)、diversomers如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮雜革和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:6909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))，具有β-D-葡萄糖支架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992))、小化合物的類似有機綜合體文庫(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、oligocarbamate(Cho等，Science2611303(1993))，和/或肽酰膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59:658(1994))。通?？梢奊ordon等，J.Med.Chem.37:1385(1994)，核酸文庫(見例如Stratagene,Corp.)、肽核酸文庫(見例如美國專利5，539，083)、抗體文庫(見例如Vaughn等，NatureBiotechnology14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖類文庫(見例如Liang等，Science2741520-1522(1996)和美國專利號5，593，853)，以及小有機分子文庫(見例如苯并二氮雜萆，Baum,C&EN，1-18，第33頁(1993)；類異戊二烯，美國專利號5，569，588；噻唑烷酮(thiazolidinone)和間噻嗪烷酮(metathiazanone)，美國專利號5，549，974；吡咯烷，美國專利號5，525，735和5，519，134；嗎啉代化合物，美國專利號5，506，337；苯并二氮雜革，美國專利號5，288,514；等等)。制備組合文庫的裝置可通過商業(yè)獲得(見例如;357NIPS，390NIPS，AdvancedChemTech,LouisvilleKY；Symphony,Rainin,ffoburn,MA；433A,AppliedBiosystems,FosterCity,CA;9050，？1118，1^11丨？0儀，86(^0『(1力認)。還開發(fā)了許多熟知的機器系統(tǒng)來解決相化學(xué)(phasechemistry)問題。這些系統(tǒng)包括自動工作站,如TakedaChemicalIndustries,LTD.(日本大阪)開發(fā)出的自動合成儀，以及采用模擬化學(xué)家手工合成操作的機器臂的機器系統(tǒng)(ZymateH，ZymarkCorporation,Hopkinton,Mass.；Orca,Hewlett-Packard,PaloAlto，Calif.)。上述任何裝置都適用于本發(fā)明。對精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，改進這些裝置(如果需要的話)的特性和運行方式使它們能夠按本文所述進行運作。此外，許多組合文庫自身可通過商業(yè)獲得(見例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex,Moscow,RU；Tripos,Inc.,St.Louis,MO；ChemStar,Ltd,Moscow,RU；3DPharmaceuticals,Exton,PA；MartekBiosciences,Columbia,MD；等等)。本文所用的術(shù)語“保守取代”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸取代，且進行該取代通常不會改變所得分子的生物活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認識到通常在多肽非必需區(qū)中的單個氨基酸取代不會實質(zhì)性改變生物活性(參見例如，Watson等，MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE,TheBenjamin/CummingsPub.Co.，第224頁(第4版，1987))。優(yōu)選按照表III(a-b)中所述進行這些示例性取代。例如，這些改變可包括用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)取代其它這些疏水性氨基酸；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷胺酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，反之亦然。其它取代也可被認為是保守性的，這取決于具體氨基酸所處的環(huán)境和它在該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)?？苫Q，就如丙氨酸(A)和纈氨酸(V)也可互換。相對疏水的甲硫氨酸(M)?？膳c亮氨酸和異亮氨酸互換，有時也可與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)在氨基酸殘基的顯著特征為其電荷且這兩種氨基酸殘基的差異PK并不顯著的位置上?？苫Q。在特定的環(huán)境下還有可被認為是“保守性”的其它變化(參見例如本文的表III(a)；"Biochemistry”第2版第13-15頁。LubertStryer編(StanfordUniversity)；Henikoff等，PNAS1992，卷89，10915-10919;Lei等，JBiolCheml995五月19；270(20):11882-6)。其它取代也是被允許的，并可憑經(jīng)驗或根據(jù)已知的保守取代決定。術(shù)語“細胞毒劑”是指抑制或阻止細胞表達活性、細胞功能和/或造成細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語包括放射性同位素化學(xué)治療劑，以及毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。細胞毒劑的例子包括但不限于金他汀(auristatin)、金霉素、美登醇(maytansinoid)、釔、鉍、篦麻毒素、篦麻毒素A-鏈、康勒他丁(combrestatin)、朵卡霉素(duocarmycin)、多羅他汀(dolostatins)、阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、順鉬、ccl065、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、鬼白噻吩甙、長春新堿、長春堿、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、白樹毒素、米托潔林、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、酚霉素、居里菌素(curicin)、巴豆毒素、刺孢霉素、Sapaonariaofficinalis抑制劑以及糖皮質(zhì)激素和其它化學(xué)治療劑，以及放射性同位素，如At211、1131、1125、丫90、1^186、1^188、5111153、81212或213、卩32和Lu的放射性同位素，包括Lul77。抗體也可與能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)化成其活性形式的抗癌前藥活化酶偶聯(lián)。本文所用的術(shù)語"雙體"是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中連接于輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)。通過使用短至不能使同一鏈中兩個區(qū)域間配對的接頭，所述區(qū)域被迫與另一鏈中的互補區(qū)域配對，并產(chǎn)生了兩個抗原結(jié)合位點。雙體在以下文獻中有更全面的描述例如，歐洲專利404，097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.ki.USA90:6444-48(1993)?！盎虍a(chǎn)物”在本文中是指肽/蛋白質(zhì)或mRNA。例如，“本發(fā)明的基因產(chǎn)物”在本文中有時是指"癌的氨基酸序列"、“癌蛋白"、“表I所列癌的蛋白質(zhì)”、“癌的mRNA"、“表I所列癌的mRNA”等等。在一個實施方案中，癌蛋白由圖1的核酸編碼。所述癌蛋白可以是片段，或者可以是由圖1的核酸編碼的全長蛋白質(zhì)的片段。在一個實施方案中，癌氨基酸序列被用來確定序列的相同性或類似性。另一實施方案中，該序列是由圖1的核酸編碼的天然存在蛋白質(zhì)的等位變體。另一實施方案中，該序列是本文進一步描述的序列變體。在本發(fā)明的方法和組合物中可使用“異源偶聯(lián)”抗體。本文所用的術(shù)語“異源偶聯(lián)抗體”是指兩個共價連接的抗體?？捎煤铣傻鞍踪|(zhì)化學(xué)中已知的方法來制備這些抗體，包括使用交聯(lián)劑。參見例如，美國專利4，676，980。用來測定特定核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在、不存在、定量或其它性質(zhì)的“高通量篩選”試驗是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。類似地，結(jié)合試驗和報告基因試驗也是熟知的。因此，例如美國專利號5，559，410揭示了蛋白質(zhì)的高通量篩選法；美國專利號5，585，639揭示了檢測核酸結(jié)合的高通量篩選法(即用陣列檢測)；而美國專利號5，576，220和5，541,061揭示了檢測配體/抗體結(jié)合的高通量篩選法。此外，高通量篩選系統(tǒng)可通過商業(yè)獲得(見例如AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；ZymarkCorp.,Hopkinton,MA；AirTechnicalIndustries,Mentor,OH；BeckmanInstruments,Inc.Fullerton,CA；PrecisionSystems,Inc.,Natick,MA；等等)。這些系統(tǒng)通常自動完成全部過程，包括所有樣品和試劑的吸取、液體分配、定時培育以及最后在適合檢測的檢測器上閱讀微板。這些可配制系統(tǒng)提供高通量并能快速啟動，并且是高度靈活和客戶定制。這種系統(tǒng)的制造商提供了各種高通量系統(tǒng)的詳細方案說明。因此，例如ZymarkCorp.提供了描述用來檢測對基因轉(zhuǎn)錄、配體結(jié)合等進行調(diào)節(jié)的篩選系統(tǒng)的技術(shù)說明小冊子。術(shù)語“同系物”是指通過例如在相應(yīng)位置具有化學(xué)性質(zhì)相同或類似的殘基的序列而顯示與另一分子同源的分子。在一個實施方式中，本文提供的抗體是“人抗體”。本文所用的術(shù)語“人抗體”是指輕鏈和重鏈序列(包括互補決定區(qū)(CDR))的整個序列基本上都來自人基因的抗體。在一個實施方式中，通過三源雜交瘤技術(shù)、人B細胞技術(shù)(參見例如，Kozbor等，Immunol.Today4:72(1983))，EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)(參見例如，Cole等，MONOCLONALANTIBODYANDCANCERTHERAPY77-96(1985))或使用噬菌體展示(參見例如，Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))制備人單克隆抗體。在某一具體的實施方式中，所述人抗體在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。制備這些部分人抗體至全長人抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，任何此類技術(shù)均可使用。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，在經(jīng)工程化改造以表達人重鏈和輕鏈抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備全長人抗體序列。制備轉(zhuǎn)基因小鼠的一個示例性描述見專利申請WO02/43478和美國專利6，657，103(Abgenix)及其后續(xù)申請。然后可融合轉(zhuǎn)基因小鼠來源的、能產(chǎn)生所需抗體的B細胞以制備連續(xù)產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系。參見例如，美國專利5，569，825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；和5，545，806；以RJakobovits,Adv.DrugDel.Rev.31:33-42(1998)；Green等，J.Exp.Med.188:483-95(1998)。“人白細胞抗原”或“HLA”是人I型或II型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)蛋白(參見例如，Stites等，IMMUNOLOGY，第8版，LangePublishing,LosAltos,CA(1994)。本文所用的術(shù)語"人源化抗體"是指含有來自非人(例如，小鼠和人抗體)的抗體序列的抗體形式。這些抗體是含有源自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗體。通常，所述人源化抗體會包含至少一個和通常兩個可變區(qū)的基本上全部，在這些可變區(qū)中對應(yīng)于那些非人免疫球蛋白的全部或基本上全部超變環(huán)和全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白序列中的那些。所述人源化抗體還會任選地包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少部分，所述Fc通常為人免疫球蛋白的Fe。參見例如，Cabilly的美國專利4，816，567；Queen^(1989)Proc.Nat'1Acad.Sci.USA86:10029-10033;和ANTIBODYENGINEERING:APRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress1996)。術(shù)語“雜交”等用于多核苷酸時是指常規(guī)雜交條件，優(yōu)選例如在50%甲酰胺/6XSSC/0.1%SDS/100mg/mlssDNA中雜交，其中，雜交溫度高于37°C，同時用0.1XSSC/0.1%SDS洗滌的溫度高于550C。短語"分離的"或"生物純的"是指基本上或完全不含在天然狀態(tài)時通常所伴隨物質(zhì)的成分。因此，本發(fā)明所述的分離的肽優(yōu)選不含在天然環(huán)境中通常伴隨該肽的物質(zhì)。例如，一種多核苷酸當與PSCA基因之外的基團或編碼PSCA基因產(chǎn)物或其片段之外的多肽的基因相對應(yīng)或互補的污染性多核苷酸基本分離時則稱為是“分離的”。熟練的技術(shù)人員可方便地采用核酸分離方法來獲得分離的PSCA多核苷酸。例如，當采用物理、機械或化學(xué)方法除去細胞成分中PSCA蛋白中通常伴隨的蛋白質(zhì)，則稱為PSCA蛋白是“分離的”。熟練的技術(shù)人員可方便地采用標準純化方法以獲得分離的PSCA蛋白?；蛘呖赏ㄟ^化學(xué)方法制備分離的蛋白質(zhì)。適宜的“標記”包括放射性核素、酶、底物、輔助因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。教述這些標記的使用的專利包括美國專利3，817，837；3,850，752；3，939，350；3,996，345；4,277，437；4,275，149；和4，366，241。此外，本文提供的抗體可用作熒光體的抗原結(jié)合成分。參見例如，Zeytun等，Nat.Biotechnol.21:1473-79(2003)。術(shù)語“哺乳動物”是指任何分類為哺乳動物的生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、21馬和人。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述哺乳動物是小鼠。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述哺乳動物是人。術(shù)語“轉(zhuǎn)移性前列腺癌”和“轉(zhuǎn)移性疾病”指已經(jīng)擴散到局部淋巴結(jié)或擴散到遠處部位的前列腺癌，包括AUA系統(tǒng)的第D期疾病和Μ系統(tǒng)的第TxNxM+期疾病。對于局部晚期前列腺癌病例，通常不對轉(zhuǎn)移性疾病患者進行手術(shù)，而激素(雄激素消融)療法是優(yōu)選的治療方法。轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者最終會在治療開始后的12-18個月內(nèi)發(fā)展成雄激素難治狀態(tài)。這些雄激素難治患者中幾乎有半數(shù)會在發(fā)展到這一階段后6個月內(nèi)死亡。前列腺癌轉(zhuǎn)移的最常見部位是骨。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移通常是成骨性而不是溶骨性(即導(dǎo)致凈骨形成)。骨轉(zhuǎn)移最常見在脊柱中，然后是股骨、骨盤，肋架，顱骨和肱骨。其它常見轉(zhuǎn)移部位包括淋巴結(jié)、肺、肝和腦。轉(zhuǎn)移性前列腺癌通常通過手術(shù)切開或腹腔鏡盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)、全身放射性核素掃描、骨骼X線照相術(shù)和/或骨病灶活組織檢查來診斷。術(shù)語"調(diào)節(jié)劑"或"檢測化合物"或"藥物候選物"或語法上的等價表述在這里描述將被檢測以了解直接或間接改變癌的表型或癌序列(例如核酸或蛋白質(zhì)序列)的表達的能力，或癌序列的效應(yīng)(例如產(chǎn)生信號、基因表達、蛋白質(zhì)相互作用等)的任何分子，例如蛋白質(zhì)、寡肽、小有機分子、多糖、多核苷酸等。一方面，調(diào)節(jié)劑將中和本發(fā)明的癌蛋白的效應(yīng)?！爸泻?是指蛋白質(zhì)的活性以及隨后對細胞的效應(yīng)被抑制或阻遏。在另一方面，調(diào)節(jié)劑使所述蛋白質(zhì)水平正?；芍泻捅景l(fā)明的基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的功效。在優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)劑改變表達特征，或這里提供的核酸或蛋白質(zhì)的表達特征，或改變下游效應(yīng)子途徑。在一個實施方案中，所述調(diào)節(jié)劑抑制癌癥表型，例如正常組織指紋。另一實施方案中，調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)癌癥表型。通常用不同的試劑濃度平行進行檢測多個混合物以獲得對不同濃度的差異應(yīng)答反應(yīng)。通常，將這些濃度之一即零濃度或低于檢測水平的濃度作為陰性對照。調(diào)節(jié)劑、候選藥物或檢測化合物包括多種類別的化學(xué)試劑，但它們通常是有機分子，優(yōu)選分子量大于100小于約2，500道爾頓的小有機化合物。優(yōu)選的小分子小于2000，或小于1500，或小于1000，或小于500D。候選試劑包含在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)相互作用必需的官能團，具體說是氫鍵，且通常包含至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個化學(xué)官能團。所述候選試劑通常包含碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個或多個上述官能團取代的芳香性結(jié)構(gòu)或芳香性聚合結(jié)構(gòu)。調(diào)節(jié)劑還包括以下生物分子，如肽類、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。特別優(yōu)選的是肽。一種類別的調(diào)節(jié)劑是肽，例如含有約5-35個氨基酸，優(yōu)選含有約20個氨基酸，更優(yōu)選含有約7-15個氨基酸的肽。優(yōu)選癌癥調(diào)節(jié)蛋白是可溶的，包括一個非跨膜區(qū)和/或一個N-末端Cys以助溶解。在一個實施方案中，片段的C-末端被保留作為游離酸同時N-末端是游離的胺以助偶合，即與半胱氨酸偶合。在一個實施方案中，本發(fā)明的癌蛋白與這里所述的免疫原性劑綴合。在一個實施方案中，所述癌蛋白與BSA綴合。本發(fā)明的肽，例如優(yōu)選長度的肽，可相互結(jié)合或與其它氨基酸結(jié)合以形成較長的肽/蛋白質(zhì)。這種調(diào)節(jié)肽可被消化成天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如上文所述)、隨機肽或“偏置(biased)”隨機肽。在一優(yōu)選的實施方案中，基于肽/蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑是這里定義的抗體及其片段。癌癥的調(diào)節(jié)劑也可以是核酸。核酸調(diào)節(jié)劑可以是天然產(chǎn)生的核酸、隨機核酸或"偏置"隨機核酸。例如，原核或真核基因組的消化產(chǎn)物可用于上述蛋白質(zhì)的相應(yīng)類似物中。本文中術(shù)語“單克隆抗體”指獲自一群基本上均質(zhì)性抗體的抗體，即包含一群相同的抗體但可能存在少量天然產(chǎn)生的突變體的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，其直接針對單一抗原表位。相反，常規(guī)(多克隆)抗體制劑通常包括針對(或特異性針對)不同表位的多種抗體。在一個實施方式中，所述多克隆抗體多個單克隆抗體，它們具有對含有多個抗原表位的單個抗原具有不同表位特異性、親和力或親合力。修飾語"單克隆的"是指所述抗體的性狀是獲自基本上同源的抗體群，且不是解釋為需要通過任何特殊的方法來產(chǎn)生該抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可采用由Kohler等，Nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)來制備，或可通過重組DNA方法(參見例如，美國專利4，816，567)來制備。也可采用例如Clackson等，Nature352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)所描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離出"單克隆抗體"。這些單克隆抗體通常以至少約IyMWKd結(jié)合，更通常至少約為300nM，通常至少約為30nM，優(yōu)選至少約為ΙΟηΜ，更優(yōu)選至少約為3nM或更佳，通常通過ELISA測定?！盎颉保鏟SCA相關(guān)蛋白的生物學(xué)基序中指組成蛋白質(zhì)一級序列一部分的任何氨基酸模式，該模式與某具體功能(例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用等)或修飾(例如磷酸化、糖基化或酰胺化修飾)、或定位(例如分泌序列、核定位序列等)或與產(chǎn)生體液或細胞免疫性相關(guān)的序列有關(guān)?；蚩梢允桥B的或能夠排列成通常與某種功能或特性有關(guān)的某種位置。在HLA基序中，“基序"是指確定長度的肽中殘基的模式，對I類HLA基序而言通常是約8-13個氨基酸的肽，對II類HLA基序而言通常是約6_25個氨基酸的肽，它可被特定的HLA分子識別。由各自的人HLA等位基因編碼的各個蛋白質(zhì)的結(jié)合HLA的肽基序通常不同，且主要(primary)和次要(secondary)錨定殘基的模式也不同。常見的基序列于表V中。“藥用賦形劑”包括佐劑、載體、pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑、防腐劑等物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的”是指無毒的、惰性的和/或與人或其它哺乳動物生理上相容的組合物。術(shù)語“多核苷酸”表示長度至少為10個堿基或堿基對的核糖核苷酸或脫氧核苷或修飾形式的兩種核苷酸類型的聚合形式，指包括DNA和/或RNA的單鏈和雙鏈形式。在本領(lǐng)域中，該術(shù)語通常與“寡核苷酸”互換使用。多核苷酸可包括這里揭示的核苷酸序列，如圖1所示，其中的胸腺嘧啶(T)也可以是尿嘧啶(U)；這種定義涉及DNA和RNA化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別，具體地說，RNA中四個主要堿基之一是尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T)。術(shù)語“多肽”表示至少約4、5、6、7或8個氨基酸的聚合物。在該說明書中使用氨基酸的標準三字母或單字母符號。在本領(lǐng)域中，該術(shù)語通常與“肽”或“蛋白質(zhì)”互換使用。HLA“主要錨定殘基(primaryanchorresidue)”是沿肽序列特定位置上的一個氨基酸認為其能夠提供免疫原性肽和HLA分子之間的接觸點。確定長度的肽內(nèi)1-3個，通常是2個主要錨定殘基限定了免疫原性肽的一個“基序”。這些殘基被認為適合與HLA分子的結(jié)合溝緊密接觸，同時將它們的側(cè)鏈插入結(jié)合溝的特定口袋中。例如，在一個實施方案中，HLAI類分子的主要錨定殘基位于位置2(從氨基末端位置算起)并位于本發(fā)明所述肽表位羧基末端第8、9、10、11或12殘基位置上?；蛘?，另一實施方案中，結(jié)合HLAII類分子的肽的主要錨定殘基相互間隔而不是在肽的末端，這里的肽的長度通常至少有9個氨基酸。各個基序和超基序(supermotif)的主要錨位置列于表IV(a)。例如，可通過改變表IV所示主要和/或次要錨位置中的特定殘基的存在或缺失來產(chǎn)生類似物肽。這種類似物被用來調(diào)節(jié)包含特定HLA基序或超基序的肽的結(jié)合親和力和/或細胞群覆蓋(populationcoverage)范圍?！胺派湫酝凰亍卑ǖ幌抻谝韵逻@些(在表IV(I))中還列出了非限制性的示范用途)?！半S機"或語法等價表述在這里用于核酸和蛋白質(zhì)，表示每種核酸和肽分別都由基本上隨機(連接)的核苷酸和氨基酸構(gòu)成。這些隨機肽(或這里討論的核酸)可在任何位置摻入任何核苷酸或氨基酸?？稍O(shè)計合成方法來產(chǎn)生隨機蛋白質(zhì)或核酸，以在序列長度上形成所有或大多數(shù)可能的組合，從而形成隨機的候選生物活性蛋白質(zhì)試劑文庫。在一個實施方案中，文庫是“完全隨機化的”，在任何位置都沒有優(yōu)選序列或恒定的序列。另一實施方案中，文庫是“偏置隨機”文庫。即序列中的一些位置或保持恒定，要么選自數(shù)目有限的可能殘基。例如，核苷酸或氨基酸殘基可在規(guī)定的類別(例如疏水性氨基酸、親水性殘基，空間偏置(小的或大的)殘基)中隨機選擇以形成核酸結(jié)合域，形成交聯(lián)用的半胱氨酸，SH-3結(jié)構(gòu)域用的脯氨酸，磷酸化位點等用的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸，或者對于嘌呤等亦是如此。“重組體”DNA或RNA分子是在體外制作的DNA或RNA分子。本文所用的術(shù)語丨'單鏈Fv丨'或丨'scFv丨'或“單鏈”抗體是指包含抗體VH和VL區(qū)的抗體片段，其中這些區(qū)域是存在于一個多肽鏈中的。通常，F(xiàn)v多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，該接頭使得所述sFv可形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于sFv而言，可參見Pluckthun,THEPHARMACOLOGYOFMONOCLONALANTIBODY，卷113，Rosenburg和Moore編Springer-Verlag,NewYork，第269—315頁(1994)?！靶》肿印钡姆窍拗菩岳影ㄅcPSCA結(jié)合或相互作用的化合物、配體(包括激素類、神經(jīng)肽類、趨化因子、添味劑、磷脂以及結(jié)合并優(yōu)選抑制PSCA蛋白功能的其功能等價物)。這種非限制性小分子的分子量宜小于約約IOkDa,更優(yōu)選小于約9、約8、約7、約6、約5或約4kDa。在某些實施方案中，小分子能物理性與PSCA蛋白締合或結(jié)合PSCA蛋白；未在天然產(chǎn)生的代謝途徑中被發(fā)現(xiàn)；和/或相比非水性溶液更易溶于水溶液。本文所用的術(shù)語“特異性”是指抗體對靶抗原表位的選擇性結(jié)合?？稍诮o定的條件下，將抗體和適宜抗原的結(jié)合與抗體和無關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合相比，來測試抗體的結(jié)合特異性。如果所述抗體與適宜抗原的結(jié)合至少比其與無關(guān)抗原或抗原混合物結(jié)合高出2、5、7和更優(yōu)選10倍，則認為其是特異性的。在一個實施方式中，特異性抗體是一種僅結(jié)合PSCA抗原而不結(jié)合無關(guān)抗原的抗體。在另一實施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原但不與該PSCA抗原具有結(jié)合70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,97^^98^^99%或更多氨基酸同源性的非人PSCA抗原結(jié)合的抗體。在另一實施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原和結(jié)合小鼠PSCA抗原、但與人抗原結(jié)合程度更高的抗體。在另一實施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原和結(jié)合靈長類PSCA抗原、但與人抗原結(jié)合程度更高的抗體。在另一實施方式中，所述特異性抗體結(jié)合人PSCA抗原和任何非人PSCA抗原但與人抗原或其任何組合結(jié)合程度更高的抗體。雜交反應(yīng)的“嚴格性”易由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來確定，且通?？筛鶕?jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑借經(jīng)驗來計算。通常，探針越長，合適退火需要的溫度越高，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于當互補鏈存在于低于解鏈溫度的環(huán)境下時變性的核酸序列重退火的能力。探針和可雜交序列之間所需同源性程度越高則可使用相對較高的溫度。其結(jié)果是，相對較高的溫度使反應(yīng)條件越嚴格，而溫度越低則反應(yīng)條件的嚴格度越低。雜交反應(yīng)嚴格性的其它細節(jié)解釋可見Ausubel等，《分子生物學(xué)最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),WileyIntersciencePublishers，(1995)。本文定義的“嚴格條件”或“高嚴格條件”可通過以下特征來鑒定，但不限于此，它們是(1)洗滌時采用低離子強度和高溫，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，溫度為50°C;(2)雜交過程中使用甲酰胺等變性劑，例如50%(ν/ν)甲酰胺和0.牛血清白蛋白/0.Ficoll/0.聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，溫度為42°C;或⑶使用50%甲酰胺、5χSSC(0.75ΜNaCl,0.075Μ檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.焦磷酸鈉、切登哈特溶液、超聲處理的鮭精DNA(50mg/ml)、0.SDS和10%硫酸葡聚糖，溫度為42°C，42°C用0.2χSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌并在用50%甲酰胺洗滌，然后用在55°C用含有EDTA的0.1χSSC以高嚴格性洗滌。“中等嚴格條件"描述在，但不限于，Sambrook等在《分子克隆實驗手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:CoIdSpringHarborPress，1989)中的描述，并且包括使用嚴格程度低于上述條件的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和％SDS)。中等嚴格條件的一個例子是在65°C在含有以下成分的溶液中培養(yǎng)一夜牛血清、0.5%磷酸鈉pH7.5、1.25mMEDTA禾口7%SDS5XSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，然后在約50°C用2XSSC/SDS和在50°C用0.2XSSC/0.1%SDS洗滌濾膜。熟練的技術(shù)人員將了解如何調(diào)節(jié)溫度、離子強度等以適應(yīng)探針長度等因素。HLA“超基序”是由兩個或多個HLA等位基因編碼的HLA分子共享的肽結(jié)合特異性。不同種族人群中HLA-超型的所有表型頻率列于表IV(f)。各種超型(supertype)的非限制性組成如下A2:A*0201，A*0202，A*0203，A*0204，A*0205，A*0206，A祁802，A祁901，A*0207A3:A3,All,A31,A*3301，A祁801，A*0301，A*1101，A*3101B7:B7,B*3501_03，B*51，B*5301，B*5401，B*5501，B*5502，B*5601，B*6701，B*7801，B*0702，B*5101，B*5602B44:B*3701，B*4402，B*4403，B*60(B*4001)，B61(B*4006)Al:A*0102，A*2604，A*3601，A*4301，A*8001A24:A*24,A*30,A*2403,A*2404,A*3002,A*3003B27:B*1401-02，B*1503，B*1509，B*1510，B*1518，B*3801_02，B*3901，B*3902，B氺3903-04，B氺4801-02，B*7301，B*2701_08B58:B*1516，B*1517，B*5701，B*5702，B58B62:B*4601，B52,B*1501(B62)，B*1502(B75)，B*1513(B77)不同HLA-超型組合計算出的人群覆蓋率列于表IV(g)中?！爸委煛被颉爸委煹摹币约罢Z法上相關(guān)的術(shù)語在本文中是指對任何疾病后果的任何改善，如存活時間延長、發(fā)病率降低和/或副作用減輕，這些是更換治療模式的副產(chǎn)品；在本領(lǐng)域中很容易理解，雖然不要求完全根治疾病，但能完全根除疾病則是優(yōu)選的結(jié)果。“轉(zhuǎn)基因動物”(例如小鼠或大鼠)是具有含有轉(zhuǎn)基因的細胞的動物，所述轉(zhuǎn)基因被引入動物或在出生前(例如胚胎階段)被引入動物的祖先。“轉(zhuǎn)基因”是被整合入細胞的基因組內(nèi)的DNA，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。HLA或細胞免疫應(yīng)答“疫苗”在這里表示含有或編碼一種或多種本發(fā)明的肽的組合物。有許多此類疫苗的實例，如一種或多種肽的混合物；多表位(poly印itopic)肽所含的一種或多種本發(fā)明的肽；或編碼這種單獨的肽或多肽的核酸，例如編碼多表位肽的小基因?！耙环N或多種肽”可包含1-150或更多中的任何整數(shù)，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150或更多本發(fā)明的肽。所述肽或多肽可任選被修飾，如通過脂化、加入靶序列或其它序列。本發(fā)明的HLAI類肽可與HLAII類肽混合或連接以易于活化細胞毒T淋巴細胞和輔助T淋巴細胞的活化。HLA疫苗可包含肽-脈沖的抗原呈遞細胞，例如樹突細胞。術(shù)語“變體”是指顯示不同于所述類型或正常類型的變化的分子，如在明確描述的蛋白質(zhì)(如圖1所示的PSCA蛋白)的相應(yīng)位置上含有一個或多個不同氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。變體蛋白質(zhì)的一個例子是類似物。剪接同種型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)是變體的其它例子。本發(fā)明的“PSCA相關(guān)蛋白”包括這里特別描述的那些，以及等位變體、保守取代變體、類似物和同系物，它們可按照這里列出的方法或本領(lǐng)域容易獲得的方法無需過度實驗便可分離/產(chǎn)生并作特征性鑒定。也包括將不同PSCA蛋白或其片段的部分組合產(chǎn)生的融合蛋白以及PSCA蛋白和異源多肽形成的融合蛋白。這種PSCA蛋白統(tǒng)稱為PSCA相關(guān)蛋白、本發(fā)明的蛋白質(zhì)或PSCA。術(shù)語“PSCA相關(guān)蛋白”是指有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25個以上氨基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、330、335、339或更多氨基酸的多肽片段或PSCA蛋白質(zhì)序列。II.)PSCA多核苷酸本發(fā)明的一個方面提供了與所有或部分PSCA基因、mRNA和/或編碼序列相對應(yīng)或互補的多核苷酸，優(yōu)選以分離形式，包括編碼PSCA相關(guān)蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及有關(guān)分子、與PSCA基因或mRNA序列或其部分相互補的多核苷酸或寡核苷酸、以及與PSCA基因、mRNA或與編碼PSCA的多核苷酸(統(tǒng)稱為“PSCA多核苷酸”)雜交的多核苷酸或寡核苷酸。在章節(jié)提及的所有情況下，圖1中T也可以是U。PSCA多核苷酸的實例包括具有圖1所示序列的PSCA多核苷酸，圖1所示的PSCA的核苷酸序列，其中將T換成U；具有圖1所示序列的多核苷酸的至少10個毗連核苷酸；或具有圖1所示序列但將T換成U的多核苷酸的至少10個毗連核苷酸。編碼PSCA蛋白相對長部分的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可通過多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來產(chǎn)生編碼圖1所示或圖3所示PSCA蛋白或“變體”的約氨基酸1(或20或30或40等)到約氨基酸20(約30或40或50等)的多核苷酸。這些多核苷酸片段可包括圖1中所示PSCA序列中的任何部分。II.A.)PSCA多核苷酸的用途II.Α.1.遺傳異常的監(jiān)測上面所述的多核苷酸有多種不同用途。人PSCA基因的染色體定位圖列于題為"PSCA的染色體繪圖”的實施例中。例如，由于這種染色體的PSCA基因圖，編碼PSCA蛋白不同區(qū)域的多核苷酸被用來確定該染色體部位的細胞遺傳異常，例如鑒定為與各種癌癥有關(guān)的異常。在某些基因中，包括重排在內(nèi)的多種染色體異常已經(jīng)被鑒定為許多不同癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)的細胞遺傳異常(見例如Krajinovic等，Mutat.Res.382(3-4):81-83(1998)；Johansson等，Blood86(10):3905-3914(1995)禾口Finger等，P.N.A.S.85(23)9158-9162(1988))。因此，編碼PSCA蛋白特定區(qū)域的多核苷酸最可能是用來描繪編碼可能會造成惡性表型的PSCA的染色體區(qū)域中的細胞遺傳異常的比原先可能更精確的新工具。文中，這些多核苷酸滿足了本領(lǐng)域?qū)μ岣呷旧w篩選的靈敏度以鑒定出更加精細和更不常見的染色體異常的需求(見例如Evans等，Am.J.Obstet.GyneC01171(4)1055-1057(1994))。此外，已證明PSCA在前列腺和其它癌中高表達，PSCA多核苷酸被用于評定正常組織和癌組織中PSCA基因產(chǎn)物狀況的方法。通常，編碼PSCA蛋白特定區(qū)域的多核苷酸被用來評定PSCA基因特定區(qū)域(如含有一個或多個基序的區(qū)域)是否存在紊亂(如缺失、插入、點突變或?qū)е驴乖詥适У淖兓?。示范性的檢測法包括RT-PCR測定和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(見例如Marrogi等，J.Cutan.Pathol.26(8):369-378(1999)，它們都利用編碼蛋白質(zhì)特定區(qū)域的多核苷酸來檢測蛋白質(zhì)內(nèi)的這些區(qū)域。II.A.2.反義實施方式與這里所述本發(fā)明的實施方案有關(guān)的其它具體的核酸是基因組DNA、cDNA、核酶和反義分子，以及基于可替換主鏈或包含可替換堿基的核酸分子，它們可以來自天然來源或者是合成的，并且包括能夠抑制RNA或PSCA蛋白質(zhì)表達的分子。例如，反義分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非核酸分子，如以堿基對依賴方式特異性結(jié)合DNA或RNA的硫代磷酸酯衍生物。熟練的技術(shù)人員可用這里所述的PSCA多核苷酸和多核苷酸序列容易獲得這些類型的核酸分子。反義技術(shù)需要使用結(jié)合細胞內(nèi)靶多核苷酸的外源寡核苷酸。術(shù)語"反義〃是指這種寡核苷酸與它們的胞內(nèi)靶(例如PSCA)互補。見例如JackCohen,Oligodeoxynucleotides,AntisenseInhibitorsofGeneExpression,CRCPress，1989;和Synthesis1:1-5(1988)。本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸包括衍生物，如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-oligo，見JackCohen,同上)，這種物質(zhì)具有增強的抑制癌細胞生長的活性。S-oligo(核苷硫代磷酸酯)是寡核苷酸(Ο-oligo)的等電子類似物，其中磷酸基的非橋接氧原子被硫原子替代。本發(fā)明的S-oligo可用硫原子轉(zhuǎn)移劑3H-1，2-苯并二硫醇-3--1,1-二氧化物處理相應(yīng)的0-OIigo來制備。見例如Iyer,R.P.等，J.Org.Chem.55:4693-4698(1990)；和Iyer，R.P.等，J.Am.Chem.Soc.112:1253-1254(1990)。本發(fā)明的其它PSCA反義寡核苷酸包括本領(lǐng)域已知的嗎啉代反義寡核苷酸(見例如Partridge等，1996,Antisense&NucleidAcidDrugDevelopment6:169-175)。本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸通?？梢允桥cPSCA基因組序列的前100個5’密碼子和后100個3’密碼子或相應(yīng)的mRNA互補或穩(wěn)定雜交的RNA或DNA。盡管互補性程度高是優(yōu)選的，但不要求完全互補。使用與該區(qū)域互補的寡核苷酸能夠與PSCAmRNA選擇性雜交而不與蛋白激酶其它調(diào)節(jié)亞基的mRNA雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸是含有與PSCAmRNA雜交的序列的反義DNA分子的15至30個殘基的片段。任選地，PSCA反義寡核苷酸是與PSCA前10個5’密碼子或后10個3’密碼子互補的30-個殘基的寡核苷酸?；蛘?，所述反義分子被修飾以便用核酶來抑制PSCA表達，見例如L.A.Couture&D.T.Stinchcomb；TrendsGenet12:510-515(1996)。II.Α.3.引物和引物對本發(fā)明這些核苷酸的其它具體實施方案包括能夠特異性擴增本發(fā)明的多核苷酸或其任何特定部分的引物和引物對，以及與本發(fā)明的核酸分子或其任何部分選擇性或特異性雜交的探針。探針可用可檢測標記標識，如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶標記。這種探針和引物被用來檢測樣品中是否存在PSCA多核苷酸并被作為檢測表達PSCA蛋白的細胞的工具。這種探針的例子包括含有全部或部分圖1所示人PSCAcDNA序列的多肽。能夠特異性擴增PSCAmRNA的引物對的例子也在實施例中描述。熟練的技術(shù)人員將了解，可基于這里提供的序列來制備大量不同的引物和探針并將它們用來有效擴增和/或檢測PSCAmRNA。本發(fā)明的PSCA多核苷酸可用于許多目的，其中包括但不限于將它們用作擴增和/或檢測PSCA基因、mRNA或其片段的探針和引物；作為診斷和/或預(yù)測前列腺癌以及其它癌癥的試劑；作為能夠引導(dǎo)PSCA多肽表達的編碼序列；作為調(diào)節(jié)或抑制PSCA基因表達和/或PSCA轉(zhuǎn)錄物翻譯的工具；以及作為治療劑。本發(fā)明包括使用這里所述的任何探針鑒定并分離來自天然來源(如人或其它哺乳動物)的PSCA或PSCA相關(guān)核酸序列，以及分離的核酸序列本身，所述序列可包含在所用探針中發(fā)現(xiàn)的全部或大多數(shù)序列。II.A.4.PSCA-編碼的核酸分子的分離這里所述的PSCAcDNA序列能夠分離編碼PSCA基因產(chǎn)物的其它多核苷酸，以及分離編碼PSCA基因產(chǎn)物同系物、交替剪切同種型、等位變體和PSCA基因產(chǎn)物突變形式的多核苷酸，以及編碼PSCA相關(guān)蛋白類似物的多核苷酸。已經(jīng)熟知各種用來分離編碼PSCA基因的全長cDNA的分子克隆方法(見例如Sambr00k，J.等，《分子克隆實驗手冊》(第二版)，ColdSpringHarborPress,NewYork,1989；Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，WileyandSons，1995)。例如，可用市售的克隆系統(tǒng)(例如LambdaZAPExpress,Stratagene)方便地進行λ噬菌體克隆法?？捎脴擞浀腜SCAcDNA或其片段作為探針來鑒定含有PSCA基因cDNA的噬菌體克隆。例如，在一個實施方案中，可合成PSCAcDNA(例如圖1)或其部分并將其用作探針來檢索與PSCA基因相對應(yīng)的重疊和全長cDNA?？赏ㄟ^用PSCADNA探針或引物篩選基因組DNA文庫、細菌人造染色體文庫(BAC)、酵母人造染色體文庫(YAC)等來分離PSCA基因本身。II.A.5.重組核酸分子和宿主-載體系統(tǒng)本發(fā)明還提供了含有PSCA多核苷酸、其片段、類似物或同系物的重組DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、YAC、BAC、以及本領(lǐng)域熟知的各種病毒和非病毒載體，以及被這種重組DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。產(chǎn)生這種分子的方法可熟知的(見例如Sambrook等，1989，同上)。本發(fā)明還提供的宿主-載體系統(tǒng)含有能在合適的原核或真核宿主細胞內(nèi)(表達)的含有PSCA多核苷酸、其片段、類似物或同系物的重組DNA。合適的真核宿主細胞的例子包括酵母細胞、植物細胞護動物細胞，如哺乳動物細胞或昆蟲細胞(例如可被桿狀病毒感染的細胞，如Sf9或HighFive細胞)。合適的哺乳動物細胞的例子包括各種前列腺癌細胞系，如DU145和TSUft~l，其它可轉(zhuǎn)染或可轉(zhuǎn)導(dǎo)的前列腺癌細胞系，原代細胞(PrEC)，以及許多通常用來表達重組蛋白的哺乳動物細胞(如C0S、CH0J93J93T細胞)。更具體地說，可用任何一種本領(lǐng)域通常使用并被廣泛了解的宿主-載體系統(tǒng)，利用含有PSCA編碼序列或其片段、類似物或同系物的多核苷酸來產(chǎn)生PSCA蛋白殘基片段?？色@得許多適合表達PSCA蛋白或其片段的宿主-載體系統(tǒng)，見例如Sambrook等，1989，同上；《分子生物學(xué)最新方法》，1995，同上)。用于哺乳動物表達的優(yōu)選的載體包括但不限于pcDNA3.lmyc-His-tag(Invitrogen)和反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRtkneo(Muller等，1991，MCB11:178。使用這些表達載體，能夠在一些前列腺癌和非前列腺細胞系中表達PSCA，其中包括例如293、293T、rat-l、NIH3T3和TsuPrl細胞。本發(fā)明的宿主-載體系統(tǒng)可用來制造PSCA蛋白或其片段。這種宿主-載體系統(tǒng)可被用來研究PSCA和PSCA突變體或類似物的功能特性。重組人PSCA蛋白或其類似物或同系物或片段可用被編碼PSCA-相關(guān)核苷酸的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞來制造。例如，293T細胞可被編碼PSCA或其片段、類似物或同系物的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，從而PSCA相關(guān)蛋白在細胞中表達，并可用標準純化方法(例如用抗-PSCA抗體親和純化)來分離重組PSCA蛋白。另一實施方案中，PSCA編碼序列白亞克隆入反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRMSVtkneo并用來感染各種哺乳動物細胞系，如NIH3T3,TsuPrU293和rat-Ι，以建立PSCA表達細胞系。也可用本領(lǐng)域熟知的各種其它表達系統(tǒng)。編碼連接到PSCA編碼序列讀框的前導(dǎo)肽的表達構(gòu)建物可用來產(chǎn)生分泌形式的重組PSCA蛋白。如這里所論述的，遺傳密碼的冗余性允許PSCA基因序列中存在變化。具體地說，本領(lǐng)域已知特定種類的宿主通常具有特定密碼子的偏愛，因此可以采納已知的所需宿主偏愛的序列。例如，優(yōu)選的類似物密碼子序列通常用高頻密碼子代替罕用密碼子(即在所需宿主的已知序列中使用頻率不到20%的密碼子)。例如可利用在因特網(wǎng)上獲得的密碼子使用表(URL為dna.affrc.go.jp/nakamura/cocon.html)可計算出特定種類優(yōu)選的密碼子，。已知其它的序列修飾可增強細胞宿主內(nèi)的蛋白質(zhì)表達。這些修飾包括刪除編碼假聚腺苷化信號、外顯子/內(nèi)含子剪接位點信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)的序列，和/或其它此類充分了解的對基因表達有害的序列。序列的GC含量可被調(diào)節(jié)至給定細胞宿主的平均水平，該水平可參考在細胞宿主內(nèi)表達的已知基因來計算?？赡艿脑挘蓪π蛄羞M行修飾以避免預(yù)測的mRNA發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。其它有用的修飾包括在開放讀框開始處加入翻譯啟動共有序列，如Kozak所述，Mol.CellBiol.，9:5073-5080(1989)。熟練的技術(shù)人員知道以下一般原則，即真核核糖體無一例外地從最接近5’端的AUG密碼子開始翻譯，該原則只在極少情況下失效(見例如KozakPNAS92(7):2662-2666,(1995)，和KozakNAR15(20)8125-8148(1987))。III.)PSCA相關(guān)蛋白本發(fā)明的其它方面提供了PSCA相關(guān)蛋白。PSCA蛋白的具體實施方案包括具有圖291，優(yōu)選圖IA所示人PSCA全部或部分氨基酸序列的多肽。或者，PSCA蛋白的實施方式包括在圖1所示的PSCA氨基酸序列中有改變的變體、同系物或類似物多肽。PSCA多核苷酸的實施方式包括具有圖1所示序列的PSCA多肽，圖1所示的PSCA的肽序列，其中將T換成U；具有圖1所示序列的多肽的至少10個毗連核苷酸；或具有圖1所示序列但將T換成U的多肽的至少10個毗連核苷酸。表II提供了氨基酸縮寫。通常可在蛋白質(zhì)內(nèi)進行保守性氨基酸取代而不改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象或功能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個保守性取代。本文所述的本發(fā)明的實施方案包括大量本領(lǐng)域可接受的PSCA蛋白的變體或類似物，如帶有氨基酸插入、缺失和取代的多肽。PSCA變體可用本領(lǐng)域已知的方法，例如定點誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變來制造。定點誘變(Carter等，Nucl.AcidsRes.,13:4331(1986)；Zoller等，Nucl.AcidsRes.，10:6487(1987))、盒式誘變(Wells等，Gene，34:315(1985))、限制選擇誘變(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317415(1986))或其它已知技術(shù)可在克隆的DNA上進行來產(chǎn)生PSCA變體DNA。掃描氨基酸分析也可用來鑒定毗連序列上與特定生物活性如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)的一個或多個氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對較小的中性氨基酸。這種氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是該組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因為它的β碳原子上沒有側(cè)鏈并且不太可能改變變體的主鏈構(gòu)象。丙氨酸通常也是優(yōu)選的，因為它是最常見的氨基酸。此外，它通常發(fā)現(xiàn)于被埋沒及被暴露的位置(Creighton，Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976))。如果丙氨酸取代未產(chǎn)生適量的變體，則可使用等構(gòu)氨基酸。如本文的定義，PSCA變體、類似物或同系物的至少一個可鑒別的屬性是具有一個表位能與含有圖1氨基酸序列的PSCA蛋白起“交叉反應(yīng)”。在該句中，“交叉反應(yīng)”是指特異性結(jié)合PSCA變體的抗體或T細胞也特異性結(jié)合具有圖1所示氨基酸序列的PSCA蛋白。當一多肽不再含有任何能夠被特異性結(jié)合起始PSCA蛋白的抗體或T細胞識別的表位時，該多肽不再是圖1所示蛋白質(zhì)的變體。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，識別蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合不同大小的表位，從集的約4或5個毗連或不毗連的氨基酸認為是最小表位中典型的氨基酸數(shù)目。見例如Nair等，J.Immunol2000165(12):6949-6955;Hebbes等，MolImmunol(1989)26(9):865-73;Schwartz等，JImmunol(1985)135(4):2598_608。其它類型的PSCA相關(guān)蛋白變體與圖1的氨基酸序列或其片段具有70%、75%、80%、85%或90%或更高的類似性。其它特定類型的PSCA蛋白變體或類似物包含一種或多種這里所述的或本領(lǐng)域目前已知的PSCA生物基序。因此，本發(fā)明包括相比起始片段功能(例如免疫原性)特性已經(jīng)改變的PSCA片段的類似物(核酸或氨基酸)。還知道這種基序或本領(lǐng)域已知的基序?qū)⒈挥糜趫D1的核酸或氨基酸序列。如這里所論述的，本發(fā)明的實施方案包括含有小于圖1所示PSCA蛋白全長氨基酸序列的多肽。例如，本發(fā)明的典型實例包括含有圖1所示PSCA蛋白任何4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多毗連氨基酸的肽/蛋白質(zhì)。PSCA相關(guān)蛋白是用標準肽合成技術(shù)或用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)剪接法產(chǎn)生的?；蛘呖捎弥亟M方法來產(chǎn)生編碼PSCA相關(guān)蛋白的核酸分子。在一個實施方案中，可用核酸分子來產(chǎn)生PSCA蛋白的規(guī)定片段(或其變體、同系物或類似物)。III.A.)帶有基序的蛋白質(zhì)的實施方式本文所揭示的本發(fā)明的其它示范性實施方案包括含有圖1所示PSCA多肽序列中所含的一個或多個生物基序的氨基酸殘基的PSCA多肽。本領(lǐng)域已知各種基序，并且可通過許多可公開獲得的因特網(wǎng)站點(例如有以下URL:pfam.wustl.edu/；searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html；psort.ims.u-tokyo.ac.jp/；cbs.dtu.dk/；ebi.ac.uk/interpro/scan,html；expasy.ch/tools/scnpsitl.html；Epimatrix禾口Epimer,BrownUniversity,brown.edu/Research/TB_HIV_Lab/epimatrix/epimatrix·html；以及BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/.)來評估這種基序的存在情況。在表V-XVIII和XXII-LI中列出并鑒定了帶有所有PSCA變體蛋白質(zhì)帶有基序的子序列。表IV(h)列出了基于pfam檢索(見URLpfam.wustl.edu/)的一些常見的基序。表IV(h)的欄⑴列出了(1)基序名稱的縮寫，(2)該基序家族不同成員之間的相同性百分比，(基序名稱或描述，以及(4)最常見的功能；如果該基序與定位有關(guān)則還包括位置fn息ο鑒于上述PSCA基序與生長失調(diào)有關(guān)并且由于PSCA在某些癌癥(見例如表I)中過度表達，含有上述一個或多個PSCA基序的多肽對于闡明惡性表型的具體特征是有用的。例如，已知酪蛋白激酶II、cAMP和依賴于camp的蛋白激酶以及蛋白激酶C是與惡性表型的發(fā)展有關(guān)的酶(見例如Chen等，LabInvest.,78(2):165-174(1998)；Gaiddon等，Endocrinology136(10):4331-4338(1995)；Hall等，NucleicAcidsResearch24(6)1119-1126(1996)；Peterziel等，Oncogene18(46):6322-6329(1999)和0，Brian，Oncol.Rep.5(2):305-309(1998))。此外，糖基化和肉豆蔻酰化也是與癌癥和癌發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì)修飾(見例如Dennis等，Biochem.Biophys.Acta1473(1):21-34(1999)；Raju等，Exp.CellRes.235(1):145-1(1997))。酰胺化是另一種也與癌癥和癌發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì)修飾(見例如Treston等，J.Natl.CancerInst.Monogr.(13)169—175(1992))。另一實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含一個或多個用本領(lǐng)域可接受的方法鑒定出的免疫反應(yīng)性表位(如表V-XVIII和XXII-LI中列出的方法)?？捎锰囟ǖ乃惴ㄨb定出PSCA蛋白內(nèi)能夠最佳結(jié)合特定HLA等位基因的肽來確定CTL表位(例如表IV；Epimatrix禾口Epimer,BrownUniversity,URLbrown.edu/Research/TB_HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；以及BIMAS，URLbimas.dcrt.nih.gov/)。此外，鑒定與HLA分子有足夠的結(jié)合親和力且與成為免疫原性表位有關(guān)的肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且無需過度實驗便可進行。此外，鑒定成為免疫原性表位的肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且無需過度實驗便可在體外或體內(nèi)進行。本領(lǐng)域還知道產(chǎn)生這種表位的類似物以調(diào)節(jié)免疫原性的原理。例如，我們可以從帶有CTL或HTL基序(見例如表IV的HLAI類和HLAII類基序/超基序)的表位開始。通過取代一個指定位置的氨基酸并用為該位置指定的另一個氨基酸代替它可以產(chǎn)生類似的表位。例如，基于表IV定義的堿基，我們可以用任何其它殘基，例如優(yōu)選的殘基，取代出有害的殘基；用優(yōu)選的殘基取代不太優(yōu)選的殘基；或用另一個優(yōu)選的殘基取代最初產(chǎn)生的優(yōu)選的殘基。取代可發(fā)生在某肽的主要錨定位置或肽內(nèi)的其它位置；見例如表IV。許多參考資料都反映了鑒定并產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)及其類似物中的表位的技術(shù)。見例如Chesnut等的WO97/33602；Sette,Immunogenetics199950(3-4):201-212；Sette等，J.Immunol.2001166(2):1389-1397；Sidney等，Hum.Immunol.199758(1):12-20；Kondo等，Immunogenetics199745(4):249-258；Sidney等，J.Immunol.1996157(8):3480-90；和Falk等，Nature351:290-6(1991)；Hunt等，Science255:1261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.149:3580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152:163-75(1994))；Kast等，1994152(8):3904-12；Borras-Cuesta等，Hum.Immunol.200061(3):266-278；Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3):1625-1633；Alexander等，PMID:7895164,UI95202582；0，Sullivan等，J.Immunol.1991147(8):2663-2669；Alexander等，Immunity19941(9):751-761,以及Alexander等，Immunol.Res.199818(2):79_92。本發(fā)明的有關(guān)實施方案包括含有表IV(a)、IV(b)、IV(c)、IV(d)和IV(h)列出的不同基序，和/或一個或多個表V-XVIII和XXII-LI的預(yù)測的CTL表位，和/或一個或多個表XLVIII-LI的預(yù)測的HTL表位，和/或一個或多個本領(lǐng)域已知的T細胞結(jié)合基序的組合的肽。優(yōu)選的實施方案在基序或多肽的間插序列中不含插入、缺失或取代。此外，也可以考慮在這些基序的任一側(cè)上有多個N-末端和/或C-末端氨基酸殘基的實例(例如，包括含有基序的多肽結(jié)構(gòu)的較大部分)。通常，基序任一側(cè)上N-末端和/或C-末端氨基酸殘基的數(shù)目為約1-100個氨基酸殘基，優(yōu)選5-50個氨基酸殘基。PSCA相關(guān)蛋白的實例可以有許多形式，優(yōu)選分離形式。純化的PSCA蛋白分子將基本上不含會削弱PSCA與抗體、T細胞或其它配體結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或分子。分離和純化的類型和程度將取決于所需用途。PSCA相關(guān)蛋白的實例包括純化的PSCA相關(guān)蛋白和功能化的可溶性PSCA相關(guān)蛋白。在一個實施方案中，功能化的可溶性PSCA蛋白或其片段保留被抗體、T細胞或其它配體結(jié)合的能力。本發(fā)明還提供了含有圖1所示PSCA氨基酸序列的生物活性片段的PSCA蛋白。這種蛋白質(zhì)具有原始PSCA蛋白的特性，例如能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生能特異性結(jié)合原始PSCA蛋白相關(guān)表位的抗體產(chǎn)生；能夠被這種抗體結(jié)合；能夠誘導(dǎo)HTL或CTL的活化；和/或能夠被同樣特異性結(jié)合原始蛋白質(zhì)的HTL或CTL識別。含有特別感興趣結(jié)構(gòu)的PSCA相關(guān)多肽可用本領(lǐng)域熟知的各種分析技術(shù)來預(yù)測和/或鑒定，這些技術(shù)包括，例如，Chou-Fasman,Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析方法，或基于免疫原性的方法。含有這種結(jié)構(gòu)的片段對于產(chǎn)生亞單位特異性抗-PSCA抗體或T細胞，或鑒定結(jié)合PSCA的細胞因子特別有用。例如，可用Ηορρ，Τ.P.和Woods，K.R.的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.78:3824-3828)生成親水性圖譜并鑒定免疫原性肽片段。可用Kyte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157105-132)生成親水性圖譜并鑒定免疫原性肽片段?？捎肑aninJ.的方法(1979，Nature277:491-492)生成可接觸殘基百分比(％)圖譜并鑒定免疫原性肽片段。用BhaskaranR.，PonnuswamyP.K.的方法(1988，Int.J.Pept.ProteinRes.32=242-255)生成平均屈曲性圖譜并鑒定免疫原性肽片段。可MDeleage,G.，RouxB.的方法(1987,ProteinEngineeringl:289-294)生成β-轉(zhuǎn)角圖譜并鑒定免疫原性肽片段?？捎锰囟ㄋ惴ù_定CTL表位從而鑒定PSCA蛋白內(nèi)能夠最佳結(jié)合特定HLS等位基因的肽(例如，通過使用SYFPEITHI站點，其萬維網(wǎng)URL地址為syfpeithi.bmi-heidelberg.com/；表IV(A)-(E)的列出的算法；Epimatriχ和Epimer,BrownUniversity,URL(brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS,URLbimas.dcrt.nih.gov/)。用上述算法可預(yù)測在本文人MHCI類分子部分所述的來自PSCA的肽表位，例如HLA-AUA2、A3、All、A24、B7和B35(見例如表V-XVIII,XXII-LI)。具體地說，PSCA蛋白的整個氨基酸序列以及其它變體的有關(guān)部分，即與該變體相對應(yīng)的預(yù)測的HLAI類點突變或外顯子兩側(cè)任一側(cè)上的9個側(cè)接殘基，和預(yù)測的HLAII類點突變或外顯子兩側(cè)任一側(cè)上的14個側(cè)接殘基，被用于HLA肽基序檢索算法，該算法可在上述BioinformaticsandMolecularAnalysisSection(BIMAS)網(wǎng)址中找到；此外還有SYFPEITHI站點，其URL為syfpeithi.bmi-heidelberg.com/。HLA肽基序檢索算法是由KenParker博士根據(jù)HLAI類分子，尤其是HLA-A2溝槽中的特定肽序列的結(jié)合建立的(見例如i^alk等，Nature351:290-6(1991)；Hunt等，Science255:1261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.149:3580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152:163-75(1994))。該算法能夠?qū)碜酝暾鞍踪|(zhì)序列的8-肽、9-肽和10-肽進行定位和分級以便預(yù)測性地結(jié)合HLA-A2和許多其它HLAI類分子(的能力)。許多HLAI類結(jié)合肽是8_、9_、10或11-肽。例如，對I類HLA-A2而言，該表位優(yōu)選在2位含有亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)并在C-末端含有纈氨酸(V)或亮氨酸(L)(見例如Parker等，J.Immunol.149:3580-7(1992))。選出的PSCA預(yù)測的結(jié)合肽結(jié)果示于這里的表V-XVIII和XXII-LI。在表V-XVIII和XXII-XLVIII中顯示了選出的每個家族成員的候選(9-肽和10-肽)以及它們的位置、每個特定肽的氨基酸序列和估算的結(jié)合力評分。在表XLVIII-LI中顯示了選出的每個家族成員的候選15肽以及它們的位置，各具體肽的氨基酸序列和估算的結(jié)合力評分。結(jié)合力評分對應(yīng)于含肽復(fù)合體在37°CpH6.5的條件下解離的預(yù)計半衰期。預(yù)計具有最高結(jié)合評分的肽細胞表面的HLAI類分子結(jié)合最緊密而半衰期最長，因此給T細胞識別提供了最佳的免疫原性靶標。肽與HLA等位基因的實際結(jié)合可通過抗原加工缺陷細胞系T2上HLA表達的穩(wěn)定情況來評估(見例如Xue等，Prostate30:73-8(1997)和Peshwa等，Prostate36129-38(1998))。具體肽的免疫原性可通過體外在抗原呈遞細胞(如樹突細胞)存在時⑶8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)的激活來評估。宜將每個通過BIMAS站點、Epimer和Epimatriχ站點預(yù)測的表位，或由HLAI類或II類基序指定的表位將被“用于”本發(fā)明所述的PSCA蛋白，所述HLAI類或II類基序可用所述技術(shù)獲得或成為所述技術(shù)的一部分，如列于表IV(或用萬維網(wǎng)站點URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/,或BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/確定)?！坝糜凇痹谖闹斜硎驹u價PSCA蛋白，例如通過視覺評價或通過基于計算機的模式找尋方法，精通相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員可方便地進行。PSCA蛋白的每個帶有HLAI類基序的8、9、10或11個氨基酸殘基的子序列，或帶有HLAII類基序的9個或更多個氨基酸殘基的子序列都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。III.B.)PSCA相關(guān)蛋白的表達在下面的實施例描述的一個實施方案中，PSCA可在商品化的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞(如細胞)內(nèi)方便地表達，商品表達載體例如有CMV-驅(qū)動的編碼含C-末端6個組氨酸和MYC標記的PSCA的表達載體(pcDNA3.1/mycHIS,Invitrogen或Tag5，GenHunterCorporation,NashvilleTN)。Tag5載體提供了一個IgGK分泌信號，可用于促進轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生分泌的PSCA蛋白。例如，可采用標準技術(shù)用鎳柱純化分泌到培養(yǎng)基中的HIS-標記的PSCA。III.C.)PSCA相關(guān)蛋白的修飾PSCA相關(guān)蛋白的修飾，如共價修飾包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。共價修飾的一種類型包括使PSCA多肽的靶氨基酸殘基與能夠和PSCA蛋白的所選側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機衍生劑反應(yīng)。本發(fā)明范圍內(nèi)的PSCA多肽共價修飾的另一種類型包括改變本發(fā)明蛋白質(zhì)的天然糖基化模式。PSCA共價修飾的另一種類型包括以美國專利4，640，835;4，496，689；4，301，144；4，670，417；4，791，192或4，179，337中列舉的方式將PSCA多肽連接到多種非蛋白質(zhì)類型聚合物之一，這些聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。本發(fā)明的PSCA相關(guān)蛋白可被修飾以形成含有融合到其它異源多肽或氨基酸序列的PSCA的嵌合分子。這種嵌合分子可通過化學(xué)或重組方法合成。嵌合分子可含有融合到其它腫瘤相關(guān)抗原或其片段的本發(fā)明的蛋白質(zhì)?；蛘撸景l(fā)明所述的蛋白質(zhì)可含有PSCA序列(氨基酸或核酸序列)片段的融合物，這樣便形成了在其長度上不與圖1所示氨基酸或核酸序列直接同源的分子。這種嵌合分子可含有多個相同的PSCA子序列。嵌合分子可包含帶有多組氨酸表位標記(提供了固定的鎳可選擇性結(jié)合的表位)的PSCA相關(guān)蛋白與細胞因子或與生長因子的融合物。該表位標記通常置于PSCA蛋白的氨基-或羧基-末端。在另一個實施方案中，嵌合分子可包含PSCA相關(guān)蛋白與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合物。對于這種嵌合分子的二價形式(也成為"免疫粘附素")，這種融合物可以是IgG分子的Fc區(qū)域。Ig融合物宜包含用PSCA多肽的可溶(跨膜結(jié)構(gòu)域被刪除或失活)形式代替Ig分子至少一個可變區(qū)的取代。在一優(yōu)選的實施方案中，所示免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的絞鏈、CH2和CH3區(qū)，或絞鏈、CHI、CH2和CH3區(qū)。為制造免疫球蛋白融合物，可參見，例如，1995年6月27日發(fā)表的美國專利號5，428，130。III.D.)PSCA相關(guān)蛋白的用途本發(fā)明的蛋白質(zhì)有許多不同的用途。由于PSCA在前列腺癌和其它癌癥中高度表達，PSCA相關(guān)蛋白被用于評估正常組織和癌組織中PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)從而確定惡性表型的方法。通常，來自PSCA蛋白特定區(qū)域的多肽被用來評估那些區(qū)域(如含有一個或多個基序的區(qū)域)中是否存在錯亂(如缺失、插入、點突變等)。示范性的試驗利用靶向含有PSCA多肽序列中所含的一個或多個生物基序的氨基酸殘基的PSCA相關(guān)蛋白的抗體或T細胞，以評價正常組織和癌組織中該區(qū)域的特性，或引發(fā)對該表位的免疫應(yīng)答?；蛘?，含有PSCA蛋白一個或多個生物學(xué)活性基序的氨基酸殘基的PSCA相關(guān)蛋白被用于篩選與PSCA的該區(qū)域相互作用的因子。PSCA蛋白片段/子序列對于產(chǎn)生或特征分析結(jié)構(gòu)域特異性抗體(例如識別PSCA蛋白胞外或胞內(nèi)表位的抗體)以鑒定結(jié)合PSCA或其特定結(jié)構(gòu)域的自己或細胞因子特別有用，并且在各種治療和診斷應(yīng)用中特別有用，包括但不限于診斷測定、癌疫苗和制備這種疫苗的方法。PSCA基因或其類似物、同系物或片段編碼的蛋白質(zhì)有許多用途，包括但不限于產(chǎn)生抗體和用來鑒定結(jié)合PSCA基因產(chǎn)物的配體和其它試劑和細胞成分。產(chǎn)生的抗PSCA蛋白或其片段的抗體可用于診斷和預(yù)后測定，并被用于人以表達PSCA蛋白為特征的表I中列出的那些癌癥的成象方法。這種抗體可在胞內(nèi)表達并被用于治療這種癌癥患者的方法。PSCA-相關(guān)核酸或蛋白質(zhì)也被用來產(chǎn)生HTL或CTL應(yīng)答。使用了各種對于檢測PSCA蛋白有效的免疫試驗，其中包括但不限于各種類型的放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定(ELIFA)、免疫細胞化學(xué)法等等?？贵w可被標記并被用作能夠檢測表達PSCA的細胞的免疫顯象劑(例如在放射閃爍成象法中)。PSCA蛋白對于產(chǎn)生癌癥疫苗也特別有用，這將在文中進一步描述。IV.)PSCA抗體本發(fā)明的另一方面提供了結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白但在生理條件下不結(jié)合(或弱結(jié)合)不與PSCA相關(guān)的蛋白質(zhì)的肽或蛋白質(zhì)。文中，生理條件的例子包括1)磷酸緩沖鹽水；2)含25mMTris和150mMNaCl的Tris緩沖鹽水；或生理鹽水(0.9%NaCl)；4)動物血清如人血清；或幻1)-4)中任一項的組合；這些反應(yīng)宜在PH7.5下發(fā)生，或在pH7.0-8.0的范圍內(nèi)發(fā)生，或在pH6.5-8.5的范圍內(nèi)發(fā)生；同時，這些反應(yīng)在4-37°C的溫度下發(fā)生。例如，結(jié)合PSCA的抗體可結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白，例如其同系物或類似物。本發(fā)明的PSCA抗體對于癌癥(見例如表I)診斷和預(yù)后檢測以及成象方法特別有用。類似地，這種抗體對于治療、診斷和/或預(yù)測前列腺和其它癌癥也是有用的，只要PSCA也在這些其它癌癥中表達或過度表達。此外，胞內(nèi)表達的抗體(例如單鏈抗體)在處理與PSCA的表達有關(guān)的癌癥(例如晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌)或其它晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥中也有治療作用。本發(fā)明還提供了各種用來檢測和量化OSCA和突變型PSCA相關(guān)蛋白的免疫試驗。這種試驗可包括一種或多種能夠適當識別并結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的PSCA抗體。這些試驗可用本領(lǐng)域熟知的各種免疫測定模式進行，其中包括各種類型的放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定(ELIFA)等等。本發(fā)明的非抗體免疫測定還可包括T細胞免疫原性測定(抑制或刺激)以及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合檢測。此外，本發(fā)明還提供了能夠檢測前列腺癌和其它表達PSCA的癌癥的免疫成象法，其中包括但不限于使用標記的PSCA抗體的放射閃爍成象法。這種檢測法在臨床上用于表達PSCA的癌癥(如前列腺癌)的檢測、監(jiān)控和預(yù)測。PSCA抗體也被用于純化PSCA相關(guān)蛋白和分離PSCA同系物及相關(guān)分子的方法。例如，純化PSCA相關(guān)蛋白的方法包括在允許PSCA抗體結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的條件下將含有PSCA相關(guān)蛋白的裂解液或其它溶液與已與固體基質(zhì)偶聯(lián)的PSCA抗體一起孵育；洗滌該固體基質(zhì)以除去雜質(zhì)；并從偶聯(lián)的抗體洗脫PSCA相關(guān)蛋白。本發(fā)明所述PSCA抗體的其它用途包括產(chǎn)生模擬PSCA蛋白的抗-獨特型抗體。各種制造抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可通過用分離形式或免疫綴合形式的PSCA相關(guān)蛋白、肽或片段免疫哺乳動物宿主來制備抗體(《抗體實驗室手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual),CSHPress,Harlow禾口Lane編輯(1988)；Harlow,《抗體》(Antibodies)，ColdSpringHarborPress，NY(1989))。此外，也可使用PSCA的融合蛋白，如PSCAGST-融合蛋白。在一具體實施方案中，制造了包含圖1的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，然后將其用作免疫原來產(chǎn)生合適的抗體。另一實施方案中，合成了PSCA相關(guān)蛋白并將其用作免疫原。此外，本領(lǐng)域已知的裸DNA免疫技術(shù)被用來(有或沒有純化的PSCA相關(guān)蛋白或PSCA表達細胞)產(chǎn)生對編碼的免疫原的免疫應(yīng)答(參見Donnelly等，1997，Ann.Rev.Immunol.15:617-648)?？煞治鰣D1中所示的PSCA蛋白的氨基酸序列以選擇出產(chǎn)生抗體的PSCA蛋白的特定區(qū)域。例如，可利用PSCA氨基酸序列的疏水性和親水性分析來鑒定PSCA結(jié)構(gòu)中的親水區(qū)域。具有免疫原性結(jié)構(gòu)的PSCA蛋白區(qū)域以及其它區(qū)域和結(jié)構(gòu)域可方便地用本領(lǐng)域已知的各種其它方法來鑒定，這些方法例如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析法?？捎忙Е夕薛?，Τ·P.禾口Woods，K.R.的方法(1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.78:3824-3828)生成親水性圖譜?？捎肒yte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157:105-132)生成親水性圖譜?？捎肑aninJ.的方法(1979，Nature277:491-492)生成可接觸殘基百分比(％)圖譜。用BhaskaranR.,PonnuswamyP.K.的方法(1988，Int.J.Pept.ProteinRes.32:242-255)生成平均屈曲性圖譜?？捎肈eleage，G.，RouxB.的方法(1987，ProteinEngineering1:289-294)生成轉(zhuǎn)角圖譜。因此，用這些程序或方法中的任何一種鑒定出的各個區(qū)域在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文還通過實施例的方式進一步闡述了產(chǎn)生PSCA抗體的優(yōu)選方法。制備用作免疫原的蛋白質(zhì)或多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。本領(lǐng)域還熟知制備蛋白質(zhì)與載體(如BSA、KLH或其它載體蛋白)的免疫原性綴合物的方法。一些情況下，采用直接結(jié)合，例如使用碳二亞胺試劑；其它情況下，例如由PierceChemicalCo.(Rockford,IL)提供的結(jié)合試劑是有效的。像本領(lǐng)域知曉的那樣，經(jīng)常通過在適當時間內(nèi)與合適的佐劑一起注射來施用PSCA免疫原。在免疫過程中，可通過抗體的滴度來確定是否形成足夠抗體。PSCA單克隆抗體可用各種本領(lǐng)域熟知的方法來制造。例如，眾所周知，用Kohler和Milstein的標準雜交瘤技術(shù)或改進技術(shù)使產(chǎn)生抗體的B細胞不死化來制備了分泌所需單克隆抗體的不死細胞系。分泌所需抗體的不死細胞系通過以PSCA相關(guān)蛋白作為抗原的免疫測定來篩選。當鑒定出合適的不死細胞培養(yǎng)物時，可擴充細胞并從體外培養(yǎng)物或從腹水液中制造抗體。本發(fā)明的抗體或片段可通過重組方法制造。特異性結(jié)合所需PSCA蛋白區(qū)域的區(qū)域也可在多物種來源的嵌合或互補決定區(qū)(CDR)移植抗體形式來生產(chǎn)。也可制造人源化或人PSCA抗體，且它們宜用于治療。通過用一個或多個非人抗體CDR來代替相應(yīng)的人抗體序列制備人源化鼠抗體或其它非人抗體的方法是熟知的(見例如Jones等，1986，Nature321:522-525；Riechmannφ,1988,Nature332:323-327；Verhoeyenφ,1988,Science239:1534-1536)。也可參見Carter等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285和Sims等，1993，J.Immunol.151:2296。制造完全的人單克隆抗體的方法包括噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因方法(參見例如Vaughan等，1998，NatureBiotechnology16:5；35_539)。完全的人PSCA單克隆抗體可利用人Ig基因大組合文庫通過克隆技術(shù)產(chǎn)生(即噬菌體展示)(Griffiths和Hoogenboom，“建立體外免疫系統(tǒng)來自噬菌體展示文庫的人抗體”(Buildinganinvitroimmunesystemhumanantibodiesfromphagedisplaylibraries)。弓|自Clark,Μ·編寫的《用于男性診斷和治療的抗體分子的蛋白質(zhì)工程》(ProteinEngineeringofAntibodyMoleculesforProphylacticandTherapeuticApplicationsinMan),NottinghamAcademic,第45-64頁，(1993)；Burton禾口Barbas，《來自組合文庫的人抗體》(HumanAntibodiesfromcombinatoriallibraries)。同上，第65-82頁)。完全的人PSCA單克隆抗體也可用經(jīng)過工程構(gòu)建而含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠來制造，如1997年12月3日公開的Kucherlapati和Jakobovits等的PCT專利申請W098/24893所述(也可參見Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs7(4):607-614；2000年12月19日發(fā)表的美國專利6，162，963；2000年11月12日發(fā)表的6，150，584；和2000年9月5日發(fā)表的6，114598)。該方法避免了噬菌體展示技術(shù)要求的體外操縱，并可有效制造高親和性真正的人抗體。PSCA抗體與PSCA相關(guān)蛋白的反應(yīng)性可通過許多熟知的方法來建立，其中包括使用合適PSCA相關(guān)蛋白、表達PSCA的細胞或其提取物的Wfestern印跡、免疫沉淀、ELISA和FACS分析。PSCA抗體或其片段可用可檢測標記物標記或與第二分子綴合。合適的可檢測標記物包括但不限于放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。此外，用本領(lǐng)域通常了解的方法產(chǎn)生對兩個或多個PSCA表位的雙特異性抗體。均二聚(Homodimeric)抗體也可通過本領(lǐng)域已知的交聯(lián)技術(shù)制得(例如，Wolff等，CancerRes.53:2560-2565)。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所提供的稱為Hal-1.16、Hal_5.99、Hal_4.117、Ha1-4.20、Hal-4.121、Hal-4.37的單克隆抗體是在2005年5月4日被送至美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并分別被給予保藏號PTA-6698、PTA-6703、PTA-6699、PTA-6700、PTA-6701和PTA-6702。V.)PSCA細胞免疫應(yīng)答T細胞識別抗原的機制已被闡明。有效的本發(fā)明的肽表位疫苗組合物能在全世界大多數(shù)人群中誘導(dǎo)治療性和預(yù)防性免疫應(yīng)答。為了解本發(fā)明的綴合物誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的價值和功效，提供對免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)的簡單回顧。HLA-限制性T細胞識別HLA分子和作為配體的肽抗原的復(fù)合體(Buus，S.等，Cell47:1071,1986；Babbitt,B.P.等，Nature317359,1985；Townsend,A.禾口Bodmer，H.,Annu.Rev.Immunol.7:601,1989；Germain,R.N.,Annu.Rev.Immunol.11:403,1993)。通過研究單個氨基酸取代的抗原類似物和天然加工的內(nèi)源結(jié)合肽的序列測定，已經(jīng)鑒定出了與HLA的特異性結(jié)合抗原分子所需基序相對應(yīng)的關(guān)鍵殘基，列于表IV(也可參見例如，Southwood等，J.Immunol.160:3363,1998；Rammensee等，Immunogenetics41:178,1995；Rammensee等，SYFPEITHI,訪問萬維網(wǎng)的URL站點(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)；Sette,Α.禾口Sidney,J.Curr.Opin.Immunol.10:478,1998；Engelhard,V.H.,Curr.Opin.Immunol.6:13,1994；Sette,A.禾口Grey,H.Μ.,Curr.Opin.Immunol.4:79,1992；Sinigaglia,F.和Hammer，J.Curr.Biol.6:52,1994；Ruppert等，Cell74:929-937,1993；Kondo等，J.Immunol.155:4307-4312,1995；Sidney等，J.Immunol.157:3480-3490,1996；Sidney等，人Immunol.45:79-93,1996；Sette,Α.禾口Sidney,J.Immunogenetics1999-11；50(3-4):201_12，綜述)。此外，HLA-肽復(fù)合體的X射線晶體分析顯示，HLA分子的肽結(jié)合裂隙/溝內(nèi)的口袋可以等位基因特異性模式容納肽配體的殘基；這些殘基又決定了帶有它們的肽結(jié)合HLA的能力。(見例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13:587,1995；Smith等，Immunity4203，1996；Fremont等，Immunity8:305，1998；Stern等，Structure2:245，1994Jones,Ε.Y.Curr.Opin.Immunol.9:75，1997；Brown,J.H.等，Nature364:33，1993；Guo,H.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8053,1993；Guo,H.C.等，Nature360:364,1992；Silver,Μ.L.等，Nature360:367,1992；Matsumura,Μ.等，Science257:927,1992；Maddenφ,Cell70:1035,1992；Fremont,D.H.等，Science257:919,1992；Saper,Μ.Α.，Bjorkman,P.J.和Wiley,D.C.，J.Mol.Biol.219:277,1991)。因此，確定I類和II類等位基因特異性HLA結(jié)合基序，或者I類或II類超基序能夠鑒定出蛋白質(zhì)內(nèi)與特定HLA抗原結(jié)合的相關(guān)區(qū)域。因此，通過鑒定HLA基序可鑒定出基于表位的疫苗候選物；還可通過HlA-肽結(jié)合檢測進一步評價這種候選物以確定與表位和它相應(yīng)的HLA分子有關(guān)的結(jié)合親和力和/或結(jié)合周期?？蛇M行其它證實工作以在這些疫苗候選物中選擇在群體覆蓋和/或免疫原性上具有較佳特性的表位。可用多種方法來評價細胞的免疫原性，包括1)評價正常個體的原代T細胞培養(yǎng)物(見例如flfentworth，P.Α.等，Mol.Immunol.32:603,1995；Celis,Ε.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:2105,1994；Tsai,V.等，J.Immunol.158:1796，1997;Kawashima，I.等，HumanImmunol.59:1，1998)。該過程包括當存在抗原呈遞細胞時在體外用測試肽刺激正常人的外周血淋巴細胞(PBL)數(shù)周。該肽的特異性T細胞在此期間將被激活，可用例如肽致敏靶細胞的淋巴因子-或51Cr-釋放試驗進行檢測。2)免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠(見例如ffentworth,P.A.等，J.Immunol.26:97，1996；ffentworth,P.A.等，Int.Immunol.8:651,1996；Alexander,J.等，J.Immunol.159:4753,1997)。例如，在該方法中，皮下給予Hla轉(zhuǎn)基因小鼠用弗氏不完全佐劑配的肽。免疫接種數(shù)周后取得脾細胞，在測試肽存在時體外培養(yǎng)約1周。用例如肽致敏靶細胞和表達內(nèi)源產(chǎn)生抗原的靶細胞的51Cr-釋放試驗檢測肽特異性T細胞。3)證實已有效接種疫苗的免疫個體和/或慢性病患者中的記憶T細胞應(yīng)答(見例如Rehermann，B.等，J.Exp.Med.181:1047,1995；Doolan,D.L.等，Immunity7:97，1997；Bertoni,R.等，J.Clin.Invest.100:503,1997；Threlkeld,S.C.等，J.Immunol.159:1648,1997；Di印older，H.Μ.等，J.Virol.71:6011,1997)因此，可通過培養(yǎng)由于疾病已經(jīng)接觸過抗原因此產(chǎn)生了“天然”免疫應(yīng)答，或接種過這種抗原的疫苗者的PBL來檢測記憶應(yīng)答。將患者的PBL在測試肽和抗原呈遞細胞(APC)存在時在體外培養(yǎng)1-2周以激活“記憶”T細胞，與“原初”T細胞作比較。在培養(yǎng)期結(jié)束時，使用包括與肽致敏靶細胞的51Cr釋放、T細胞增殖或淋巴因子釋放等試驗檢測T細胞活性。VI.)PSCA轉(zhuǎn)基因動物編碼PSCA相關(guān)蛋白的也可用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物或"敲除"動物，這種動物然后可用于開發(fā)和篩選有治療作用的試劑。根據(jù)已有技術(shù)，編碼PSCA的cDNA可用來克隆編碼PSCA的基因組DNA。然后可用克隆的基因組序列來產(chǎn)生含有表達編碼PSCA的DNA的細胞的轉(zhuǎn)基因動物。制造轉(zhuǎn)基因動物，尤其是例如小鼠或大鼠之類的動物，的方法已成為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，并描述在，例如，1988年4月12日發(fā)表的美國專利4，736，866和1989年9月26日發(fā)表的4，870，009。通常，特定的細胞將成為帶有組織特異性增強子的PSCA轉(zhuǎn)基因摻38入的靶點。包含編碼PSCA的轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因動物可被用來檢查編碼PSCA的DNA表達增強的效應(yīng)。這種動物也可被用作藥劑的實驗動物，所述藥劑被認為可提供例如與其過度表達有關(guān)的病理狀態(tài)的保護。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，相比具有該轉(zhuǎn)基因的未治療動物，用藥劑治療的動物病理狀態(tài)的發(fā)病率降低，這說明該藥劑對該病理狀態(tài)有潛在治療作用?；蛘撸捎肞SCA的非人同系物來構(gòu)建PSCA"敲除"動物，所述動物由于編碼PSCA的外源基因和引入動物胚胎細胞的改變的編碼PSCA的基因組DNA之間的同源重組而導(dǎo)致編碼PSCA的基因缺陷或被改變。例如，根據(jù)已有技術(shù)，可用編碼PSCA的cDNA來克隆編碼PSCA的基因組DNA。部分編碼PSCA的基因組DNA的一部分可被刪除或被用另一基因(例如編碼可用來監(jiān)控整合的可選標記的基因)替代。通常，載體中包含數(shù)千個堿基的未改變的側(cè)接DNA(同時在5，和3，末端)(見例如Thomas和Capecchi，Cell，51:503(1987)關(guān)于同源重組載體的描述)。載體被引入胚胎干細胞系(例如通過電穿孔)并選擇引入的DNA已經(jīng)與內(nèi)源DNA同源重組的細胞(見例如Li等，Cell，69:915(1992))。然后將選出的細胞注射到動物(例如小鼠或大鼠)的胚泡以形成聚集嵌合體(見例如Bradley，引自E.J.Robertson編寫的《畸胎癌和胚胎干細胞實際進展》(TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproach)(IRL，Oxford,1987)，第113-152頁)。然后可將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性養(yǎng)育動物，然后使所述胚胎足月妊娠以產(chǎn)生"敲除"動物。在其生殖細胞內(nèi)帶有同源重組DNA的后代可通過標準技術(shù)鑒定并用來繁殖所有動物細胞都含有同源重組DNA的動物。可特征鑒定敲除動物它們抵抗疾病的能力或者由于缺乏PSCA多肽而發(fā)病。VII.)用于檢測PSCA的方法本發(fā)明的另一方面涉及檢測PSCA多核苷酸和PSCA相關(guān)蛋白的方法，以及鑒定表達PSCA的細胞的方法。PSCA的表達特征使其成為轉(zhuǎn)移疾病的診斷標記物。因此，PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)便為預(yù)測包括發(fā)生晚期疾病的易感性、進展速度和/或腫瘤侵襲性等各種因素提供了有用信息。如本文詳細討論的，患者樣品中PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)可用本領(lǐng)域熟知的各種方法來分析，其中包括免疫組織化學(xué)分析、包括原位雜交在內(nèi)的各種Northern印跡技術(shù)、RT-PCR分析(例如在激光捕獲顯微切割樣品上進行RT-PCR),Western印跡分析和組織陣列分析。更具體地說，本發(fā)明提供了檢測生物樣品(如血清、骨、前列腺、以及其它組織、尿、精液、細胞制品等)中的PSCA多核苷酸的試驗?？蓹z測的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCAmRNA、PSCAmRNA交替剪接變體以及含有PSCA多核苷酸的重組DNA或RNA分子。許多擴增和/或檢測PSCA多核苷酸存在的方法是本領(lǐng)域熟知的并且可用于本發(fā)明這個方面的實踐。在一個實施方案中，檢測生物樣品中PSCAmRNA的方法包括用至少一種引物通過逆轉(zhuǎn)錄從樣品制造cDNA；用PSCA多核苷酸作為正義和反義引物擴增如此制得的cDNA以擴增其中的PSCAcDNA;以及檢測是否存在擴增的PSCAcDNA。可任選確定擴增的PSCAcDNA序列。另一實施方案中，檢測生物樣品中PSCA基因的方法包括首先分離樣品的基因組DNA；用PSCA多核苷酸作為正義和反義引物擴增分離的基因組DNA；以及檢測是否存在擴增的PSCA基因。可從PSCA核苷酸序列(見例如圖1)設(shè)計出任意數(shù)目的合適正義和反義探針的組合，并用于此目的。本發(fā)明還提供了檢測組織或其它生物樣品(如血清、精液、骨、前列腺、尿、細胞制品等)中PSCA蛋白存在情況的試驗。檢測PSCA相關(guān)蛋白的方法也是熟知的，包括例如免疫沉淀、免疫組織化學(xué)分析、Western印跡分析、分子結(jié)合檢測、ELISA、ELIFA等。例如，檢測生物樣品中PSCA相關(guān)蛋白存在情況的方法包括首先使樣品接觸PSCA抗體、抗體的PSCA-反應(yīng)性片段或含有PSCA抗體抗原結(jié)合區(qū)的重組蛋白；然后檢測樣品中PSCA相關(guān)蛋白的結(jié)合。鑒定表達PSCA的細胞的方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在一個實施方案中，鑒定表達PSCA基因的細胞的檢測法包括檢測細胞中是否存在PSCAmRNA。檢測細胞內(nèi)特定mRNA的方法是熟知的，其中包括，例如，使用互補DNA探針進行雜交試驗(如用標記的PSCA核糖核酸探針原位雜交、Northern印跡以及相關(guān)技術(shù))和各種核酸擴增試驗(如用PSCA的特異性互補引物進行RT-PCR，以及其它類型的擴增檢測法，如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。或者，鑒定表達PSCA基因的細胞的試驗包括檢測細胞內(nèi)或細胞分泌的PSCA相關(guān)蛋白的存在情況。各種檢測蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，并被用來檢測PSCA相關(guān)蛋白和表達PSCA相關(guān)蛋白的細胞。PSCA表達分析也被用作鑒定和評價調(diào)節(jié)PSCA基因表達的試劑的工具。例如，PSCA表達在前列腺癌中顯著上調(diào)，并在表I所列組織的癌癥中表達。鑒定抑制PSCA在癌細胞內(nèi)表達或過度表達的分子或生物試劑具有治療價值。例如，可采用通過RT-PCR、核酸雜交或抗體結(jié)合來量化PSCA表達的篩選方法來鑒定這種試劑。VIII.)監(jiān)測PSCA-相關(guān)基因及其產(chǎn)物狀態(tài)的方法已知腫瘤形成是一個多步驟過程，其中，細胞生長逐步失調(diào)同時細胞由正常生理狀態(tài)發(fā)展到癌前狀態(tài)然后到癌癥狀態(tài)(見例如Alers等，LabInvest.77(5)437-438(1997)和Isaacs等，CancerSurv.2319-32(1995))。文中，檢查生物樣品細胞生長失調(diào)的證據(jù)(如癌癥中的異常PSCA表達)能夠在病理狀態(tài)(如癌癥)發(fā)展到治療選項更加有限或預(yù)后更加不良的階段之前早期察覺這種異常生理狀態(tài)。在這種實施方案中，可將感興趣的生物樣品內(nèi)PSCA的狀態(tài)與例如相應(yīng)的的正常樣品(如來自個體或未受病理影響的其它個體的樣品)內(nèi)PSCA的狀態(tài)進行比較。生物樣品中PSCA狀態(tài)的改變(相比正常樣品)提供了細胞生長失調(diào)的證據(jù)。除使用未受病變影響的生物樣品作為正常樣品，我們也可使用預(yù)定的標準值，例如預(yù)定的正常mRNA表達水平(見例如Grever等，J.Comp.Neurol.1996-12-9；376(2):306-14以及美國專利5,837,501)與樣品的PSCA狀態(tài)進行比較。文中，術(shù)語"狀態(tài)"具有本領(lǐng)域可接受的含義，是指基因及其產(chǎn)物的情況或狀態(tài)。通常，熟練的技術(shù)人員可使用許多參數(shù)來評價基因及其產(chǎn)物的情況或狀態(tài)。這些參數(shù)包括但不限于表達的基因產(chǎn)物的定位(包括PSCA表達細胞的定位)和水平、表達的基因產(chǎn)物(如PSCAmRNA、多核苷酸和多肽)的生物活性。通常，PSCA狀態(tài)的改變包括PSCA和/或PSCA表達細胞定位的變化，和/或PSCAmRNA和/或蛋白質(zhì)表達增加。樣品的PSCA狀態(tài)可用許多本領(lǐng)域熟知的方法來分析，包括但不限于免疫組織化學(xué)分析、原位雜交、在激光捕獲顯微切割樣品上進行RT-PCR分析、Western印跡分析和組織陣列分析。評價PSCA基因和基因產(chǎn)物狀態(tài)的典型方法可在以下文獻中找到，例如=Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995，第2(Northern印跡)、4(Southern印跡)、15(免疫印跡)和18(PCR分析)單元。因此，熟練的技術(shù)人員可用各種方法來評價生物樣品的PSCA狀態(tài)，其中包括但不限于基因組Southern分析(用來檢測例如PSCA基因內(nèi)的紊亂)、PSCAmRNA的Northern分析和/或PCR分析(用來檢測例如多核苷酸序列或PSCAmRNA表達水平的變化)、以及Western和/或免疫組織化學(xué)分析(用來檢測例如多肽序列的變化、多肽在樣品內(nèi)定位的變化、PSCA蛋白表達水平的變化和/或PSCA蛋白與多肽結(jié)合伴侶的結(jié)合)?？蓹z測的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCAmRNA、交替剪接變體、PSCAmRNA以及含有PSCA多核苷酸的重組DNA或RNA分子。PSCA的表達特征使其成為局限性和/或轉(zhuǎn)移疾病的診斷標記，并為生物樣品的生長或致癌潛能提供了信息。具體地說，PSCA的狀態(tài)為預(yù)測對特定疾病階段的易感性、進展和/或腫瘤侵襲性提供了有用信息。本發(fā)明提供了確定PSCA狀態(tài)和診斷表達PSCA的癌癥(如表I所列組織的癌癥)的方法和試驗。例如，由于相比正常前列腺組織，PSCAmRNA在前列腺和其它癌癥中如此高度地表達，評價生物樣品內(nèi)PSCAmRNA轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平的試驗可被用來診斷與PSCA失調(diào)有關(guān)的疾病，并可在確定合適的治療方法時提供有用的預(yù)測信息。PSCA的表達狀態(tài)提供的信息包括發(fā)育異常細胞、癌前細胞和癌細胞的存在、狀態(tài)和定位；預(yù)測對各種疾病階段的易感性和/或測量腫瘤的侵襲性。此外，這種表達特征使其可用作轉(zhuǎn)移疾病的顯象劑。因此，本發(fā)明的一個方面涉及檢測生物樣品(如來自患有或疑有以細胞生長失調(diào)為特征的病變(如癌癥)的個體的樣品)中PSCA狀態(tài)的各種分子預(yù)測和診斷方法。如上所述，生物樣品的PSCA狀態(tài)可通過許多本領(lǐng)域熟知的方法檢測。例如，取自機體特定部位的生物樣品的PSCA狀態(tài)可通過評估樣品內(nèi)存在或不存在PSCA表達細胞(如表達PSCAmRNA或PSCA蛋白的細胞)加以檢測。例如，當在正常情況下不含表達PSCA的細胞的生物樣品(如淋巴結(jié))內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種細胞時，由于生物樣品中PSCA狀態(tài)的這種變化通常與細胞生長失調(diào)有關(guān)，因此這種檢測可提供細胞生長失調(diào)的證據(jù)。具體地說，細胞生長失調(diào)的一個指標是癌細胞從原來的器官(如前列腺)轉(zhuǎn)移到身體的其它區(qū)域(如淋巴結(jié))。文中，細胞生長失調(diào)的證據(jù)是重要是，這是由于，例如，可在一定比例的前列腺癌患者內(nèi)檢出隱性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且這種轉(zhuǎn)移與已知的疾病發(fā)展預(yù)測器有關(guān)(見例如Murphy等，Prostate42(4):315-317(2000)；Su等，Semin.Surg.Oncol.18(1):17-28(2000)和Freeman等，JUrol1995-8154(2Pt1):474-8)。一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測PSCA基因產(chǎn)物的方法，該方法通過確定個體細胞表達的PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)，所述個體疑有與細胞生長失調(diào)有關(guān)的疾病(如增生或癌癥)，然后將如此確定的狀態(tài)與相應(yīng)的正常組織的PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)進行比較。相對正常組織，測試樣品內(nèi)存在異常PSCA基因產(chǎn)物說明該個體的細胞內(nèi)存在細胞生長失調(diào)。在另一方面，本發(fā)明提供了對于確定個體內(nèi)存在癌癥有用的試驗，該方法包括檢測測試細胞或組織樣品內(nèi)PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的表達相對于對應(yīng)的正常細胞或組織內(nèi)的表達水平顯著升高?？稍诶绲幌抻诒鞩所列的組織內(nèi)評價PSCAmRNA的存在。由于相應(yīng)的正常組織不表達PSCAmRNA或以較低水平表達，所以任何這些組織內(nèi)出現(xiàn)顯著的PSCA表達可用來說明癌癥的再現(xiàn)、存在和/或嚴重性。在有關(guān)實施方案中，PSCA狀態(tài)是在蛋白質(zhì)水平而不是核酸水平確定的。例如，這種方法包括確定測試組織樣品的細胞表達的PSCA蛋白的水平，并將這樣確定的水平與相應(yīng)的正常樣品內(nèi)表達的PSCA水平進行比較。在一個實施方案中，例如用免疫組織化學(xué)的方法評估了PSCA蛋白的存在。能夠檢測PSCA蛋白表達的PSCA抗體或結(jié)合伴侶被用于本領(lǐng)域熟知的用于此目的的各種測定模式。在另一實施方案中，我們可評價生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的狀態(tài)，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂。這些紊亂可包括插入、缺失、取代等。這種評價是有用的，因為在大量與生長失調(diào)表型有關(guān)的蛋白質(zhì)中觀察到核苷酸和氨基酸序列的紊亂(見例如Marrogi等，1999，J.Cutan.Pathol.26(8):369-378)。例如，PSCA序列中的突變可說明腫瘤的存在或促進。因此，PSCA的突變表明潛在的功能損失或腫瘤生長加快，這種測定具有診斷和預(yù)測價值。許多觀察核苷酸和氨基酸序列內(nèi)紊亂的試驗是本領(lǐng)域熟知的。例如，通過這里所述的Northern、Southern、Western、PCR和DNA測序法觀察PSCA基因產(chǎn)物核酸或氨基酸序列的大小和結(jié)構(gòu)。此外，觀察核苷酸和氨基酸序列內(nèi)紊亂的其它方法，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，是本領(lǐng)域熟知的(見例如1999年9月7日發(fā)表的美國專利5，382，510，和1995年1月17日發(fā)表的5，952，170)。此外，我們可檢測生物樣品中PSCA基因的甲基化狀態(tài)?；?’調(diào)節(jié)區(qū)CpG島的異常去甲基化和/或超甲基化經(jīng)常出現(xiàn)于不死細胞和轉(zhuǎn)化細胞，并且可導(dǎo)致不同基因的表達改變。例如，η-類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(一種在正常前列腺中表達的蛋白質(zhì)，但在90%以上的前列腺癌中不表達)的啟動子超甲基化將永久沉默轉(zhuǎn)錄該基因，并且是前列腺癌中最經(jīng)常檢測到的基因組變化(DeMarzo等，Am.J.Pathol.155(6)1985-1992(1999))。此外，這種變化在至少70%的高級前列腺上皮內(nèi)瘤樣病變(PIN)中出現(xiàn)(Brooks等，CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.，1998，7:531-536)。在另一實施例中，成淋巴細胞樣細胞中脫氧-氮雜胞苷誘導(dǎo)LAGE-I腫瘤特異性基因(該基因不在正常前列腺中表達，但在25-50%的前列腺癌中表達)的表達，說明腫瘤表達是由于去甲基化造成的(Lethe等，Int.J.Cancer76(6):903-908(1998))。許多檢測基因甲基化狀態(tài)的試驗是本領(lǐng)域熟知的。例如，我們可在Southern雜交方法中使用對甲基化敏感但不能切割含甲基化CpG位點的序列的限制性酶來了解CpG島的甲基化狀態(tài)。此外，MSP(甲基化特異性PCR)可迅速顯示所給基因CpG島中存在的所有CpG位點的甲基化狀態(tài)。該過程包括先用亞硫酸氫鈉(它將把所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶)修飾DNA，然后用甲基化和非未甲基化DNA的特異性引物進行擴增。關(guān)于甲基化紊亂的方法也可在例如FrederickΜ.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》(19%)第12單元中找到。基因擴增是另一種獲得PSCA狀態(tài)的方法。直接測定樣品的基因擴增，例如通過常規(guī)的Southern印跡或Northern印跡來量化mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52015205)、斑點印跡(DNA分析)或原位雜交，使用根據(jù)這里提供的序列的合適標記的探針。或者，可使用識別特定雙鏈體的抗體，其中包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNARNA雜合體雙鏈體或DNA蛋白質(zhì)雙鏈體。然后抗體被標記并進行測定，其中雙鏈體結(jié)合到表面，從而在表面形成雙鏈體，因此可檢測是否存在結(jié)合到雙鏈體的抗體。通常可檢測活檢組織或外周血以了解癌細胞的存在，使用例如Northern印跡、斑點印跡或RT-PCR分析來檢測PSCA表達。存在RT-PCR可擴增的PSCAmRNA表明了癌癥的存在。RT-PCR試驗是本領(lǐng)域熟知的。目前評價了外周血腫瘤細胞的RT-PCR試驗是否可用于診斷和處理多種人類實體瘤。在前列腺癌領(lǐng)域，這些包括檢測表達PSA和PSM的細胞的RT-PCR試驗(Verkaik等，1997，Urol.Res.25:373-384；Ghossein等，1995，J.Clin.Oncol.13:1195-2000；Heston等，1995，Clin.Chem.41:1687-1688)。本發(fā)明的另一方面是評估個體對癌癥的易感性。在一個實施方案中，預(yù)測對癌癥易感性的方法包括檢測組織樣品內(nèi)的PSCAmRNA或PSCA蛋白，其存在說明對癌癥易感，其中PSCAmRNA的表達程度與易感性程度相對應(yīng)。在以具體實施方案中，檢測了前列腺或其它組織內(nèi)PSCA的存在情況，樣品內(nèi)存在PSCA說明對前列腺癌易感(或出現(xiàn)或存在前列腺腫瘤)。類似地，我們可評估生物樣品內(nèi)PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等。樣品PSCA基因產(chǎn)物內(nèi)存在一種或多種紊亂是癌癥易感性(或出現(xiàn)或存在腫瘤)的指標。本發(fā)明還包括測定腫瘤侵襲性的方法。在一個實施方案中，測定腫瘤侵襲性的方法包括確定腫瘤細胞表達的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平，將如此確定的水平與取自同一個體或正常組織參考樣品的相應(yīng)的正常組織內(nèi)表達的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平進行比較，其中，相對正常樣品，腫瘤樣品中PSCAmRNA或PSCA蛋白的表達程度說明了侵襲性程度。在一具體實施方案中，腫瘤的侵襲性是通過確定腫瘤細胞內(nèi)PSCA的表達程度來評價的，表達水平越高說明越是侵襲性腫瘤。其它實施方案評價了生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等。存在一種或多種紊亂說明是侵襲性更強的腫瘤。本發(fā)明的另一個實施方案涉及觀察一段時間內(nèi)惡性腫瘤在個體的發(fā)展的方法。在一個實施方案中，觀察一段時間內(nèi)惡性腫瘤在個體的發(fā)展的方法包括確定腫瘤樣品內(nèi)細胞表達的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平，將如此確定的水平與不同時間取自同一個體的相同組織樣品內(nèi)表達的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平進行比較，其中，一段時間內(nèi)腫瘤樣品中表達的PSCAmRNA或PSCA蛋白的程度提供了癌癥發(fā)展的信息。在一具體實施方案中，通過測定一段時間內(nèi)腫瘤細胞中表達的PSCA來評價癌癥的發(fā)展，一段時間內(nèi)表達升高表明癌癥發(fā)展。同時，我們可評價生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等，存在一種或多種紊亂說明了癌癥發(fā)展。上述診斷方法也可與本領(lǐng)域已知的多種預(yù)測和診斷方法中的任何一種聯(lián)合。例如，本發(fā)明的另一個實施方案涉及觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(或PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物中的紊亂)與惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法，該方法被作為診斷和預(yù)測組織樣品狀態(tài)的手段?？刹捎枚喾N與惡性腫瘤有關(guān)的因子，如惡性腫瘤相關(guān)基因的表達(例如前列腺癌的PSA、PSCA和PSM的表達，等等)以及總的細胞學(xué)觀察(見例如Bocking等，1984，Anal.Quant.Cytol.6(2):74-88；Epstein,1995，Hum.Pathol.26(2):223-9；Thorson等，1998，Mod.Pathol.11(6):543-51；Baisden等，1999，Am.J.Surg.Pathol.23(8)918-24)。例如，由于存在一組與疾病相一致的特定因子，這為診斷和預(yù)測組織樣品狀態(tài)提供了重要信息，因此觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(或?qū)SCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的紊亂)與其它惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法是有用的。在一個實施方案中，觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(或PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物中的紊亂)與其它惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法必需檢測組織樣品內(nèi)PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的過度表達，檢測組織樣品內(nèi)PSAmRNA或蛋白質(zhì)的過度表達(或者PSCA或PSM的表達)，并觀察PSCAmRNA或蛋白質(zhì)與PSAmRNA或蛋白質(zhì)的過度表達(或者PSCA或PSM的表達)的一致性。在一具體實施方案中，檢測了前列腺組織內(nèi)PSCA和PSAmRNA的表達，樣品內(nèi)PSCA和PSAmRNA的過度表達相一致說明了前列腺癌的存在、對前列腺癌的易感性或前列腺腫瘤的復(fù)發(fā)或狀態(tài)。這里描述了檢測并量化PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的表達的方法，標準核酸和蛋白質(zhì)檢測和量化技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。檢測和量化PSCAmRNA的標準方法包括使用標記的PSCA核糖核酸探針的原位雜交、使用PSCA多核苷酸探針的Northern印跡和相關(guān)技術(shù)、使用PSCA特異性引物的RT-PCR分析以及其它擴增類型的檢測方法，例如有分支DNA、SISBA、TMA等等。在一具體實施方案中，采用半定量RT-PCR來檢測和量化PSCAmRNA的表達。出于該目的可使用任何數(shù)量的能夠擴增PSCA的引物，包括但不限于這里具體描述的各種引物組。在一具體實施方案中，在活檢組織的免疫組織化學(xué)測定中從使用與野生型PSCA蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體。IX.)與PSCA相互作用分子的鑒定通過本領(lǐng)域可接受的多種方法中的任何一種，熟練的技術(shù)人員可用這里揭示的PSCA蛋白和核酸序列來鑒定與PSCA相互作用的蛋白質(zhì)、小分子和其它試劑。例如，我們可利用一種所謂相互作用阱的系統(tǒng)(也成為“雙雜交試驗”)。在該系統(tǒng)中，分子與指導(dǎo)報告基因表達的轉(zhuǎn)錄因子相互作用并重建，從而可檢測報告基因的表達。其它系統(tǒng)通過真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白的重建在體內(nèi)鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，見例如1999年9月21日發(fā)表的美國專利5，955，280，1999年7月20日發(fā)表的5，925，523，1998年12月8日發(fā)表的5，846，722和1999年12月21日發(fā)表的6，004,746。本領(lǐng)域也存在基于基因組的預(yù)測蛋白質(zhì)功能的算法(見例如Marcotte等，Nature40241999年11月4日，83-86)。或者，我們可篩選肽文庫來鑒定與PSCA蛋白質(zhì)序列相互作用的分子。在該方法中，通過篩選文庫中編碼隨機或受控氨基酸集合來鑒定結(jié)合PSCA的肽。該文庫編碼的肽被作為噬菌體外被蛋白的融合蛋白表達，然后可選出抗PSCA蛋白的噬菌體顆粒。因此，無需之前對配體或受體分子的結(jié)構(gòu)有任何了解就鑒定出了具有多種用途的肽，例如治療、預(yù)測或診斷肽?？捎脕龛b定與PSCA蛋白質(zhì)序列相互作用的分子的典型肽文庫和篩選方法描述于，例如，1998年3月3日發(fā)表的美國專利5，723，286和1998年3月31日發(fā)表的5，733，731?；蛘?，表達PSCA的細胞系被用來鑒定PSCA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。這種相互作用可用免疫沉淀技術(shù)來檢測(見例如HamiltonB.J.^Biochem.Biophys.Res.Commun.1999,261:646-51)?？捎每?PSCA抗體從表達PSCA的細胞系中免疫測定PSCA蛋白?；蛘撸稍诮?jīng)工程改造的表達PSCA和His-tag(上述載體)融合物的細胞系內(nèi)采用抗His-tag抗體。可通過以下方法檢測免疫沉淀的復(fù)合體的蛋白質(zhì)結(jié)合，例如Western印跡、35S-甲硫氨酸標記蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)微測序、銀染和雙向凝膠電泳?？赏ㄟ^與這種篩選測定有關(guān)實施方案來鑒定與PSCA相互作用的小分子和配體。例如，可鑒定紊亂蛋白質(zhì)功能的小分子，包括紊亂PSCA介導(dǎo)磷酸化和去磷酸化能力、與DNA或RNA分子相互作用的分子，作為調(diào)節(jié)細胞周期、第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或腫瘤發(fā)生的指標。類似地，可鑒定調(diào)節(jié)PSCA-相關(guān)離子通道、蛋白質(zhì)泵或細胞通訊功能的小分子，并用來治療具有表達PSCA的癌癥的患者(見例如Hille,B.，《可興奮膜的離子通道》(IonicChannelsofExcitableMembranes),第二版，SinauerAssoc.,Sunderland,MA,1992)。此夕卜，調(diào)節(jié)PSCA功能的配體可基于其結(jié)合PSCA和活化受體構(gòu)建物的能力加以鑒定。典型的方法敘述于例如1999年7月27日發(fā)表的美國專利5，928，868，并包括形成至少有一個配體是小分子的雜交配體的方法。在一示范性實施方案中，利用經(jīng)工程改造能表達PSCA和DNA-結(jié)合蛋白融合蛋白的細胞來共表達雜交配體/小分子的融合蛋白和cDNA文庫轉(zhuǎn)錄激活蛋白。該細胞還含有報告基因，報告基因的表達使第一和第二融合蛋白相互接近，相互接近只有當雜交配體結(jié)合兩個雜交蛋白上的靶位點時才會發(fā)生。選擇表達報告基因的那些細胞，并鑒定未知小分子或未知配體。該方法可鑒定激活或抑制PSCA的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明一個實施方案包括篩選與圖1所示PSCA氨基酸序列相互作用的方法，該方法包括使一群分子接觸PSCA氨基酸序列、使這群分子和PSCA氨基酸序列在易于相互作用的條件下相互作用、確定存在與PSCA氨基酸序列相互作用的分子、然后將不和PSCA氨基酸序列相互作用的分子與和PSCA氨基酸序列相互作用的分子分離的步驟。在一具體實施方案中，該方法還包括純化、特征分析和鑒定與PSCA氨基酸序列相互作用的分子。鑒定出的分子可用來調(diào)節(jié)PSCA的功能。在一優(yōu)選的實施方案中，PSCA氨基酸序列與肽文庫相連.X.)治療方法和組合物鑒定在有限的組織內(nèi)正常表達但也在表I所列的癌中表達的PSCA將開創(chuàng)了許多治療此類癌癥的方法。注意，即便當靶蛋白在正常組織(甚至是正常的生命器官組織)內(nèi)表達時靶向抗腫瘤療法也是有效的。生命器官是維持生命必需的器官，如心臟或結(jié)腸。非生命器官是可切除但個體仍能存活的器官。非生命器官的例子有卵巢、乳腺和前列腺。例如，Herceptin是一種FDA批準的藥物，它是由各種稱為HER2、HER2/neu和erb-b-2的蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體組成的。它由Genentech銷售并且是一種獲得商業(yè)成功的抗腫瘤藥。2002年Herceptin的銷售額達到約4億美元。Herceptin用于治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。然而，HER2的表達不限于這種腫瘤。這種蛋白質(zhì)在許多正常組織內(nèi)表達。具體地說，已知HER2/neU存在于正常的腎臟和心臟內(nèi)，而這些組織存在于所有接受Here印tin的人當中。Latif，Ζ.等也證實正常腎臟內(nèi)存在HER2/neu(B.J.U.International(2002)89:5_9)。如該文獻所示(其評價了腎細胞癌是否應(yīng)成為抗-HER2抗體如Here印tin的優(yōu)選適應(yīng)證)，良性腎組織制造這種蛋白和mRNA。特別地，HER2/neu蛋白在良性腎組織內(nèi)強烈過度表達。盡管HER2/neu在心臟和腎臟等生命組織內(nèi)表達，但Here印tin是一種非常有效的、獲得FDA批準并取得商業(yè)成功的藥物。Here印tin對心臟組織的影響，即“心臟毒性(cardiotoxicity)”僅是一種治療副作用。當單獨用Here印tin治療患者時，僅在極少患者內(nèi)會發(fā)生顯著心臟毒性。為了使心臟毒性最小化，對于用HER2/neU進行的治療具有更為嚴格的準入要求。在能夠進行治療之前，需評估例如遺傳缺陷對心臟條件影響的因素。特別值得注意的是，盡管腎組織顯示正常表達，甚至可能高于心臟組織的表達，但腎臟未出現(xiàn)任何可評價的Here印tin副作用。此外，在表達HER2的各種正常組織中，只有極少會發(fā)生副作用。只有心臟組織出現(xiàn)可評價的副作用。在HER2/neU表達尤其顯著的組織，如腎組織，未出現(xiàn)任何副作用。45此外，發(fā)現(xiàn)以表皮生長因子受體(EGFR)；Erbitux(ImClone)為靶點的抗腫瘤療法有良好的治療效果。EGFR也在許多正常組織內(nèi)表達。使用抗-EGFR療法之后正常組織內(nèi)的副作用非常有限。EGFR治療中常見的副作用是在接受治療的100%的患者中都觀察到嚴重的皮疹。因此，正常組織甚至正常生命組織內(nèi)靶蛋白的表達不會破壞以該蛋白質(zhì)為靶向的靶向制劑在對某些該蛋白也過表達的腫瘤中作為治療劑的作用。例如，生命器官中的表達本身并不是有害的。此外，可去除被認為可給藥的器官(例如前列腺和卵巢)而不會導(dǎo)致死亡。最后，某些生命器官由于具有免疫特權(quán)(immuno-privilege)而不受正常器官表達的影響。具有免疫特權(quán)的器官是通過血液-器官屏障來免受血液影響并由此不易受免疫治療影響的器官。具有免疫特權(quán)的器官的例子是腦和睪丸。因此，抑制PSCA蛋白活性的治療方法可用于患有表達PSCA的癌癥的患者。這些治療方法通常分為3類。第一類是因PSCA與腫瘤細胞生長相關(guān)，通過調(diào)整PSCA功能使得腫瘤細胞生長受抑制或生長遲緩或者誘導(dǎo)對其的殺傷。第二類包括各種抑制PSCA蛋白與其結(jié)合伴侶或其它蛋白質(zhì)結(jié)合或締合的方法。第三類包括各種抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄或PSCAmRNA翻譯的方法。X.A.)抗癌疫苗本發(fā)明提供了含有PSCA相關(guān)蛋白或PSCA-相關(guān)核酸的癌癥疫苗。就PSCA的表達而言，癌癥疫苗可預(yù)防和/或治療表達PSCA的癌癥，而對非靶組織的影響很小或沒有影響。在疫苗中使用產(chǎn)生細胞-介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的腫瘤抗原以進行抗癌治療的方法是本領(lǐng)域熟知的，并被用于將人PSMA和嚙齒動物PAP免疫原用于前列腺癌的治療(Hodge等，1995，Int.J.Cancer63:231-237；Fong等，1997，J.Immunol.159:3113-3117)。通過使用PSCA相關(guān)蛋白或編碼PSCA的核酸分子以及能夠表達和呈遞PSCA免疫原的重組載體(通常包含許多T細胞表位或抗體)不難實施這種方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本領(lǐng)域已知許多輸送免疫反應(yīng)性表位的疫苗系統(tǒng)(見例如Heryln等，ArmMed1999-231(1):66-78；Maruyama^,CancerImmunolImmunother2000—649(3):123-32)。簡言之，這種在哺乳動物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(例如細胞-介導(dǎo)的和/或體液免疫應(yīng)答)的方法包括以下步驟使哺乳動物的免疫系統(tǒng)接觸某免疫反應(yīng)性表位(例如圖1所示PSCA蛋白或其類似物或同系物上的表位)從而使哺乳動物產(chǎn)生該表位的特異性免疫應(yīng)答(例如產(chǎn)生特異性識別該表位的抗體)。完整的PSCA蛋白、其免疫原性區(qū)域或表位可加以組合通過各種方法輸送。這種疫苗組合物可包括，例如，脂肽(例如Vitiello，A.等，J.Clin.Invest.95:341，1995)、包裹在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球體中的肽組合物(見例如Eldridge等，Molec.Immunol.28:287-294,1991=Alonso等，Vaccine12:299-306,1994Jones等，Vaccine13:675-681,1995)、含在免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)內(nèi)的肽組合物(見例如Takahashi等，Nature344:873-875,1990；Hu等，ClinExpImmunol.113:235-243,1998)、多重抗原肽系統(tǒng)(MAP)(見例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.85:5409-5413,1988；Tam,J.P.，J.Immunol.Methods196:17-32，1996)、配制成多價肽的肽；用于彈道輸送系統(tǒng)的肽(通常是結(jié)晶的肽)和病毒輸送載體的肽(Perkus，M.E.等，引自=Kaufmarm,S.H.E.編的《疫苗發(fā)展概述》(Conceptsinvaccinedevelopment),第379頁，1996;Chakrabarti,S.等，Nature320535,1986；Hu,S.L.等，Nature320:537,1986；Kieny,M.-P.等，AIDSBio/Technology4:790,1986；Top,F.H.等，J.Infect.Dis.124148，1971;Chanda，P.K.等，Virology175535，1990)、病毒或合成來源的顆粒(例如，Kofler,N.等，J.Immunol.Methods.192:25，1996；Eldridge,J.H.等，km.Hematol.3016，1993；小Falo，L.D.等，NatureMed.7:649,1995)、佐劑(Warren,H.S.，Vogel,F.R.和Chedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369,1986；Gupta,R.K.等，Vaccine11:293，1993)、脂質(zhì)體(Reddy,R.等，J.Immunol.148:1585,1992；Rock,K.L.，Immunol.Today17:131,1996)，或者裸cDNA或顆粒吸收的cDNA(Ulmer，J.B.等，Science2591745，1993；Robinson,H.L.、Hunt,L.Α.禾口Webster，R.G.，Vaccine11:957,1993；Shiver,J.W.等，引自=Kaufmann,S.H.Ε.編的《疫苗發(fā)展概述》(Conceptsinvaccinedevelopment),第423頁，1996；Cease,K.B.禾口Berzofsky,J.Α.,Annu.Rev.Immunol.12:923,1994，以及Eldridge,J.H.等，Sem.Hemato1.30:16，1993)。也可使用靶向毒素的輸送技術(shù)，也成為受體介導(dǎo)的尋靶，如AvantImmunotherapeutics,Inc.(Needham，Massachusetts)的那些技術(shù)。在患有PSCA相關(guān)癌癥的患者中，本發(fā)明的疫苗組合物也可與其它治療癌癥的方法例如手術(shù)、化療、藥物治療、放療等結(jié)合，包括與IL-2、IL-12、GM-CSF等免疫佐劑聯(lián)合使用。細胞疫苗可用特定的算法鑒定PSCA蛋白內(nèi)結(jié)合相應(yīng)HLA等位基因的肽以確定CTL表位(見例如表IV;EpimerTM禾口Epimatrix,BrownUniversity(URLbrown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS(URLbimas.dcrt.nih.gov/；SYFPEITHI,URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。在一優(yōu)選的實施方案中，PSCA免疫原含有一個或多個用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒定的氨基酸序列，如表V-XVIII和XXII-LI所示的序列，或有8、9、10或11個HLAI類基序/超基序(例如表IV(A)、表IV⑶或表IV(E))特有氨基酸的肽和/或至少有9個氨基酸的包含HLAII類基序/超基序(例如表IV(B)或表IV(C))的肽。本領(lǐng)域已知，HLAI類結(jié)合溝末端基本關(guān)閉，因此只有特定大小范圍的肽才能與溝相符合并與之結(jié)合，HLAI類表位的長度通常有8、9、10或11個氨基酸。相反，HLAII類結(jié)合溝末端基本開放；因此有約9個或更多氨基酸的肽可被HLAII類分子結(jié)合。由于HLAI和II類的結(jié)合溝不同，因此HLAI類基序是長度特異的，即I類基序的位置2是肽氨基到羧基方向的第二個氨基酸。II類基序的氨基酸位置只是相互之間相對的，而不是相對于整個肽，即帶有基序的序列的氨基和/或羧基末端可結(jié)合其它氨基酸。HLAII類表位是長度通常有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸，或25個氨基酸以上。本領(lǐng)域已知許多在哺乳動物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法(例如產(chǎn)生雜交瘤的第一個步驟)。在哺乳動物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法包括使哺乳動物的免疫系統(tǒng)暴露于蛋白質(zhì)的免疫原性表位(例如PSCA蛋白)以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一個具體的實施方案包括在宿主內(nèi)產(chǎn)生針對PSCA的免疫應(yīng)答的方法，該方法是使宿主接觸足量的至少一種PSCAB細胞或細胞毒T細胞表位或其類似物；并在這之后至少一定實踐間隔使宿主再接觸PSCAB細胞或細胞毒T細胞表位或其類似物。一個具體的實施方案包括產(chǎn)生抗PSCA相關(guān)蛋白或人造多表位肽的免疫應(yīng)答的方法給予人或其它哺乳動物含在疫苗制品內(nèi)的PSCA免疫原(例如PSCA蛋白或其肽片段、PSCA融合蛋白或類似物等)。通常，這種疫苗制品還含有合適的佐劑(見例如美國專利6，146，635)或通用輔助表位，如PADRETM肽(EpimmuneInc.，SanDiego,CA；見例如Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3):1625-1633；Alexander等，Immunity19941(9):751_761，和Alexander等，Immunol.Res.199818(2):79-92)。另一種方法包括在個體內(nèi)產(chǎn)生抗PSCA免疫原的免疫應(yīng)答，方法如下在哺乳動物機體的肌肉或皮膚中體內(nèi)給予包含編碼PSCA免疫原的DNA序列的DNA分子，該DNA序列操作性連接于控制DNA序列表達的調(diào)節(jié)序列；其中所述DNA分子被細胞攝取，DNA序列在細胞內(nèi)表達，并產(chǎn)生抗該免疫原的免疫應(yīng)答(見例如美國專利號5，962，428)。也可任選給予基因疫苗促效劑(facilitator)，如陰離子脂質(zhì)；皂苷；凝集素；雌激素類化合物；羥基化低級烷基；二甲基亞砜；以及尿素。此外，可給予模擬PSCA的抗獨特型抗體以產(chǎn)生對于靶抗原的反應(yīng)。核酸疫苗本發(fā)明的疫苗組合物包括核酸-介導(dǎo)的形式?？山o予患者編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或RNA?？刹捎没蛎庖呓臃N法來產(chǎn)生抗表達PSCA的癌細胞的預(yù)防性或治療性體液和細胞免疫應(yīng)答?？蓪⒑芯幋aPSCA相關(guān)蛋白/免疫原的DNA和適當調(diào)節(jié)序列的構(gòu)建物直接注射到個體的肌肉或皮膚內(nèi)，從而肌肉或皮膚細胞攝取該構(gòu)建物并表達編碼的PSCA蛋白/免疫原。或者疫苗中包含PSCA相關(guān)蛋白。PSCA相關(guān)蛋白免疫原的表達導(dǎo)致產(chǎn)生抗帶有PSCA蛋白的T細胞的預(yù)防性或治療性體液和細胞免疫力。可使用本領(lǐng)域已知的各種預(yù)防性和治療性基因免疫接種技術(shù)(參見例如互聯(lián)網(wǎng)地址genweb.com上公布的信息和參考資料)。基于核酸的輸送描述在，例如，Wolff等，kience247=1465(1990)以及美國專利5，580，859；5，589，466；5，804，566；5，739，118；5，736，524；5，679，647；WO98/04720。基于DNA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、促效(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽-介導(dǎo)的)輸送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合體和顆粒-介導(dǎo)的輸送(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的輸送(見例如美國專利5，922，687)。出于治療性或預(yù)防性免疫接種的目的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過病毒載體或細菌載體表達?？捎糜诒景l(fā)明實踐的各種病毒性基因輸送系統(tǒng)包括但不限于牛痘、禽痘、金絲雀痘、腺病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺伴隨病毒、慢病毒和辛德畢斯病毒(見例如Restifo,1996,Curr.Opin.Immunol.8:658-663；Tsang等J.Natl.CancerInst.87982-990(1995))。也可使用非病毒輸送系統(tǒng)，方法是在患者內(nèi)引入編碼PSCA相關(guān)蛋白的裸DNA(例如在肌肉內(nèi)或真皮內(nèi))以誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答反應(yīng)。例如，牛痘病毒可被用作載體以表達編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列。引入宿主之后，重組牛痘病毒表達蛋白質(zhì)免疫原性肽，因而引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。牛痘載體以及免疫接種用的方法描述在例如美國專利4，722，848中。另一種載體是BCG(BacilleCalmetteGuerin)。BCG載體描述在Mover等，Nature351:456-460(1991)。通過這里的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員直到許多其它載體可用治療性給予或免疫接種本發(fā)明的肽，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)載體、解毒的炭疽毒素載體寸。因此，基因輸送系統(tǒng)被用來運送PSCA-相關(guān)核酸分子。在一個實施方案中使用了全長人PSCAcDNA。另一實施方案中使用了編碼特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)和/或抗體表位的PSCA核酸分子。離體疫苗也可用各種離體方法來產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一種方法包括使用抗原呈遞細胞(APC)，如樹突細胞(DC)，以將PSCA抗原呈遞到患者的免疫系統(tǒng)。樹突細胞表達MHCI和II類分子、B7共刺激物和IL-12，因此是高度專一的抗原呈遞細胞。在前列腺癌中，前列腺特異性膜抗原(PSMA)脈沖的自體樹突細胞被用于I期臨床試驗以刺激前列腺癌患者的免疫系統(tǒng)(Tjoa等，1996，Prostate28:65-69；Murphy等，1996，Prostate29:371-380)。因此，樹突細胞可用來將PSCA肽呈遞到T細胞的MHCI或II類分子。在一個實施方案中，自體樹突細胞被能夠結(jié)合到MHCI類和/或II類分子的PSCA肽脈沖。另一實施方案中，樹突細胞被完整的PSCA蛋白脈沖。再一個實施方案包括用本領(lǐng)域已知的各種執(zhí)行載體使PSCA基因在樹突細胞內(nèi)過度表達，所述載體例如腺病毒(Arthur等，1997，CancerGeneTher.417-25)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Henderson等，1996，CancerRes.56:3763-3770)、慢病毒、腺伴隨病毒、DNA轉(zhuǎn)染(Ribas等，1997，CancerRes.57:2865-2869)或腫瘤衍生的RNA轉(zhuǎn)染(Ashley等，1997，J.Exp.Med.186:1177-1182)。也可工程改造表達PSCA的細胞來表達免疫調(diào)節(jié)劑，如GM-CSF，并將其用作免疫劑。X.B.)將PSCA作為以抗體為基礎(chǔ)的治療的靶標PSCA在基于抗體的治療策略中是很有吸引力的靶標。本領(lǐng)域中已知許多種用于靴向胞外和胞內(nèi)分子的抗體策略(參見例如，complementandADCCmediatedkillingaswellastheuseofintrabodies)。由于PSCA較相應(yīng)的正常細胞而言由各種癌細胞系表達，制備了全身性給予的PSCA-免疫反應(yīng)性組合物，該組合物具有優(yōu)良的敏感性，且不會因該免疫反應(yīng)性組合物與非靶標器官和組織的結(jié)合而產(chǎn)生毒性、非特異性和/或非靶向性作用。與PSCA結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體可用于全身性治療表達PSCA的癌癥，其可與毒素或治療劑聯(lián)用，或用作能抑制細胞增殖或功能的裸露抗體?？蓪SCA抗體導(dǎo)入患者，從而使得該抗體結(jié)合于PSCA并調(diào)整如下功能例如與結(jié)合對象的相互反應(yīng)以及其后介導(dǎo)的破壞腫瘤細胞和/或抑制腫瘤細胞生長。此類抗體具有治療效果的機制可包括補體介導(dǎo)的細胞溶解、抗體依賴性細胞毒性、對PSCA生理功能的調(diào)節(jié)、對配體結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制、對腫瘤細胞分化的調(diào)節(jié)、對腫瘤血管生成因子分布的改變、和/或凋亡。舉例包括用于非霍奇金淋巴瘤的Rituxan、用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的Here印tin以及用于結(jié)腸直腸癌的Erbitux。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解抗體可用于特異性靶向和結(jié)合免疫原性分子，例如圖1所示的PSCA序列的免疫原性區(qū)域。此外，熟練的技術(shù)人員會理解將抗體與細胞毒劑偶聯(lián)是很常規(guī)的(參見例如，Slevers等，Blood93:113678-3684(1999年6月1日))。將細胞毒劑和/或治療劑通過例如將它們與該細胞表達的分子Gf^nPSCA)特異性結(jié)合的抗體偶聯(lián)的方法直接遞送給細胞時，所述細胞毒劑將對那些細胞發(fā)揮其已知的生物效應(yīng)(即，細胞毒性)。本領(lǐng)域已知用于抗體-細胞毒劑偶聯(lián)物以殺傷細胞的許多組合物和方法。在癌癥方面，常用的方法包括給予帶有腫瘤的動物生物學(xué)有效量的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含與靶向劑(例如抗PSCA抗體)結(jié)合的所選細胞毒劑和/或治療劑，易于結(jié)合或定位到細胞表面。一個典型的實施方式是將細胞毒劑和/或治療劑遞送給表達PSCA的細胞的方法，所述方法包括使細胞毒劑與免疫特異性結(jié)合于PSCA表位的抗體偶聯(lián)，然后使所述細胞與該抗體-藥物偶聯(lián)物接觸。另一示例性的實施方式是治療疑似患有轉(zhuǎn)移性癌癥的個體的方法，所述方法包括以下步驟非胃腸道給予所述個體包含治療有效量的與細胞毒劑和/或治療劑偶聯(lián)的抗體的藥物組合物。可按照已在其它類型癌癥的治療中成功應(yīng)用的各種途徑來進行采用抗PSCA的癌癥免疫治療，所述其它類型的癌癥包括但不限于結(jié)腸癌(Arlen等，1998，Crit.Rev.Immunol.18:133-138)、多發(fā)性骨髓瘤(Ozaki等，1997，Blood90:3179-3186,Tsunenari等，1997，Blood90:2437-2444)、胃癌(Kasprzyk等，1992，CancerRes.52:2771-2776)、B細胞淋巴瘤(Funakoshi等，1996，J.Immunother.EmphasisTumorImmunol.19:93-101)、白血病(Zhong等，1996，Leuk.Res.20:581-589)、結(jié)腸直腸癌(Moun等，1994，CancerRes.546160-6166；Velders等，1995，CancerRes.55:4398-4403)以及乳腺癌(Sh印ard等，1991，J.Clin.Immunol.11:117-127)。一些治療途徑涉及將裸露抗體與毒素或放射性同位素偶聯(lián)，例如分別將Y91或I131與抗CD20抗體(例如，ZevalinTM，IDECPharmaceuticalsCorp.或Bexxar，CoulterPharmaceuticals)偶聯(lián)，而其它則涉及共同給予抗體和其它治療劑，例如共同給予Here印tinTM(曲妥單抗)和紫杉醇(Genentech，Inc.)?？蓪⑺隹贵w與治療劑偶聯(lián)。對于前列腺癌的治療，例如可同時給予PSCA抗體和放療、化療護激素去除。還可將抗體與以下物質(zhì)偶聯(lián)毒素(例如，Mylotarg,Wyeth-Ayerst,Madison,NJ，一種與抗腫瘤抗生素刺孢霉素偶聯(lián)的重組人化IgG4κ抗體)或美登醇(maytansinoid，例如基于紫杉烷的腫瘤活性前藥，TAP,platform,ImmunoGen,Cambridge,MA，也可參見例如，美國專利5，416，064)或AuristatinE(NatBiotechnol.2003年7月；21(7):778_84。(SeattleGenetics))。雖然PSCA抗體治療可用于癌癥的所有階段，但抗體治療尤為適宜用于晚期或轉(zhuǎn)移癌中?？蔀橐呀邮芰艘换蚨噍喕煹幕颊咧付ㄟM行本發(fā)明的抗體治療?；蛘?，對于未接受化療的患者，可將本發(fā)明的抗體治療與化療或放療方案結(jié)合進行。此外，抗體治療能使得采用降低劑量的聯(lián)用化療劑成為可能，尤其是在對化療劑毒性的耐受性不是很好的患者中。Fan等(CancerRes.53:4637-4642,1993)>Prewett等(InternationalJ.ofOnco.9217-224,1996)和Hancock等(CancerRes.51:4575-4580,1991)中描述了多種抗體與化療劑的共同使用。雖然PSCA抗體治療可用于癌癥的所有階段，但抗體治療尤為適宜用于晚期或轉(zhuǎn)移癌中?？蔀橐呀邮芰艘换蚨噍喕煹幕颊咧付ㄟM行本發(fā)明的抗體治療?；蛘撸瑢τ谖唇邮芑煹幕颊?，可將本發(fā)明的抗體治療與化療或放療方案結(jié)合進行。此外，抗體治療能使得采用降低劑量的聯(lián)用化療劑成為可能，尤其是在對化療劑毒性的耐受性不是很好的患者中?？稍u價癌癥患者的PSCA表達或水平，優(yōu)選采用腫瘤組織的免疫組織化學(xué)評定、定量PSCA成象或其它可靠指示PSCA表達的存在和程度的技術(shù)。腫瘤活檢或手術(shù)標本的免疫組織化學(xué)分析優(yōu)選用于此目的。腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析法是本領(lǐng)域熟知的。治療前列腺癌和其它癌癥的抗-PSCA單克隆抗體包括那些能誘導(dǎo)抗腫瘤強效免疫應(yīng)答的抗體或直接導(dǎo)致細胞毒性的抗體。就這點而言，抗-PSCA單克隆抗體(MAb)可通過補體介導(dǎo)的或抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)機制導(dǎo)致腫瘤細胞溶解，這兩種機制都要求免疫球蛋白分子的完整!7C部分與補體蛋白上的效應(yīng)細胞Fc受體位點相互作用。此外，對腫瘤生長發(fā)揮直接生物效應(yīng)的抗-PSCAMAb可用于治療表達PSCA的癌癥。細胞毒MAb的直接作用機制包括抑制細胞生長、調(diào)節(jié)細胞分化、調(diào)節(jié)腫瘤血管形成因子的特性和誘導(dǎo)凋亡。用多種評價細胞死亡的體外試驗評價了特定抗-PSCAMAb發(fā)揮抗腫瘤作用的機制，這些試驗通常是本領(lǐng)域已知的，如ADCC、ADMMC、補體介導(dǎo)的細胞溶解等等。一些患者中，使用鼠類或其它非人單克隆抗體或人/小鼠嵌合MAb可誘導(dǎo)中等至強的抗非人抗體的免疫應(yīng)答。這可導(dǎo)致從循環(huán)中清除抗體和降低功效。最嚴重時，這種免疫應(yīng)答可導(dǎo)致大量形成免疫復(fù)合體，這種復(fù)合體可能造成腎衰竭。因此，優(yōu)選的用于本發(fā)明治療方法的單克隆抗體是完全長人的或人源化的，并以高親和力特異性結(jié)合靶PSCA抗原，但在患者內(nèi)有低抗原性或沒有抗原性。本發(fā)明的治療方法包括單獨給予的抗-PSCAMAb以及其它MAb的組合物或混合物。這種MAb混合物具有某些優(yōu)點，這是由于它們含有的MAb可靶向不同表位、采用不同的效應(yīng)機制或?qū)⒓毎綧Ab與依賴于免疫效應(yīng)功能的MAb直接組合。這種組合的MAb可發(fā)揮協(xié)同治療作用。此外，抗-PSCAMAb可與其它治療形式一起給予，包括但不限于各種化學(xué)治療劑、雄激素阻斷劑、免疫調(diào)節(jié)劑(例如IL-2、GM-CSF)、手術(shù)或放療。抗-PSCAMAb以其“裸露”形式或非結(jié)合形式給予，或者可與治療劑結(jié)合?？?PSCA抗體制劑可通過任何能夠?qū)⒖贵w輸送到腫瘤細胞的途徑給予。給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、瘤內(nèi)、真皮內(nèi)等等。治療一般包括通過可接受的給藥途徑如靜脈注射(IV)重復(fù)給予抗-PSCA抗體制劑，其劑量范圍一般約為每千克體重0.1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9.、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25毫克。通常，每周IO-IOOOmgMAb的劑量是有效的并且是可以耐受的?；谟肏ere印tin治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床試驗，一種可接受的劑量方案是，起始負荷劑量約為每千克患者體重靜脈注射細g，然后以約ang/kg的劑量每周靜脈注射一次抗-PSCAMAb制劑。優(yōu)選地，起始負荷劑量是以90分鐘或更長時間灌輸給予的。定期維持劑量以30分鐘或更長時間的灌輸給予，只要起始劑量可良好耐受。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，在具體病理中，許多因素會影響理想的劑量方案。這些因素包括，例如，所用Ab或MAb的結(jié)合親和力和半衰期、PSCA在患者內(nèi)的表達程度、循環(huán)排除PSCA抗原的程度、所需穩(wěn)定狀態(tài)的抗體濃度水平、治療頻率、與本發(fā)明的治療方法聯(lián)合使用的化療劑或其它試劑的影響以及具體患者的健康狀況。任選地，可評價患者給定樣品內(nèi)PSCA的水平(例如循環(huán)PSCA抗原和/或PSCA表達細胞的水平)以幫助確定最有效的劑量方案等。這種評價也可用來監(jiān)測整個治療的目的，并且可結(jié)合其它參數(shù)的評估(例如膀胱癌治療中的尿細胞學(xué)和/或免疫細胞化學(xué)水平，或通過類推，前列腺癌治療中的血清PSA水平)來衡量治療效果。抗-獨特型抗-PSCA抗體也可用作抗癌療法的疫苗素誘導(dǎo)對表達PSCA相關(guān)蛋白的細胞的免疫應(yīng)答。具體地說，抗-獨特型抗體的產(chǎn)生是本領(lǐng)域熟知的；該方法適合產(chǎn)生模擬PSCA相關(guān)蛋白上的表位的抗-獨特型抗-PSCA抗體(見例如Wagner等，1997，Hybridoma1633-40；Foon等，1995，J.Clin.Invest.96:334-342；HerIyn等，1996，CancerImmunol.Immunother.43:65-76)。這種抗-獨特型抗體可用于癌癥疫苗方法。本發(fā)明的一個目的是提供抑制或延緩表達PSCA的腫瘤細胞生長的PSCA抗體。本發(fā)明的另一目的是提供在哺乳動物中(優(yōu)選為人類)抑制血管生成和其它生物學(xué)功能從而減少腫瘤生長的方法，所述方法采用PSCA抗體、尤其是將這些PSCA抗體與放療或化療劑或這兩者聯(lián)用。在一個實施方式中，當聯(lián)用PSCA抗體和化療劑或放療劑或它們的組合治療包括人腫瘤在內(nèi)的腫瘤時，具有協(xié)同作用。換言之，PSCA抗體對腫瘤生長的抑制作用在聯(lián)用化療劑或放療或它們的組合時，比預(yù)想中提高得更多。協(xié)同作用可通過例如與單用PSCA抗體治療或用PSCA抗體和化療劑或放療的加合效果相比，聯(lián)合治療對腫瘤生長的抑制作用比預(yù)想中更大來顯示。優(yōu)選，采用癌癥的減輕來證明協(xié)同作用，這一減輕相對于采用裸露PSCA抗體的治療或采用PSCA抗體和化療劑或放療的加合治療是意想不到的。采用PSCA抗體以及化療或放療的組合或同時采用兩者來抑制腫瘤細胞生長的方法包括在開始化療或放療之前、期間或之后給予PSCA抗體，以及它們的任何組合(即，在開始化療和/或放療之前和期間、之前和之后、或之前、期間和之后)。例如，通常在開始放療和/或化療前1-60天之間，優(yōu)選3-40天之間，更優(yōu)選5-12天之間給予所述PSCA抗體。然而，可根據(jù)治療記錄和特殊患者的需要，以可提供最有效的治療和最終延長患者生命的方式實施該方法?；焺┑慕o予可通過多種方式進行，包括通過胃腸道外和途徑進行全身性給藥。在一個實施方式中，將所述PSCA抗體和化療劑作為分開的分子給藥。在另一實施方式中，所述PSCA抗體是附著(例如，通過偶聯(lián))于化療劑的。(參見標題為“通過體內(nèi)使用人抗PSCA抗體治療和診斷人癌的人臨床試驗”的實施例)和(參見標題為“將PSCA作為以抗體為基礎(chǔ)的治療的靶標”的部分)?；焺┗蚧煹木唧w實例包括順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D、二氯甲二乙胺(氮芥)、鏈佐星、環(huán)磷酰胺，、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔紅霉素、丙卡巴胼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、長春堿、長春新堿、博來霉素、紫杉醇(泰素)、多西他賽(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、克拉屈濱、達卡巴嗪、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、干擾素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、光輝霉素、米托坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、鏈佐星、它莫西芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、紫杉醇或它們的組合。用于與PSCA抗體聯(lián)用的放射源可位于接受治療的患者的外部或內(nèi)部。當所述放射源位于患者的外部，這種治療被稱為外線束放射療法(EBRT)。當所述放射源位于患者的內(nèi)部，這種治療被稱為近距離放射療法(BT)。根據(jù)熟知的標準技術(shù)采用為了該目的制造的標準設(shè)備(例如AECL放射治療機和Varian醫(yī)用直線加速器)來給予該放射。放射劑量取決于本領(lǐng)域已知的多種因素。這些因素包括接受治療的器官、在放射路徑中可能會受到不良影響的健康器官、患者對放療的耐受性以及需要進行治療的身體區(qū)域。該劑量通常為Ι-lOOGy，更具體為2-80Gy。已報道的一些劑量包括對脊髓施予35Gy，對腎臟施予15Gy，對肝臟施予20Gy以及對前列腺施予65-80Gy。然而應(yīng)強調(diào)的是本發(fā)明并不限于任何具體的劑量。可由治療醫(yī)生按照給定情況下的具體因素(包括上述的因素)來確定劑量。外部放射源與進入患者的點之間的距離可為能使對靶T細胞的殺傷和使副作用最小化達到適宜平衡的任何距離。通常外部放射源與進入患者的點之間的距離為70-100cm。近距離放射療法通常是通過將放射源置于患者中來進行的。通常，將放射源放置在距離要治療的器官的約0-3cm處。已知的技術(shù)包括間質(zhì)、腔內(nèi)和表面近距離放射療法?？捎谰眯灾踩牖驎簳r性植入放射性粒源。一些已用于永久性植入的典型放射性原子包括碘-125和氡。一些已用于暫時性植入的典型放射性原子包括鐳、銫-137和銥-192。一些已用于近距離放射療法的其它放射性原子包括镅-241和金-198。用于近距離放射療法的輻射劑量可與上述的外線束放射治療的劑量相同。除了上述用于確定外線束放射治療劑量的因素以外，在確定近距離放射療法的劑量時還要考慮到所用放射性原子的性質(zhì)。X.C.)PSCA作為細胞免疫應(yīng)答的靶標疫苗和制備疫苗的方法是本發(fā)明的另一實施方案，所述疫苗含有免疫有效量的一種或多種這里所述HLA-結(jié)合肽。此外，本發(fā)明的疫苗包含一種或多種所述肽的組合物。肽可單獨存在于疫苗中。或者，所述肽可作為含有同一肽多個拷貝的均聚物或作為不同肽的雜聚物存在。聚合物的優(yōu)點在于有增強的免疫反應(yīng)，并且由于使用了不同的表位而使聚合物具有額外的誘導(dǎo)與免疫應(yīng)答尋靶的病原生物或腫瘤-相關(guān)肽的不同抗原決定子反應(yīng)的抗體和/或CTL的額外能力。所述組合物可以是天然產(chǎn)生的抗原區(qū)域或這可以通過例如重組或化學(xué)合成方法制備?？膳c本發(fā)明的疫苗一起使用的載體是本領(lǐng)域熟知的，其中包括，例如甲狀腺球蛋白，白蛋白如人血清白蛋白，破傷風(fēng)類毒素，聚氨基酸如聚L-賴氨酸、聚L-谷氨酸，流感病毒、乙肝病毒核蛋白等等。疫苗可含有生理上可耐(即可接受的)稀釋劑，如水或鹽水，優(yōu)選磷酸緩沖鹽水。疫苗中通常還可含有佐劑。不完全弗氏佐劑、硫酸鋁、氫氧化鋁或明礬等佐劑都是本領(lǐng)域熟知的材料的例子。此外，如本文所述，將本發(fā)明的肽與脂質(zhì)如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酸-絲氨酸(P3CSQ結(jié)合可引發(fā)CTL應(yīng)答。此外，發(fā)現(xiàn)佐劑，如含有合成胞嘧啶-硫代磷酸化-鳥嘌呤(CpG)的合成寡核苷酸可使CTL應(yīng)答提高10-100倍(見例如Davila禾口Celis,J.Immunol.165:539-547(2000))通過注射、氣溶膠、口服、透皮、透粘膜、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)或其它合適途徑用本發(fā)明的肽組合物免疫之后，宿主的免疫系統(tǒng)可通過產(chǎn)生大量所需抗原特異性的CTL和/或HTL對疫苗產(chǎn)生反應(yīng)。之后，宿主對隨后產(chǎn)生的表達或過度表達PSCA的細胞至少有部分免疫力，或者對該抗原相關(guān)的腫瘤至少能產(chǎn)生一些治療作用。在一些實施方案中，宜將I類肽組分與誘導(dǎo)或促進產(chǎn)生對該靶抗原的中和抗體和或輔助T細胞應(yīng)答的組分組合。這種組合物的一個優(yōu)選的實施方案包含本發(fā)明的I類和II類表位。這種組合物的另一個實施方案包含本發(fā)明的I類和/或II類表位以及交叉反應(yīng)性HTL表位，如PADREa(Epimmune,SanDiego,CA)分子(描述在例如美國專利5，736，142中)。本發(fā)明的疫苗還可包含抗原呈遞細胞(APC)，如樹突細胞(DC)，作為呈遞本發(fā)明的肽的載體。可在體外產(chǎn)生疫苗組合物，然后活動并收獲樹突細胞，從而在體外加載樹突細胞。例如，樹突細胞可用例如本發(fā)明的小基因轉(zhuǎn)染或用肽脈沖。然后將該樹突細胞給予患者并在體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答?；贒NA或肽的疫苗組合物也可體內(nèi)施用，同時活動樹突細胞，從而在體內(nèi)加載樹突細胞。在選擇多表位組合物的表位陣列時優(yōu)選采用以下原則，所述多表位組合物被用于疫苗或者用來選擇疫苗中所包含的和/或由核酸(如小基因)編碼的不連續(xù)表位。為進行此種選擇宜平衡以下原則。加入給定疫苗組合物內(nèi)的多個表位可以是但不需要是產(chǎn)生該表位的天然抗原序列中毗連的表位。1.)選擇在施用后模擬與清除腫瘤有關(guān)的免疫應(yīng)答的表位。對于HLAI類而言，包括來自至少一個腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的3-4個表位。對于HLAII類采用了類似的原理；又從至少一個TAA中選擇了3-4個表位(見例如Rosenberg等，Science278:1447-1450)。來自一個TAA的表位可與來自一個或多個其它TAA的表位組合以產(chǎn)生能靶向腫瘤并改變常見的TAA表達模式的疫苗。2.)選擇具有與免疫原性有關(guān)的必需結(jié)合親和力的表位對HLAI類分子，IC50為500nM或更低，通常為200nM或更低；對II類分子，IC50為IOOOnM或更低。3.)選擇具有足夠超基序的肽，或具有足夠等位基因特異性基序的肽陣列，以得到較寬的群體覆蓋率。例如優(yōu)選有至少80%的群體覆蓋率?？捎帽绢I(lǐng)域已知的統(tǒng)計計算法-MonteCarlo分析來評價群體覆蓋的寬度或冗余。4.)當選擇癌癥相關(guān)抗原表位時經(jīng)常選擇類似物，這是由于患者可能已經(jīng)建立了對天然表位的耐受。5.)特別適合的表位稱為“嵌套表位(nestedepitope)”。嵌套表位見于某一給定肽序列的至少兩個表位重疊處。嵌套的肽序列可包括B細胞、HLAI類和/或HLAII類表位。當提供嵌套表位時，一般的目的是提供每個序列的最大表位數(shù)。因此，一方面是避免提供比肽氨基末端表位的氨基末端長或比肽羧基末端表位的羧基末端長的肽。當提供多表位序列時，例如含有嵌套表位的序列時，為確保不具有致病或其它有害生物學(xué)性能，篩選序列通常是重要的。6.)如果產(chǎn)生了多表位蛋白質(zhì)或在產(chǎn)生小基因時，一個目的是產(chǎn)生包括感興趣表位的最小的肽。該原則與選擇包含嵌套表位的肽的原則相同或類似。然而，若是人造多表位肽，長度最小化的目的是使整合在該多表位蛋白質(zhì)中各表位之間的間隔序列相平衡。例如，可引入間隔氨基酸殘基以避免相連表位(可被免疫系統(tǒng)識別但靶抗原中不存在并且只能通過人為并列表位而產(chǎn)生的表位)相連，或便于在各表位之間切斷從而增強表位呈遞。由于受體可產(chǎn)生針對非天然表位的免疫應(yīng)答，所以通常需要避免表位相連。當相連表位是“優(yōu)勢表位”時需要特別注意。優(yōu)勢表位可導(dǎo)致對其它被削弱或被抑制表位的零應(yīng)答。7.)當存在同一靶蛋白多個變體的序列時，也可根據(jù)它們的保密性選擇可能的肽表位。例如，保密性的標準可規(guī)定，HLAI類結(jié)合肽的整個序列或II類結(jié)合肽的整個9-肽核心對某具體蛋白質(zhì)抗原所指定的序列評價其百分率是保守的。X.C.1.小基因疫苗有許多不同的能夠同時輸送多個表位的方法。編碼本發(fā)明的肽的核酸是本發(fā)明的一個特別有用的實例。根據(jù)以上章節(jié)設(shè)定的指南，優(yōu)選包含在小基因中的表位。一個優(yōu)選的給予編碼本發(fā)明肽的核酸的方法使用編碼含有一個或多個本發(fā)明表位的肽的小基因構(gòu)建物。下文和以下文獻描述了多表位小基因的應(yīng)用=Ishioka等，J.Immunol.1623915-3925，1999；An,L.和ffhitton,J.L.，J.Virol.71:2292,1997；Thomson,S.Α.等，J.Immunol.157:822,1996；ffhitton,J.L.等，J.Virol.67:348,1993；Hanke,R.等，Vaccine16:似6，1998。例如，可經(jīng)工程改造產(chǎn)生一種多表位DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼帶有超基序和/或基序的PSCA衍生表位、PADRE0通用輔助T細胞表位或PSCA的多個HTL表位(見例如表V-XVIII和XXII-LI)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-轉(zhuǎn)運信號序列。疫苗也可包含衍生自其它TAA的表位?？稍谵D(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)驗證多表位小基因的免疫原性以評估針對測試表位誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答反應(yīng)的數(shù)量級。此外，DNA編碼表位的體內(nèi)免疫原性可與特定CTL品系針對被該DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的靶細胞的體外應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。因此，這些實驗可顯示這種小基因的兩種作用1.)產(chǎn)生CTL應(yīng)答，和2.)誘導(dǎo)CTL識別的細胞表達編碼的表位。例如，為產(chǎn)生編碼所選表位(小基因)的DNA序列以在人類細胞中表達，可反翻譯該表位的氨基酸序列?？捎萌嗣艽a子表來選擇各個氨基酸的密碼子。這些編碼表位的DNA序列可直接毗鄰，因此當翻譯時可產(chǎn)生連續(xù)的多肽序列。為使表達和/或免疫原性最優(yōu)，可在設(shè)計小基因時加入其它元件。可被反翻譯的小基因序列內(nèi)的氨基酸序列的例子包括HLAI類表位、HLAII類表位、抗體表位、遍在蛋白化信號序列和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號。此外，可通過加入合成的(例如聚丙氨酸)或天然產(chǎn)生的毗鄰CTL或HTL表位的側(cè)接序列來改進CTL和HTL表位的HLA呈遞；這些較大的肽包括的表位屬于本發(fā)明范圍?？赏ㄟ^組裝編碼小基因正鏈和負鏈的寡核苷酸將小基因序列轉(zhuǎn)化成DNA?？捎檬熘募夹g(shù)在適當條件下合成、磷酸化、純化和退火重疊寡核苷酸(長30-100個堿基)。可用例如T4DNA連接酶連接寡核苷酸的末端。然后將這種合成的編碼表位多肽的小基因克隆入所需表達載體。載體中優(yōu)選包含精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標準調(diào)節(jié)序列以確保在靶細胞內(nèi)表達。需要一些載體元件帶有下游克隆位點以插入小基因的啟動子；有效終止轉(zhuǎn)錄的聚腺苷化信號；用來復(fù)制的大腸桿菌起點；和大腸桿菌可選擇標記(例如氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。許多啟動子可用于該目的，例如人巨細胞病毒(hCMV)啟動子。參見例如美國專利5，580，859和5，589，466以了解其它合適的啟動子序列?？杉尤肫渌d體修飾以優(yōu)化小基因的表達和免疫原性。一些情況下，需要內(nèi)含子以進行有效的基因表達，可在小基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)摻入一個或多個合成的或天然產(chǎn)生的內(nèi)含子。在哺乳動物細胞內(nèi)加入mRNA穩(wěn)定序列以及復(fù)制的序列也可提高小基因的表達?！┻x擇了表達載體，可將小基因克隆到啟動子下游的多接頭區(qū)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌菌株并用標準技術(shù)制備DNA。通過限制性酶切繪圖和DNA序列分析驗證小基因的取向以及DNA序列以及載體內(nèi)的所有其它元件。包含正確質(zhì)粒的細菌細胞可保存作為主細胞庫和工作細胞庫。此外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中發(fā)揮作用。如果需要增強免疫原性，可在載體的小基因編碼序列之外包含這些序列。一些實施方案中，可使用能夠制造小基因編碼表位和第二蛋白質(zhì)(可增強或降低免疫原性)的雙順反子表達載體。共同表達時可有利地增強免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或多肽的例子包括細胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生的分子(例如LeIF)、共刺激分子，或者對于HTL應(yīng)答有pan-DR結(jié)合蛋白(PADRES，Epimmune,SanDiego,CA)。輔助(HTL)表位可結(jié)合到胞內(nèi)尋靶信號并與CTL表位獨立表達；這可將HTL表位導(dǎo)向不同于CTL表位的細胞區(qū)室。需要的話，這可使HTL表位更有效地進入HLAII類途徑，從而促進HTL誘導(dǎo)。與HTL或CTL誘導(dǎo)相反，通過共表達免疫抑制分子(例如TGF_b)特異性降低免疫應(yīng)答對于某些疾病有益。55可通過例如在大腸桿菌內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)然后再純化來生產(chǎn)治療量的質(zhì)粒DNA。按照熟知的技術(shù)，將等量的工作細胞庫接種到生長培養(yǎng)基，在搖瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)生長至飽和。質(zhì)粒DNA可用標準生物分離技術(shù)純化，例如QIAGEN，Inc.(Valencia,California)提供的固相陰離子交換樹脂。需要的話可用凝膠電泳或其它方法將開環(huán)形式和線型形式中的DNA與超螺旋DNA相分離?？芍苽浼兓馁|(zhì)粒DNA以便用各種制劑進行注射。最簡單的方法是用無菌磷酸緩沖鹽水(PBQ重建凍干的DNA。這種稱為“裸DNA”的方法目前在臨床試驗中被用于肌肉內(nèi)(IM)給藥。為盡可能提高基因DNA疫苗的免疫治療作用，可以采用其它配制純化的質(zhì)粒DNA的方法。已經(jīng)描述過許多方法，并且也可使用新技術(shù)。該試劑可采用陽離子脂質(zhì)、糖脂和促融脂質(zhì)體(見例如以下文獻所述W093/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques6(7):682(1988)；美國專利5，279，833;W091/06309；以及Feigner等，Proc.Nat'1Acad.Sci.USA84:7413(1987)。此外，肽以及統(tǒng)稱為保護性、交互反應(yīng)性、非凝聚化合物(PINC,protective,interactive,non-condensingcompound)的化合物也可與純化的質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物，以改變例如穩(wěn)定性、肌肉內(nèi)分散性或?qū)μ囟ㄆ鞴倩蚣毎愋偷倪\輸?shù)茸兞俊０屑毎旅艨杀挥米餍』蚓幋a的CTL表位的表達和HLAI類呈遞的功能測定。例如，質(zhì)粒DNA被引入適合作為標準CTL鉻釋放測試的靶的哺乳動物細胞系。所用轉(zhuǎn)染方法將千里眼最終的制劑。電穿孔可用于"裸"DNA，而陽離子脂質(zhì)可用于直接體外轉(zhuǎn)染。表達綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)?？杀还厕D(zhuǎn)染以便通過熒光激活細胞分選(FACQ富集轉(zhuǎn)染的細胞。這些細胞然后用鉻-51(51Cr)標記并被用作表位特異性CTL系的靶細胞；通過51Cr釋放檢測細胞溶解，它表明了小基因編碼的CTL表位的產(chǎn)生以及HLA呈遞。可用類似的試驗評價HLA表位的表達以便評估HLA活性。體內(nèi)免疫原性是檢測小基因DNA制劑功能的第二種方法。用DNA產(chǎn)物免疫接種表達合適人HLA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。給藥劑量和途徑取決于所用的制劑(例如，對用PBS配的DNA采用IM途徑，對脂質(zhì)復(fù)合的DNA采用腹膜內(nèi)(i.p.)途徑)。免疫21天后收獲脾細胞并在存在編碼各個測試表位的肽時再刺激一周。然后可用標準技術(shù)檢測CTL效應(yīng)細胞溶解中帶有肽的51Cr標記的靶細胞試驗。被帶有與小基因編碼表位相對應(yīng)的肽表位的HLA致敏的靶細胞溶解證實了DNA疫苗制劑體內(nèi)誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。用類似的方法證實HTL表位在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的免疫原性?；蛘?，可用例如美國專利5，204，253中所述的彈道輸送法施用核酸。采用這種技術(shù)時，給予僅含有DNA的顆粒。在再一個實施方案中，可使DNA附著到顆粒例如金顆粒上。也可用本領(lǐng)域樹脂的細菌或病毒輸送系統(tǒng)來輸送小基因，例如可將編碼本發(fā)明表位的表達構(gòu)建物摻入牛痘等病毒載體。X.C.2.CTL肽和輔助肽的組合含有本發(fā)明的肽的疫苗組合物可被修飾，例如被類似化，以提供所需特性，如血清半衰期改進、群體覆蓋率變寬或免疫原性增強。例如，可使肽連接到含有至少一個能夠誘導(dǎo)T輔助細胞應(yīng)答的表位的序列來增強肽誘導(dǎo)CTL活性的能力。盡管CTL肽可直接連接到T輔助肽，但通常通過間隔分子使CTL表位/HTL表位結(jié)合。這種間隔分子通常含有相對較小的中性分子，如在生理條件下基本上不帶電荷的氨基酸或氨基酸模擬物。間隔分子通?？蛇x自，例如Ala、Gly或其它非極性氨基酸或中性極性氨基酸的中性間隔分子?？梢岳斫猓芜x存在的間隔分子不一定要含有相同的殘基，因此可以是雜-或同-寡聚物。當存在間隔分子時，間隔分子通常有至少一個或兩個殘基，更通常有3-6個殘基，有時甚至有10個或更多殘基?？蓪TL肽表位可直接或通過CTL肽氨基或羧基末端的間隔連接到T輔助肽表位。免疫原性肽或T輔助肽的氨基末端可被?；TL肽表位也可被修飾以改變其生物特性。例如，它們可被修飾以包含D-氨基酸從而增強它們對蛋白酶的抗性并因此延長它們的血清半衰期，或者它們可與其它分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類等)結(jié)合以增強其生物活性。例如，T輔助肽可在氨基或羧基末端結(jié)合一條或多條棕櫚酸鏈。X.C.3.CTL肽和T細胞引發(fā)(priming)劑的組合一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中可包含至少一種能引發(fā)B淋巴細胞或T淋巴細胞的組分。已鑒定脂質(zhì)能在體內(nèi)引發(fā)CTL。例如可將棕櫚酸殘基附加到賴氨酸殘基的e-和a-氨基上然后再通過一個或多個連接基(如Gly、Gly-Gly-,Ser,Ser-Ser等)連接到免疫原性肽。脂質(zhì)化的肽然后可作為摻入脂質(zhì)體的微團或顆粒直接施用，或用乳劑(如不完全弗氏佐劑)乳化后施用。在一優(yōu)選的實施方案中，特別有效的免疫原性組合物包含附加到Lys的e-和a_氨基上的棕櫚酸，然后通過接頭(如krler)使其結(jié)合于免疫原性肽的氨基末端。引發(fā)CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一個例子是大腸桿菌脂蛋白，如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)當共價結(jié)合到合適的肽時可被用來引發(fā)病毒特異性CTL(見例如Deres等，Nature342:561，1989)。本發(fā)明的肽可與例如P3CSS偶聯(lián)，并將脂肽施用給個體以引發(fā)針對靶抗原的特異性免疫應(yīng)答。此外，由于用P3CSS-綴合的表位引發(fā)也可誘生中和抗體，因此可將這樣的兩種組合物結(jié)合以更有效地引發(fā)體液和細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脈沖的DC的疫苗組合物本發(fā)明所述疫苗組合物的一個實施方案包括離體給予來自患者血液的PBMC或從中分離的DC帶有表位的肽的混合物?？墒褂糜欣谑斋@DC的藥物，如ftx)genip0ietinTM(Pharmacia-Monsanto,St.Louis,MO)或GM-CSF/IL-4。用肽脈沖DC并在再輸注到患者之前洗滌DC以除去未結(jié)合的肽。該實施方案中，疫苗包含肽脈沖的DC，其表面存在脈沖肽表位與HlA分子形成的復(fù)合物?？捎秒牡幕旌衔镫x體脈沖DC，混合物中有一些肽刺激針對PSCA的CTL應(yīng)答。可任選地含有輔助T細胞(HTL)肽，如天然或人造的疏松限制的HLAII類肽，以促進CTL應(yīng)答。因此，本發(fā)明的疫苗被用來治療表達或過度表達PSCA的癌癥。X.D.)過繼免疫治療抗原性PSCA-相關(guān)肽也被用來離體誘導(dǎo)CTL和/或HTL應(yīng)答。所得CTL或HTL細胞可被用來治療患者體內(nèi)的腫瘤，所述患者對其它傳統(tǒng)治療模式無反應(yīng)或?qū)Ρ景l(fā)明的治療性疫苗肽或核酸無反應(yīng)。通過在組織培養(yǎng)液內(nèi)一起培養(yǎng)患者的或遺傳相容的CTL或HTL前體細胞以及抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞和合適的免疫原性肽，離體誘導(dǎo)對特定抗原的CTL或HTL應(yīng)答。培養(yǎng)適當?shù)臅r間(通常約7-天)之后，這期間前體細胞被激活并擴增成為效應(yīng)細胞，將其灌輸回患者，它們將在這里破壞(CTL)或幫助破壞(HTL)它們的特異性靶細胞(例如腫瘤細胞)。轉(zhuǎn)染的樹突細胞也可被用作抗原呈遞細胞。Χ.E.)出于治療或預(yù)防目的施用疫苗本發(fā)明的藥物組合物和疫苗組合物通?？捎脕碇委熀?或預(yù)防表達或過表達PSCA的癌癥。在治療應(yīng)用中，可給予患者一定量的肽和/或核酸組合物，所述量足以引發(fā)有效的針對抗原的B細胞、CTL和/或HTL應(yīng)答，或者可治愈或至少部分阻止或減緩癥狀和/或并發(fā)癥。適合實現(xiàn)該目的的量被稱為"治療有效劑量"。對該用途有效量將取決于，例如，所施用的具體組合物、給藥方式、被治療疾病的階段和嚴重性、患者的體重和健康狀況以及主治醫(yī)師的判斷。本發(fā)明的藥物組合物、免疫原性肽或編碼它們的DNA給予已經(jīng)帶有表達PSCA的腫瘤的個體。所述肽或其編碼DNA可單獨給予或以一個或多個肽序列的融合序列的形式給予?；颊呖捎盟雒庖咴噪膯为氈委煟蛘哌m當?shù)脑捯部膳c其它治療方法(如手術(shù))聯(lián)合治療。在治療應(yīng)用中，給藥通常開始于首次被診斷出PSCA相關(guān)癌癥時。然后增加劑量直到至少癥狀基本緩解并再持續(xù)一段時間。輸送到患者的疫苗組合物(即包括但不限于例如肽混合物、多表位多肽、小基因或TAA特異性CTL或脈沖的樹突細胞)可根據(jù)疾病階段或患者的健康狀況而改變。例如，在患有表達PSCA的腫瘤的患者中，相比其它實例，含有PSCA特異性CTL的疫苗對于殺死晚期癌癥患者體內(nèi)的腫瘤細胞更有效。通過一種給藥方式輸送足以有效刺激細胞毒T細胞應(yīng)答量的肽表位通常是重要的；也可按照本發(fā)明的實施方案給予刺激輔助T細胞應(yīng)答的組合物。用于最初治療免疫的劑量通常以單位劑量出現(xiàn)，其范圍下限約為1、5、50、500或1，000μg,上限約為10，000,20,000,30,000或50，000μg。用于人的劑量值范圍通常為每70千克體重患者約500μg至約50，000μg。之后的數(shù)周至數(shù)月內(nèi)可提高劑量，增加劑量在約1.Omg和約50，OOOmg肽之間，這取決于通過測量獲自患者血液的CTL和HTL的比活確定的患者的反應(yīng)和狀況?？蛇B續(xù)給藥直到臨床癥狀或?qū)嶒炇以囼灡砻髂[瘤已被排除或減少，并再持續(xù)一段時間。劑量、給藥途徑以及給藥方案將根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來判斷。在某些實施方案中，本發(fā)明的肽和組合物可用于嚴重的疾病狀態(tài)，即威脅生命或有可能威脅生命的狀態(tài)。此時，基于外部物質(zhì)的最小量和優(yōu)選的本發(fā)明組合物中的肽的相對無毒特性，可以并且有必要給予患者相對所述劑量過量的肽組合物來進行治療。本發(fā)明的疫苗組合物也可僅作為預(yù)防劑。最初的預(yù)防免疫接種劑量通常以單位劑量出現(xiàn)，其范圍下限為約1、5、50、500或1000μg，上限為約10,000,20,000,30,000或50，000μg。用于人的劑量值范圍通常為每70千克患者約500μg至約50，000μg。在初次接種疫苗之后以約4周至6個月的預(yù)定間隔給予強化劑量，強化劑量在約1.Omg和約50，OOOmg肽之間。疫苗的免疫原性可通過測量獲自患者血液樣品的CTL和HTL的特異性活性來評估。治療用的藥物組合物可通過腸胃外、外用、口、鼻、鞘內(nèi)或在局部(例如作為乳膏或外用軟膏)施用。優(yōu)選通過腸胃外施用藥物組合物，例如靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了供腸胃外用藥的組合物，其中包含溶于或懸浮在可接受載體，優(yōu)選含水載體內(nèi)的免疫原性肽的溶液?？墒褂酶鞣N含水載體，例如水、緩沖的水、0.8%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可用熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)來滅菌，或者可被無菌過濾。所得水溶液可被包裝成直接使用的制劑，或被凍干，凍干的制品在給藥之前需要用無菌溶液重溶。所述組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以滿足生理條件的需要，如pH-調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑、防腐劑等，具體例如有乙酸鈉、乳酸納、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。藥物制劑中本發(fā)明的肽的濃度是可變的，即其重量比例可從小于約0.1%(通常為或至少約2%)至20%-50%或更高，并將根據(jù)所選特定給藥模式主要通過液體體積、粘度等來選擇。藥物組合物中通常含有人單位劑量單位的組合物，所述藥物組合物包含人單位劑量的可接受的載體，在一個實施方案中是含水載體，并以精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的用來將這種組合物給予人類的體積/質(zhì)量比進行給藥(見例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第17版，A.Gennaro編，MackPublishingCo.，Easton，Pennsylvania，1985)。例如，70kg體重患者的初次免疫肽劑量可從約1到約50，000mg，通常為100-5，OOOmg。例如，對核酸而言，初次免疫可用以0.5_5mg的量在多個部位通過IM(或SC或ID)給予的裸核酸形式的表達載體進行。核酸(0.I-IOOOmg)也可用基因槍給予。3-4周后給予強化劑量。強化劑可以是以5-107至切109pfu的劑量施用的重組禽痘病毒。對抗體而言，治療通常包括通過可接受的給予途徑，如靜脈注射(IV)，重復(fù)給予抗-PSCA抗體制品，其劑量通常為每千克體重約0.l-10mg。通常，每周10_500mgMAb的劑量是有效并能良好耐受的。此外，一種可以接受的抗-PSCAMAb制品的劑量方案是，每千克體重患者通過IV給予約^ig起始負荷劑量，然后每周通過IV給予約ang/kg的劑量。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，在具體病例中，有許多因素會影響理想劑量。這些因素包括，例如，組合物的半衰期、Ab的結(jié)合親和力、物質(zhì)的免疫原性、PSCA在患者內(nèi)的表達程度、PSCA抗原的循環(huán)排除程度、所需穩(wěn)定狀態(tài)的濃度水平、治療頻率、與本發(fā)明的治療方法聯(lián)合使用的化療劑或其它試劑的影響以及特定患者的健康狀況。非限制性的優(yōu)選的人單位劑量是，例如，500μg-lmg、lmg-50mg、50mg-100mg、100mg-200mg、200mg-300mg、400mg-500mg、500mg-600mg、600mg-700mg、700mg-800mg、800mg-900mg、900mg-lg或lmg_700mg。在某些實施方案中，劑量范圍是每千克體重2-5mg，例如，然后每周給予l-:3mg/kg;例如，然后是0.5mg、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/kg體重，每周給予，為期2、3或4周；例如，然后是0.5-10mg/kg體重，每周給予，為期2、3或4周；每周225、250、275、300、325、350、375、400mg/m2體表面積；每周l-600mg/m2體表面積；每周225-400mg/m2體表面積；這些劑量可每周給予，為期2、3、4、5、6、7、8、9、19、11、12或更多周。在一個實施方案中，多核苷酸的人單位劑型包括合適的劑量范圍或提供任何治療效果的有效量。如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所了解的，治療效果取決于許多因素，其中包括多核苷酸的序列、多核苷酸的分子量和給藥途徑。劑量通常由醫(yī)生或其它健康護理專家根據(jù)各種本領(lǐng)域已知的參數(shù)(例如癥狀的嚴重性、病史等)來選擇。通常，對于約20個堿基的多核苷酸而言，劑量范圍可選自，例如，獨立選擇的下限，如約0.1,0.25、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500mg/kg,至獨立選擇的大于下限的上限，如約60、80、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000mg/kgo例如，劑量可以是以下任何一種0.I-IOOmg/kg、0.l-50mg/kg>0.卜25mg/kg、0.1-lOmg/kg、l_500mg/kg、100-400mg/kg、200_300mg/kg、l-100mg/kg、100-200mg/kg、300-400mg/kg、400-500mg/kg、500-1000mg/kg、500-5000mg/kg或500-10，000mg/kg。通常，相比將核苷酸更直接地施加到疾病組織，腸胃外給藥途徑需要較高劑量的多核苷酸，當多核苷酸長度增加時劑量也需增加。在一個實施方案中，T細胞的人單位劑型包括合適的劑量范圍或提供任何治療效果的有效量。如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所了解的，治療效果取決于許多因素。劑量通常由醫(yī)生或其它健康護理專家根據(jù)各種本領(lǐng)域已知的各種參數(shù)(例如癥狀的嚴重性、病史等)來選擇。劑量可以是約104-106細胞、約106-108細胞、約108-1011細胞或約108-5χ1010細胞。劑量還可以是約106細胞/m2至約1010細胞/m2，或約106細胞/m2至約108細胞/m2。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)的編碼核酸也可通過脂質(zhì)體給予，脂質(zhì)體具有以下作用1)使蛋白質(zhì)靶向特定組織如淋巴組織；2)選擇性尋靶疾病細胞；或3)延長肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、微團、不溶單層、液晶、磷脂分散體、多層等等。在這些制品中，將被輸送的肽被作為脂質(zhì)體的一部分單獨摻入或與結(jié)合淋巴細胞普遍受體的分子(如結(jié)合CD45抗原的單克隆抗體)或其它治療性或免疫原性成分一起摻入。因此，裝有所需的本發(fā)明的肽的脂質(zhì)體或用這種肽裝飾的脂質(zhì)體可被導(dǎo)向到淋巴細胞部位，然后脂質(zhì)體將在這里輸送所述肽組合物。可用標準載體形成脂質(zhì)來形成用于本發(fā)明的脂質(zhì)體，其中一般包括電中性和負電荷的磷脂和類固醇(如膽固醇)。選擇脂質(zhì)時通常要考慮以下因素，例如脂質(zhì)體的大小、酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性。有許多制備脂質(zhì)體的方法，例如以下文獻中所描述的方法:Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)以及美國專利4，235，871，4，501，728，4，837，028和5，019，369。為使細胞靶向免疫系統(tǒng)，被摻入脂質(zhì)體的配體例如可包括所需免疫系統(tǒng)的細胞表面決定簇的特異性抗體或其片段。含有肽的脂質(zhì)體懸液可通過靜脈內(nèi)、局部等途徑給予，其劑量可根據(jù)給藥方式、被輸送的肽以及被治療擊疾病的階段等因素而改變。對于固體組合物可使用常規(guī)的無毒固體載體，其中包括，例如，藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石。纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。為口服給藥，可通過摻入任何通常使用的賦形劑(如上面列出的那些載體)來形成藥學(xué)上可接受的無毒組合物，這種組合物中通常含有10-95%活性成分，即一種或多種本發(fā)明的肽，且更優(yōu)選的濃度為25%-75%。對于氣溶膠給藥，免疫原性肽優(yōu)選以細分的形式和表面活性劑及推進劑一起提供。肽的重量比例通常為約0.01%-20%，優(yōu)選約-10%。當然，表面活性劑必需是無毒的，并且優(yōu)選溶于推進劑。代表性的這種試劑是含有6-22個碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油基硬脂酸(olestericacid)和油酸)與脂族多羥基醇或其環(huán)酐的酯或偏酯。可使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑占組合物重量的約0.1%-20%，優(yōu)選約0.25-5%。用常規(guī)推進劑平衡組合物。需要的話也可含有載體，例如鼻內(nèi)輸送時可含有卵磷脂。XI.)PSCA的診斷和預(yù)后實施方式如本文所述，PSCA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性細胞毒T細胞(CTL)、反應(yīng)性輔助T細胞(HTL)和抗-多肽抗體被用于熟知的診斷、預(yù)測和治療試驗，這用來檢測與細胞生長失調(diào)有關(guān)的疾病，如癌癥，尤其是表I列出的癌癥(參見，例如，其特定組織表達模式及其在某些癌癥中的過度表達，如題為“正常組織和患者標本內(nèi)PSCA的表達分析”的實施例所述)。由此可知，PSCA是一種前列腺相關(guān)抗原PSA，醫(yī)療工作者用這種原型標記來鑒定和監(jiān)測前列腺癌的發(fā)生已有多年(見例如Merrill等，J.Urol.163(2)=503-5120(2000)；Polascik等，J.Urol.Aug；162(2):293-306(1999)禾口Fortier等，J.Nat.CancerInst.91(19):1635-1640(1999))。也可使用許多其它的診斷標記，其中包括p53和K-ras(見例如Tulchinsky等，IntJMolMedl999-7_4(1):99-102和Minimoto等，CancerDetectPrev2000；24(1):1-12)。因此，公開PSCA多核苷酸和多肽(以及用來鑒定這些分子存在情況的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體)以及它們的特征使得熟練的技術(shù)人員能夠?qū)⑦@些分子用于類似的方法，例如許多涉及癌癥相關(guān)癥狀的診斷試驗。使用PSCA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性T細胞和抗體的診斷方法的典型實施方案類似于已經(jīng)良好建立的使用例如PSA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性T細胞和抗體的診斷試驗。例如，就像在監(jiān)測PSA過度表達或前列腺癌轉(zhuǎn)移的方法中使用PSA多核苷酸作為探針(例如Northern分析，見例如Sharief等，Biochem.Mol.Biol.Int.33(3):567-74(1994))和引物(例如PCR分析，見例如Okegawa等，J.Urol.163(4):1189-1190(2000))以觀察PSAmRNA的存在和/或水平一樣，可用同樣的方法用這里所述的PSCA多核苷酸來監(jiān)測PSCA的過表達或前列腺癌和其它表達這種基因的癌癥的轉(zhuǎn)移?；蛘?，就像在監(jiān)測PSA蛋白過表達(見例如St印han等，Urology55(4):560-3(2000))或前列腺細胞轉(zhuǎn)移(見例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3):233-7(1996))的方法中用PSA多肽來產(chǎn)生PSA特異性的抗體用來觀察PSA蛋白的存在和/或水平一樣，可用這里所述的PSCA多肽來產(chǎn)生用來監(jiān)測PSCA的過表達和/或前列腺細胞以及表達這種基因的其它癌癥細胞的轉(zhuǎn)移。具體地說，由于轉(zhuǎn)移涉及癌細胞從一種來源的器官(如肺或前列腺等)移動到身體其它區(qū)域(如淋巴結(jié))，所以可采用檢測生物樣品是否存在表達PSCA多核苷酸和/或多肽的細胞的試驗來提供轉(zhuǎn)移的證據(jù)。例如，當發(fā)現(xiàn)來自通常不含表達PSCA的細胞的組織(淋巴結(jié))的生物樣品中含有表達PSCA的細胞時，例如在分離自淋巴結(jié)和骨轉(zhuǎn)移的異種移植物L(fēng)APC4和LAPC9中觀察到PSCA表達，該發(fā)現(xiàn)預(yù)示著轉(zhuǎn)移?；蛘?，可用PSCA多核苷酸和/或多肽來提供癌癥的證據(jù)，例如當發(fā)現(xiàn)通常不表達PSCA或以不同水平表達PSCA的生物樣品內(nèi)的細胞表達PSCA或PSCA表達升高時(見例如表I所列癌癥中的PSCA表達以及相應(yīng)的圖中所示的患者樣品等中的PSCA表達)。在這種測定中，技術(shù)人員還希望通過檢測生物樣品中是否存在除PSCA之外的第二組織限制性標記，如PSA、PSCA等，來產(chǎn)生關(guān)于轉(zhuǎn)移的補充證據(jù)(見例如Alanen等，Pathol.Res.I^ract.192(3)233-237(1996))。使用免疫組織化學(xué)法鑒定組織切片內(nèi)存在PSCA多肽可說明該組織內(nèi)某些細胞的狀態(tài)被改變。如本領(lǐng)域所熟知的，抗體定位到癌細胞表達的多肽的能力是一種診斷疾病存在、疾病所處階段、發(fā)展和/或腫瘤侵襲性的方法。相比相應(yīng)的非惡性腫瘤組織，這種抗體也可檢測癌細胞內(nèi)該多肽分布的改變。PSCA多肽和免疫原性組合物也可用于了解疾病狀態(tài)中亞細胞蛋白定位的改變。細胞從正常狀態(tài)改變成疾病狀態(tài)會使細胞形態(tài)發(fā)生變化并通常與亞細胞單位定位/分布的變化有關(guān)。例如，以極化方式在正常細胞中表達的細胞膜蛋白質(zhì)在疾病中會改變，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)以非極性方式分布在整個細胞表面。已通過免疫組織化學(xué)方法用MUCl和Her2蛋白表達證實了疾病狀態(tài)中亞細胞蛋白定位改變的現(xiàn)象。正常的上皮細胞具有典型的MUCl的頂端分布，除此之外還有糖蛋白的核上定位，而在惡性腫瘤病病灶通常呈現(xiàn)非極性染色模式(Diaz等，TheBreastJournal,7；40-45(2001)；Zhang等，ClinicalCancerResearch,4；2669-2676(1998):Cao等，TheJournalofHistochemistryandCytochemistry，45:1547—1557(1997))。此夕卜，正常的乳腺上皮是Her2蛋白陰性的或僅顯示基底外側(cè)分布，而惡性T細胞可在整個細胞表面表達蛋白質(zhì)(DePotter等，InternationalJournalofCancer,44；969-974(1989)=McCormick等，117；935-943(2002)).或者，在疾病狀態(tài)中，蛋白質(zhì)的分布可從僅定位于表面變?yōu)榉稚⒌桨|(zhì)中。對MUCl可觀察到這樣的例子(Diaz等，TheBreastJournal,7:40-45(2001))。通過免疫組織化學(xué)方法檢測到的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位/分布的變化也為某些治療方法的可行性提供了重要信息。這最后一點可通過在正常組織中位于胞內(nèi)但在惡性細胞中出現(xiàn)在細胞表面的蛋白質(zhì)的情況來說明；細胞表面定位使得細胞可順利地用于基于抗體的診斷和治療方法。當PSCA發(fā)生蛋白質(zhì)定位改變時，PSCA蛋白和與其有關(guān)的免疫應(yīng)答是非常有用的。因此，確定MP4C12亞細胞蛋白定位是否發(fā)生變化的能力使PSCA蛋白和與其有關(guān)的免疫應(yīng)答非常有用。使用PSCA組合物使得精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠做出重要的診斷和治療決定。當PSCA多肽出現(xiàn)在正常情況下不產(chǎn)生PSCA的組織中時，特異于PSCA的免疫組織化學(xué)試劑對于檢測表達PSCA的腫瘤的轉(zhuǎn)移也是有用的。因此，PSCA多肽及其免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體可用于許多重要的方面，如精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的診斷、預(yù)后、預(yù)防和/或治療目的。就像熟練的技術(shù)人員將PSA多核苷酸片段和多核苷酸變體用于監(jiān)測PSA的方法一樣，PSCA多核苷酸片段和多核苷酸變體也可以類似方式使用。具體地說，用于監(jiān)測PSA方法的典型PSA多核苷酸是由PSAcDNA序列片段構(gòu)成的探針或引物。舉例來說，用來PCR擴增PSA多核苷酸的引物必需包含不完整的PSA序列以在聚合酶鏈式反應(yīng)中發(fā)揮作用。在這種PCR反應(yīng)中，熟練的技術(shù)人員通常產(chǎn)生許多不同的多核苷酸片段，這些片段可被用作引物以擴增感興趣的多核苷酸的不同部分或使擴增反應(yīng)最優(yōu)(見例如Caetano-Anolles，G.Biotechniques25(3):472-476,478-480(1998)；Robertson等，MethodsMol.Biol.98121-154(1998))。使用這種片段的另一個例子提供在題為“正常組織和患者標本內(nèi)PSCA的表達分析”的實施例中，其中將PSCA多核苷酸片段用作探針以顯示PSCARNA在癌細胞中的表達。此外，變體多核苷酸序列在PCR和Northern分析中通常被用作相應(yīng)mRNA的引物和探針(見例如Sawai等，F(xiàn)etalDiagn.Ther.199611-1211(6):407-13和FrederickΜ.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995))。多核苷酸片段和變體在這里是有用的，它們在高度嚴謹條件下能夠結(jié)合靶多核苷酸序列(例如圖1所示的PSCA多核苷酸或其變體)。此外，含有可被抗體或T細胞識別的表位的PSA多肽被用于監(jiān)測PSA的方法，其中所述抗體或T細胞特異性結(jié)合該表位。PSCA多肽片段和多肽類似物或變體也可以類似方式使用。這種用多肽片段或多肽變體產(chǎn)生抗體(如抗-PSA抗體或T細胞)在本領(lǐng)域的許多系統(tǒng)中是常見的，如技術(shù)人員使用的融合蛋白系統(tǒng)(見例如FrederickΜ.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995，第2卷第16單元)。文中，每個表位的功能是提供抗體或T細胞的反應(yīng)性結(jié)構(gòu)。通常，熟練的技術(shù)人員創(chuàng)建許多不同的多肽片段，這些片段可用來產(chǎn)生特異于感興趣多肽不同部分的免疫應(yīng)答(見例如美國專利5，840，501和美國專利5，939，533)。例如，可優(yōu)選使用含有這里所述的一種PSCA生物基序或帶有基序的子序列的多肽，這種子序列是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本領(lǐng)域已知序列容易鑒定的。多肽片段、變體或類似物在這里通常是有用的，只要它們含有能夠產(chǎn)生靶多肽序列(例如圖3所示的PSCA多肽)特異性抗體或T細胞的表位。如本文所示，PSCA多核苷酸和多肽(以及用來鑒定存在這些分子的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體或T細胞)具有特殊的性質(zhì)，這種特性使它們可用于診斷癌癥，如表I所列的癌癥。測量存在PSCA基因產(chǎn)物以評價這里所述疾病狀況(如前列腺癌)的出現(xiàn)或發(fā)生的診斷方法被用于鑒定患者以進行預(yù)防性檢測或進一步的監(jiān)測，就像已經(jīng)獲得成功的PSA那樣。此外，這些物質(zhì)滿足了本領(lǐng)域在一些情況下對具有與PSA類似或互補特性的小分子的需要，所述情況例如，僅根據(jù)PSA的測試不能明確診斷前列腺來源的轉(zhuǎn)移(見例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3):233-237(1996))，因此需要用PSCA多核苷酸和多肽(以及用來鑒定存在這些分子的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體)等物質(zhì)來證實前列腺來源的轉(zhuǎn)移。最后，除了它們在診斷檢測中的用途，這里所述的PSCA多核苷酸有許多其它用途，例如它們可用來鑒定PSCA基因染色體區(qū)域內(nèi)與致癌有關(guān)的染色體異常(見下文題為“PSCA的染色體繪圖”的實施例)。此外，除了用于診斷試驗外，這里所述的PSCA相關(guān)蛋白和多核苷酸有許多其它用途，，例如它們可用于法醫(yī)分析未知來源的組織(見例如TakahamaKForensicSciInt1996-6-28；80(1-2):63_9)。此外，本發(fā)明的PSCA相關(guān)蛋白或多核苷酸可用來治療以PSCA過度表達為特征的病理狀況。例如，圖1的氨基酸或核酸序列，或其片段，可用來產(chǎn)生針對PSCA抗原的免疫應(yīng)答?？捎门cPSCA反應(yīng)的抗體或其它分子來調(diào)節(jié)這種分子的功能，從而可提供治療益處。XII.)PSCA蛋白功能的抑制本發(fā)明包括各種抑制PSCA結(jié)合其結(jié)合伴侶或與其它蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián)的方法和組合物，以及抑制PSCA功能的方法。XII.A.)用胞內(nèi)抗體對PSCA進行的抑制一種方法中，編碼特異性結(jié)合PSCA的單鏈抗體的重組載體被通過基因傳遞技術(shù)引入PSCA表達細胞。因此，編碼的單鏈抗-PSCA抗體在胞內(nèi)表達，結(jié)合PSCA蛋白，并因此抑制其功能。工程改造這種胞內(nèi)單鏈抗體的方法是熟知的。這種胞內(nèi)抗體也稱為“胞內(nèi)抗體”，能特異性靶向細胞內(nèi)的特定區(qū)室，使治療的抑制作用基重在該區(qū)室。這種技術(shù)已成功用于本領(lǐng)域(參見例如Richardson和Marasco,1995，TIBTECH第13卷)。胞內(nèi)抗體事實上可消除高豐度細胞表面受體的表達(見例如Richardson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:3137-3141；Beerli等，1994，J.Biol.Chem.289:23931-23936；Deshane等，1994，GeneTher.1:332-337)。單鏈抗體包含通過可彎曲的接頭多肽連接的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，并作為單個多肽表達。任選地，單鏈抗體被作為與輕鏈恒定區(qū)結(jié)合的單鏈可變區(qū)片段表達。將熟知的胞內(nèi)運輸信號經(jīng)工程改造成編碼這種單鏈抗體的重組多核苷酸載體以使該胞內(nèi)抗體精確靶向所需胞內(nèi)區(qū)室。例如，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的胞內(nèi)抗體經(jīng)改造而加入前導(dǎo)肽和任選的C-末端ER保留信號肽(如KDEL氨基酸基序)。工程改造使其含有核定位信號因而使胞內(nèi)抗體在細胞核內(nèi)具有活性。使脂質(zhì)部分與胞內(nèi)抗體結(jié)合以將胞內(nèi)受體限制在質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)。胞內(nèi)抗體經(jīng)靶向也在胞質(zhì)溶膠中發(fā)揮作用。例如，使胞質(zhì)內(nèi)的胞內(nèi)抗體與胞質(zhì)溶膠內(nèi)的因子螯合，這樣可防止它們進入它們的天然細胞目標地點。在一個實施方案中，胞內(nèi)抗體被用來捕獲細胞核內(nèi)的PSCA，從而防止它在細胞核內(nèi)的活性。在這種PSCA胞內(nèi)抗體中加入核靶向信號以實現(xiàn)所需尋靶。可設(shè)計這種PSCA胞內(nèi)抗體來特異性結(jié)合特定的PSCA結(jié)構(gòu)域。另一實施方案中，特異性結(jié)合PSCA蛋白的胞質(zhì)胞內(nèi)抗體被用來防止PSCA與細胞核接觸，從而可防止它們在細胞核內(nèi)發(fā)揮任何生物活性(例如防止PSCA與其它因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體)。為具體指導(dǎo)這種胞內(nèi)受體在特定細胞內(nèi)表達，使胞內(nèi)受體在合適的腫瘤特異性啟動子和/或增強子的調(diào)控之下轉(zhuǎn)錄。為使胞內(nèi)受體在前列腺中特異性表達，可使用例如PSA啟動子和/或啟動子/增強子(見例如1999年7月6日發(fā)表的美國專利5，919，652)。XII.B.)用重組蛋白對PSCA進行抑制另一種方法中，重組分子結(jié)合PSCA并因此抑制PSCA的功能。例如，這些重組分子可防止或抑制PSCA接觸/結(jié)合其結(jié)合伴侶或與其它蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)。例如，這種重組分子可以含有PSCA特異性抗體分子的反應(yīng)性部分。在一具體實施方案中，PSCA結(jié)合伴侶的PSCA結(jié)合域經(jīng)工程改造到二聚融合蛋白中，因此該融合蛋白含有兩個與人IgG(如人IgGl)的Fc部分結(jié)合的PSCA配體結(jié)合域。這種IgG部分可含有，例如，CH2和CH3區(qū)域以及絞鏈區(qū)，但不含CHl區(qū)域。這種二聚融合蛋白可以可溶形式給予患有與PSCA表達有關(guān)的癌癥的患者，從而該二聚融合蛋白特異性結(jié)合PSCA并阻斷PSCA與結(jié)合伴侶相互作用。還可用已知的抗體結(jié)合技術(shù)使這種二聚融合蛋白組合成多聚蛋白。XII.C.)對PSCA轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制本發(fā)明還包括各種抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄的方法和組合物。類似地，本發(fā)明還提供了抑制PSCAmRNA翻譯成蛋白質(zhì)的方法和組合物?！N方法中，抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄的方法包括使PSCA基因接觸PSCA反義多核苷酸。另一種方法中，抑制PSCAmRNA翻譯的方法包括使PSCAmRNA接觸反義多核苷酸。另一個方法中，用PSCA特異性核酶來切割PSCA信使從而抑制翻譯。這種基于反義和核酶的方法也可針對PSCA基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，如PSCA啟動子和/或增強子元件。類似地，能夠抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)被用來抑制PSCAmRNA轉(zhuǎn)錄。在上述方法中有用的各種多核苷酸和組合物已經(jīng)在上文中描述。使用反義和核酶分子抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法是本領(lǐng)域熟知的。通過紊亂PSCA轉(zhuǎn)錄活性抑制PSCA轉(zhuǎn)錄的其它因子也可用來治療表達PSCA的癌癥。類似地，紊亂PSCA加工的因子也可用來治療表達PSCA的癌癥。使用這類因子的癌癥治療方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。XII.D.)治療方法的一般過程可用基因轉(zhuǎn)移和基因治療技術(shù)來輸送治療性多核苷酸分子到合成PSCA的腫瘤細胞(即反義、核酶、編碼胞內(nèi)抗體的多核苷酸和其它PSCA抑制分子)。本領(lǐng)域已知許多基因治療方法。也可用這種基因治療方法將編碼PSCA反義多核苷酸的重組載體、核酶、能夠紊亂PSCA轉(zhuǎn)錄的因子等輸送到靶腫瘤細胞。上述治療方法可與廣泛使用的手術(shù)、化療或放療方法聯(lián)合。本發(fā)明的治療方法能夠降低化療(或其它療法)的劑量和/或施用頻率，這對患者是有利的，尤其是對于那些無法良好耐受化學(xué)治療劑毒性的患者。特定組合物(例如反義、核酶、胞內(nèi)受體)或這些物質(zhì)組合的抗腫瘤活性可用各種體外和體內(nèi)測定系統(tǒng)進行評價。評價治療活性的體外測定包括細胞生長測定、軟瓊脂測定和其它指示腫瘤生長活性的試驗，結(jié)合測定能夠確定治療化合物將抑制PSCA與結(jié)合伴侶等結(jié)合的程度的結(jié)合試驗等?？稍诤线m的動物模型內(nèi)評價PSCA治療組合物的體內(nèi)效果。例如可使用異種前列腺癌模型，此模型中，人前列腺癌外植體或傳代的異種移植物組織被引入免疫能力低下的動物，如裸鼠或SCID小鼠(Klein等，1997，NatureMedicine3:402-408)。例如，PCT專利申請W098/166^和美國專利6，107，540描述了人前列腺癌的各種異種移植物模型，這些模型能夠說明原發(fā)性腫瘤的發(fā)展、微轉(zhuǎn)移和作為晚期疾病特征的成骨細胞轉(zhuǎn)移?？衫脺y定抑制腫瘤形成、腫瘤消退或轉(zhuǎn)移等預(yù)測其功效。評價促進凋亡的體內(nèi)試驗也可用來評價治療組合物。在一個實施方案中，可檢測用治療組合物處理的帶有腫瘤異種移植物的小鼠以了解相比未處理的帶有對照異種移植物的小鼠是否存在凋亡病灶。在經(jīng)過治療的小鼠的腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)的凋亡病灶說明了組合物的治療功效。用于上述方法的治療組合物可被配制成藥物組合物，該藥物組合物中含有適合所述輸送方法的載體。合適的載體包括當與治療組合物混合時保留治療組合物的抗腫瘤功能且通常不與患者的免疫原性發(fā)生反應(yīng)的任何物質(zhì)。其例子包括但不限于任何一種標準藥用載體，如無菌磷酸緩沖鹽水溶液、抑菌水等(通?？梢姟禦emington’sPharmaceuticalSciences))第16版，A.Osal.編，1980)。治療制劑可被溶解并通過任何能夠?qū)⒅委熃M合物輸送到腫瘤部位的途徑給藥。比較有效的給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、瘤內(nèi)、真皮內(nèi)、器官內(nèi)、正位等。優(yōu)選的靜脈注射制劑所含的該治療組合物可與防腐抑菌水、無菌非防腐水配成溶液或稀釋在注射用含有0.9%無菌氯化鈉的聚氯乙烯或聚乙烯袋中。治療性蛋白質(zhì)制品可被凍干并作為無菌粉末保存，優(yōu)選在真空下凍干，然后在注射之前用抑菌水(含有例如苯甲醇防腐劑)或無菌水重配。用上述方法治療癌癥的劑量和給藥方法可根據(jù)方法和靶癌癥不同而改變，且通常將取決于許多本領(lǐng)域已知的其它因素。XIII.)PSCA調(diào)節(jié)劑的鑒定、特征分析和用途鑒定和使用調(diào)節(jié)劑的方法在一個實施方案中，進行篩選以鑒定調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)或抑制特定表達模式、抑制或誘導(dǎo)特定途徑，優(yōu)選因此產(chǎn)生相關(guān)表型。另一實施方案中，已經(jīng)鑒定了對于具體情況重要的差別表達的基因；進行篩選以鑒定改變(提高或降低)個體基因表達的調(diào)節(jié)劑。另一實施方案中，進行篩選以鑒定改變差別表達基因表達產(chǎn)物的生物功能的調(diào)節(jié)劑。再者，已經(jīng)鑒定了基因在特定狀態(tài)中的重要性，進行篩選以鑒定結(jié)合和/或調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物生物活性的試劑。此外，篩選在對候選試劑應(yīng)答反應(yīng)中受誘導(dǎo)的基因。鑒定調(diào)節(jié)劑(抑制癌癥表達模式而產(chǎn)生正常表達模式的試劑，或能調(diào)節(jié)癌基因?qū)е略摶蛟谡＝M織中表達的調(diào)節(jié)劑)，然后進行篩選以鑒定在對該試劑的應(yīng)答反應(yīng)中受到特異性調(diào)節(jié)的基因。比較正常組織和用試劑處理的癌組織的表達模式可顯示在正常組織或癌組織內(nèi)不表達但在經(jīng)過試劑處理的組織內(nèi)表達的基因，或者反之亦然。用這里所述的用于癌癥基因或蛋白質(zhì)的方法鑒定和使用這些試劑特異性序列。具體地說，這些序列和它們編碼的蛋白質(zhì)被用來標記或鑒定試劑處理的細胞。此外，產(chǎn)生了抗試劑誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)的抗體并被用來使新的治療劑靶向被治療的癌癥組織樣品。與調(diào)節(jié)劑有關(guān)的鑒定和篩詵試驗與基因表汰有關(guān)的試騎本發(fā)明的蛋白質(zhì)、核酸和抗體被用于篩選試驗。與癌癥有關(guān)的蛋白質(zhì)、抗體、核酸、修飾的蛋白質(zhì)以及含有這些序列的細胞被用于篩選測定，例如評價藥物候選物對"基因表達模式”、多肽表達模式或改變生物功能的作用。在一個實施方案中，使用表達模式(優(yōu)選與高通量篩選技術(shù)結(jié)合)以在用候選試劑處理之后監(jiān)測基因表達模式(例如Davis，GF等，JBiolScreen7:69(2002)；Zlokarnikφ,Science279:84-8(1998)；Heid,GenomeRes6:986-94,1996)。癌蛋白、抗體、核酸、修飾的蛋白質(zhì)和含有天然或修飾癌蛋白或基因的細胞被用于篩選測定。即，本發(fā)明包括篩選調(diào)節(jié)癌癥表型或本發(fā)明的癌蛋白生理功能的方法。這可基因上完成或通過評價藥物候選物的“基因表達模式”或生物學(xué)功能而完成。在一個實施方案中，使用表達模式(優(yōu)選與高通量篩選技術(shù)結(jié)合)以在用候選試劑處理之后進行監(jiān)測，見Zlokamik,同上。進行了各種涉及本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)的試驗。測定可在個體核酸或蛋白質(zhì)水平進行。即，鑒定在癌癥中上調(diào)的特定基因之后可篩選測試化合物以了解調(diào)節(jié)基因表達或結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白的能力。“調(diào)節(jié)"在這里包括提高或降低基因表達。優(yōu)選的調(diào)節(jié)量將取決于正常組織與癌組織中基因表達的最初變化，其變化至少為10%，優(yōu)選50%，更優(yōu)選100-300%，且在一些實施方案中為300-1000%或更高。因此，如果正常組織相比某基因在癌組織中表達增加4倍，常需要降低約4倍；類似地，與正常組織相比在癌組織內(nèi)降低10倍，常需要測試化合物使其表達提高10倍。也可采用能惡化癌癥中基因表達的調(diào)節(jié)劑，例如，在進一步分析上調(diào)靶基因表達。用核酸探針和定量測定來監(jiān)測基因表達的量及基因表達水平，或者可監(jiān)測基因產(chǎn)物本身，例如通過使用癌蛋白的抗體和標準免疫試驗。也可用蛋白組學(xué)和分離技術(shù)來定量測定表達。通過監(jiān)測表達來鑒定修飾基因表達的化合物在一個實施方案中，同時對許多實體進行基因表達監(jiān)測，即監(jiān)測表達圖譜。這種圖譜通常包括一個或多個圖1所示的基因。該實施方案中，例如，使癌癥核酸探針結(jié)合到生物芯片上以檢測并量化特定細胞內(nèi)的癌癥序列。或者可采用PCR。因此可使用微量滴定板，其所需孔內(nèi)分散有引物。然后可進行PCR反應(yīng)并對每個孔進行分析。進行表達監(jiān)測以鑒定修飾一種或多種癌癥相關(guān)序列(如圖1所列的多核苷酸序66列)的表達的化合物。通常在分析之前在細胞中加入測試調(diào)節(jié)劑。此外，還進行篩選以鑒定調(diào)節(jié)癌癥、調(diào)節(jié)本發(fā)明的癌蛋白、結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白或紊亂本發(fā)明的癌蛋白與抗體或其結(jié)合伴侶結(jié)合的分子。在一個實施方案中，高通量篩選方法包括提供包含大量潛在治療化合物(候選化合物)的庫。然后在一個或多個測定中篩選這種"組合化學(xué)庫"以鑒定那些具有所需化學(xué)活性的庫成員(尤其是化學(xué)種類或亞類)。鑒定出的化合物可作為常規(guī)的"先導(dǎo)化合物"，如篩選用化合物，或作為治療劑。在某些實施方案中，篩選潛在調(diào)節(jié)劑組合文庫結(jié)合癌多肽的能力或調(diào)節(jié)活性。通常，通過鑒定具有一些所需特性或活性(例如抑制活性)的化合物(稱作“先導(dǎo)化合物”)、產(chǎn)生所述先導(dǎo)化合物的變體并評價這些變體化合物的特性和活性，可產(chǎn)生具有有用特性的新的化學(xué)實體。通常，高通量篩選(HTQ法被用于這種分析。如上所述，基因表達監(jiān)測通常被用來檢測候選調(diào)節(jié)劑(例如蛋白質(zhì)、核酸或小分子)。加入候選試劑并將細胞培養(yǎng)一段時間之后，含有待分析靶序列的樣品例如被加到生物芯片上。需要的話可用已知技術(shù)來制備靶序列。例如，用已知的裂解緩沖液、電穿孔等方法處理樣品以使細胞裂解，并純化和/或擴增，例如通過PCR。例如可用共價結(jié)合到核苷酸的標記物進行體外轉(zhuǎn)錄。核酸通常用生物素-FITC或PE或用cy3或cy5標記。靶序列可用熒光信號、化學(xué)發(fā)光信號、化學(xué)信號或放射性信號標記以便檢測與探針特異性結(jié)合的靶序列。標記也可以是酶，如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，當提供合適底物時可檢測這些酶產(chǎn)生的產(chǎn)物?；蛘撸瑯擞浭潜粯擞浀幕衔锘蛐》肿?，如酶抑制劑，它們與酶結(jié)合但不被酶催化或改變。標記也可以是例如表位標記或特異性結(jié)合鏈霉親和素的生物素。以生物素為例，如上所述標記鏈霉親和素，從而為結(jié)合的靶序列提供了可檢測的信號。未結(jié)合的標記鏈霉親和素通常在分析之前被除去。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，這些試驗可以是直接雜交測定或者是使用多個探針的“夾心試驗”，這種方法通常描述在美國專利5，681，702；5,597，909；5，545，730；5，594，117；5，591，584；5，571，670；5，580，731；5，571，670；5，591，584；5，624，802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5，124，246和5,681,697。該實施方案中，通常按上述方法制備靶核酸，然后在能夠形成雜交復(fù)合體的條件下將其加到含有許多核酸探針的生物芯片上。本發(fā)明采用了多種雜交條件，其中包括上述高、中和低嚴謹條件。通常在僅在靶存在時才能形成標記探針雜交復(fù)合體的嚴謹條件下進行測定?？赏ㄟ^改變熱力學(xué)可變的步驟參數(shù)來控制嚴謹性，其中包括但不限于溫度、甲酰胺濃度、鹽濃度、離液鹽濃度、PH、有機溶劑濃度等。也可用這些參數(shù)來控制非特異性結(jié)合，例如美國專利5，681，697所述。因此，在比較高的嚴謹條件下進行某些步驟以減少非特異性結(jié)合較為理想?？捎酶鞣N方法實現(xiàn)這里列出的反應(yīng)。反應(yīng)組分可同時或以不同順序依次加入，其優(yōu)選實施方案如下。此外，可在反應(yīng)物中加入許多其它試劑。這些試劑包括鹽、緩沖液、中性蛋白質(zhì)(如白蛋白)、去污劑等，它們將有利于優(yōu)化雜交和檢測，和/或減少非特異性或背景相互作用。需要的話也可使用能夠提高測定效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酶抑制劑、抗微生物劑等，這取決于樣品制備方法和靶的純度。分析檢測數(shù)據(jù)以確定各個基因的表達水平以及各種狀態(tài)之間表達水平的變化，從而形成基因表達圖譜。與牛物活件有關(guān)的測定本發(fā)明提供了鑒定或篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的癌癥相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的活性的化合物。該方法包括在含有本發(fā)明癌蛋白的細胞中加入上文定義的檢測化合物。所述細胞含有編碼本發(fā)明癌蛋白的重組核酸。另一實施方案中，在許多細胞上檢測候選試劑的庫。一方面，在存在或不存在生理信號，或者之前或之后暴露于生理信號的情況下進行測定，所述生理信號例如有激素、抗體、肽、抗原、細胞因子、生長因子、動作電位、藥劑(包括化療劑)、輻射、致癌物或其它細胞(即細胞-細胞接觸)。另一實施例中，在細胞周期的不同階段進行測定。用這種方法鑒定了調(diào)節(jié)本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)的化合物。具有藥理活性的化合物能夠增強或紊亂本發(fā)明的癌蛋白的活性。一旦被鑒定，可評估類似的結(jié)構(gòu)以便鑒定化合物的決定性結(jié)構(gòu)特征。在一個實施方案中，提供了調(diào)節(jié)(例如抑制)癌細胞分裂的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。另一實施方案中，提供了調(diào)節(jié)(例如抑制)癌癥的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。再在其它實施方案中，提供了處理癌細胞或患有癌癥的個體的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，提供了調(diào)節(jié)表達本發(fā)明基因的細胞的狀態(tài)的方法。這里所述的狀態(tài)包括本領(lǐng)域接受的參數(shù)，如細胞的生長、增殖、存活力、功能、凋亡、老化、定位、酶活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在一個實施方案中，癌癥抑制劑是上述抗體。另一實施方案中，癌癥抑制劑是反義分子。如本文所述，各種測定細胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的方法是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。通過高通量篩選鑒定調(diào)節(jié)劑鑒定合適調(diào)節(jié)劑的試驗包括高通量篩選。優(yōu)選的試驗?zāi)軌驒z測癌基因轉(zhuǎn)錄的增強或抑制、多肽表達的增強或抑制、以及多肽活性的抑制或增強。在一個實施方案中，高通量篩選法鑒定的調(diào)節(jié)劑是蛋白質(zhì)，通常是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的片段。因此，例如可使用含有蛋白質(zhì)的細胞提取物或蛋白質(zhì)性細胞提取物的隨機或定向消化物。通過這種方法制得了在本發(fā)明方法中用來進行篩選的蛋白質(zhì)文庫。在該實施方案中，特別優(yōu)選的是細菌、真菌、病毒和哺乳動物蛋白質(zhì)文庫，優(yōu)選哺乳動物蛋白質(zhì)文庫，尤其是人蛋白質(zhì)文庫。特別有用的測試化合物將被定向到靶所屬蛋白質(zhì)種類，例如酶和底物，或者配體和受體。京H旨牛長禾Π集落形成來鑒定禾ΠΦ寺征分析i周節(jié)齊Π正常細胞需要固體基質(zhì)以附著和生長。當細胞被轉(zhuǎn)化后便喪失了這種表型并可離開基質(zhì)生長。例如，轉(zhuǎn)化的細胞可生長在攪拌的懸浮培養(yǎng)物中或懸浮在半固體培養(yǎng)基(例如半固體瓊脂或軟瓊脂)中。當用腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化的細胞時，它們可恢復(fù)正常表型并又需要固體基質(zhì)以便附著和生長。在檢測中用軟瓊脂生長或集落形成來鑒定癌癥序列的調(diào)節(jié)劑，當該序列在宿主細胞內(nèi)表達時可抑制異常細胞增殖和轉(zhuǎn)化。調(diào)節(jié)劑可降低或消除宿主細胞在固體或半固體培養(yǎng)基(如瓊脂)中懸浮生長的能力。懸浮測定中的軟瓊脂生長或集落形成技術(shù)描述在Freshney的《動物細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊》(CultureofAnimalCellsaManualofBasic^Technique)(第三版，1994)。也可參見Garkavtsev等(1996，同上)一書的方法部分。68i平雜姊棘限吿丨隱斜口紐俯··正常細胞在細胞培養(yǎng)物中通常以平鋪且有組織的模式生長，直到它們接觸其它細胞。當細胞接觸其它細胞時它們會接觸抑制并停止生長。然而，轉(zhuǎn)化的細胞不會接觸抑制并在紊亂的病灶內(nèi)繼續(xù)生長至高密度。因此，相比正常細胞，轉(zhuǎn)化的細胞生長至較高的飽和密度。這可通過在病灶中形成無序的細胞單層細胞從形態(tài)上加以鑒定。或者可用飽和密度時(3H)-胸腺嘧啶的標記指數(shù)來測定生長密度限制，類似地，MTT或Alamar藍檢測將顯示細胞的增殖能力以及調(diào)節(jié)劑影響增殖的能力。見Freshney，(1994)，同上。轉(zhuǎn)化的細胞當被腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)染時可恢復(fù)正常表型，受到接觸抑制并生長至較低密度。該檢測中，飽和密度時(3H)-胸腺嘧啶的標記指數(shù)是優(yōu)選的測量生長密度限制的方法。用癌癥相關(guān)序列轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化的宿主細胞并使其在非限制培養(yǎng)條件下在飽和密度生長M小時。通過每分鐘摻入的數(shù)量來確定(3H)-胸腺嘧啶標記的細胞的百分比。用接觸不限制的生長來鑒定癌癥序列的調(diào)節(jié)劑，所述序列以及導(dǎo)致異常細胞增殖和轉(zhuǎn)化。調(diào)節(jié)劑可降低或消除接觸不限制的生長并使細胞回到正常表型。荊介姊附或血磁謝?！ば笨诩~俯··轉(zhuǎn)化的細胞相比相對應(yīng)的正常細胞具有較低的血清依賴性(見例如Temin，J.Natl.CancerInst.37:167-175(1966)；Eagle等，J.Exp.Med131:836-879(1970))；Freshney，同上。這部分是由于轉(zhuǎn)化的細胞會釋放各種生長因子?？蓪⑥D(zhuǎn)化的宿主細胞的生長因子或血清依賴性程度與對照細胞相比較。例如，在方法中監(jiān)測細胞的生長因子或血清依賴性以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)本發(fā)明癌癥相關(guān)序列的化合物。#用腫瘤Φ寺異+牛標記的7k平來鑒定禾ΠΦ寺征分析i周節(jié)齊Π腫瘤細胞釋放的某些因子(以后稱為“腫瘤特異性標記”)的量高于相對應(yīng)的正常細胞。例如，人膠質(zhì)瘤以高于正常腦細胞的水平釋放纖溶酶原激活劑(PA)(見例如Gullino，“血管生成、腫瘤血管形成和腫瘤生長的潛在紊亂”(Angiogenesis，TumorVascularization,andPotentialInterferencewithTumorGrowth),弓丨自《癌癥中的生物應(yīng)答》(BiologialResponsesinCancer)—書第178-184頁(Mihich編，1985))。類似地，腫瘤細胞也以高于相對應(yīng)的正常細胞的水平釋放腫瘤血管形成因子(TAF)。見例如Folkman，《血管生成禾口癌癥》(AngiogenesisandCancer),SemCancerBiol.(1992))，而內(nèi)皮瘤釋放bFGF(Ensoli，B等)。測量這些因子的釋放的各種技術(shù)描述在Freshney(1994)，同上。也可參見Unkless等，J.Biol.Chem.249:4295-4305(1974)；Strickland&Beers,J.Biol.Chem.2515694-5702(1976)；Whur等，Br.J.Cancer42:305312(1980)；Gullino，“血管生成、腫瘤血管形成和腫瘤生長的潛在紊亂”，引自《癌癥中的生物應(yīng)答》一書第178-184頁(Mihich編，1985)；Freshney,AnticancerRes.5:111-130(1985)。例如，可在方法中監(jiān)測腫瘤特異性標記的水平以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)本發(fā)明癌癥相關(guān)序列的化合物。通過對基質(zhì)膠的侵襲來鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑可將侵入基質(zhì)膠的程度或胞外基質(zhì)成分用于鑒定和特征分析能調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)序列的化合物的試驗。腫瘤細胞在惡變和侵入基質(zhì)膠或其它胞外基質(zhì)成分之間顯示為正相關(guān)。在該測定中通常將腫瘤發(fā)生細胞作為宿主細胞。腫瘤抑制基因在這些宿主細胞內(nèi)表達將降低對宿主細胞的侵入性。可使用以下文獻中描述的技術(shù)=CancerRes.1999；59:6010；Freshney(1994)，同上。簡言之，可用涂有基質(zhì)膠或其它胞外基質(zhì)成分的濾器來測量對宿主細胞的侵入水平。侵入凝膠或穿過濾器的遠側(cè)被評定為侵襲力，并通過細胞數(shù)和移動距離或通過用1251預(yù)先標記細胞然后對濾器的遠側(cè)或平皿底部進行放射性計數(shù)來進行組織學(xué)評價。見例如Freshney(1984)，同上。評定體內(nèi)腫瘤牛長以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑在轉(zhuǎn)基因生物或免疫抑制生物內(nèi)檢測癌癥相關(guān)序列對細胞生長的作用。轉(zhuǎn)基因生物用各種本領(lǐng)域可接受的方法制備。例如可制造敲除轉(zhuǎn)基因生物，例如小鼠等哺乳動物，其中的癌基因被破壞或在其中插入癌基因。通過同源重組在小鼠基因組的內(nèi)源癌癥基因位點插入標記基因或其它異源基因從而制造出敲除轉(zhuǎn)基因小鼠。也可用突變的癌基因取代內(nèi)源癌基因，或使內(nèi)源癌基因突變(例如通過本領(lǐng)域致癌物)來制造這種小鼠。為制造轉(zhuǎn)基因嵌合動物(如小鼠)，可將DNA構(gòu)建物引入胚胎干細胞的細胞核。具有新構(gòu)建的遺傳缺陷的細胞被注射入宿主小鼠胚胎，并將該胚胎重新植入雌性受體。其中一些胚胎發(fā)展成嵌合小鼠，這些小鼠的一些生殖細胞源自突變細胞系。因此，通過飼養(yǎng)這種嵌合小鼠能夠獲得含有引入的遺傳缺陷的新小鼠品系(見例如Capecchi等，Science244:1^8(1989))?？捎靡韵路椒ǐ@得嵌合小鼠2002年4月2日發(fā)表的美國專利6，365，797；2000年8月22日發(fā)表的美國專利6，107，540；Hogan等，《小鼠胚胎操作實驗室手冊》(ManipulatingtheMouseEmbryo:AlaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory(1988)以及Robertson編寫的《畸胎癌和胚胎干細胞實際進展》，IRLPress,Washington,D.C.，(1987)。或者可使用各種免疫抑制或免疫缺陷宿主動物。例如，通過基因方法獲得的無胸腺“裸”鼠(見例如Giovanella等，J.Natl.CancerInst.52:921(1974))、SCID小鼠、胸腺切除小鼠或照射小鼠(見例如Bradley等，Br.J.Cancer38:263(1978)；Selby等，Br.J.Cancer41:52(1980))可被用作宿主。注射入同基因宿主的可移植的腫瘤細胞(通常約106細胞)以高比例產(chǎn)生侵入性腫瘤，而類似來源的正常細胞則不會這樣。在發(fā)展了侵入性腫瘤的宿主中皮下或正位注射表達腫瘤相關(guān)序列的細胞。然后將小鼠分成對照組和治療實驗組(例如用調(diào)節(jié)劑治療)。合適時間后，優(yōu)選4-8周，測量腫瘤生長(例如通過體積或通過其兩個最大尺寸，或重量)并與對照進行比較。統(tǒng)計學(xué)上顯著減少的腫瘤(采用例如斯氏T檢驗)被認為生長受到抑制。鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑的體外檢測可在體外進行檢測以鑒定具有調(diào)節(jié)活性的化合物。例如，使癌癥多肽首先接觸潛在的調(diào)節(jié)劑，然后培養(yǎng)合適的時間，例如0.5-48小時。在一個實施方案中，通過測量蛋白質(zhì)或mRNA水平在體外確定癌癥多肽水平。蛋白質(zhì)水平采用免疫測定(例如Western印跡、ELISA等)用選擇性結(jié)合癌癥多肽或其片段的抗體來測量。為測量mRNA，優(yōu)選用擴增檢測(例如用PCR、LCR)或雜交檢測(例如Northern雜交、RNA酶保護、斑點印跡)。用直接或剪接標記的檢測試劑檢測蛋白質(zhì)或mRNA的水平，所述檢測試劑如上所述例如熒光標記或放射性標記的核酸、放射性標記或酶標記的抗體等?；蛘?，可用操作性連接于螢光素酶、綠色熒光蛋白、CAT或P-gal等報告基因的癌蛋白啟動子來設(shè)計報告基因系統(tǒng)。報告基因構(gòu)建物通常被轉(zhuǎn)染到細胞中。用潛在的調(diào)節(jié)劑處理之后，用精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標準計數(shù)來測量報告基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性量70(DavisGF,同上；Gonzalez,J.&Negulescu,P.Curr.Opin.Biotechnol.1998:9:624)。如上所述，對各個基因和基因產(chǎn)物進行體外篩選。這就是說，在鑒定出在特定狀態(tài)重要的差異性表達的特定基因之后對表達該基因或其基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑進行篩選。在一個實施方案中，篩選表達特定基因的調(diào)節(jié)劑。通常只評價一個或幾個基因的表達。另一實施方案中，篩選被設(shè)計成首先尋找結(jié)合差別表達的蛋白質(zhì)的化合物。然后評價這些化合物調(diào)節(jié)差異性表達活性的能力。此外，一旦鑒定了最初的候選化合物，可進一步篩選其變體以更好地評價結(jié)構(gòu)活性關(guān)系。鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑的結(jié)合檢測在本發(fā)明的結(jié)合檢測中通常使用純化或分離的本發(fā)明的基因產(chǎn)物。例如，產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體，進行免疫測定以確定該蛋白質(zhì)的量和/或定位。或者，含有癌蛋白的細胞可用于該測定。因此，所述方法包括使本發(fā)明的癌蛋白結(jié)合候選化合物(如配體)，并確定該化合物與本發(fā)明的癌蛋白的結(jié)合。優(yōu)選的實施方案使用人癌蛋白；也可建立并使用人類疾病的動物模型。同時，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可使用其它類似的哺乳動物蛋白質(zhì)。此外，一些實施方案使用了變體或衍生的癌蛋白。通常，本發(fā)明的癌蛋白或配體非擴散性地結(jié)合不溶性支持物。例如，所述支持物可以含有獨立的樣品接受區(qū)(微量滴定板、陣列等)。不溶性支持物可用任何組合物制成，它可結(jié)合所述組合物，易于從可溶性物質(zhì)中分離，或者與整個篩選方法相容。這種支持物的表面可以是固體或是多孔的，并具有任何方便操作的形狀。合適的不溶性支持物的例子包括微量滴定板、陣列、膜和珠。它們通常由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝酸纖維素或Teflon等制成。微量滴定板和陣列尤其方便，因為可用小量試劑和樣品同時進行大量測定。對組合物和支持物的具體結(jié)合方法沒有規(guī)定，只要它與本發(fā)明的試劑和方法相容、保持組合物的活性且不可擴散即可。優(yōu)選的結(jié)合方法包括使用抗體，當該抗體將蛋白質(zhì)結(jié)合到支持物時對配體結(jié)合位點或活化序列都不造成空間阻遏；直接結(jié)合到“粘性”或離子支持物；化學(xué)交聯(lián)；在表面合成蛋白質(zhì)或試劑等。蛋白質(zhì)或配體/結(jié)合劑與支持物結(jié)合之后通過洗滌除去過量的未結(jié)合的物質(zhì)。然后與牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它無關(guān)蛋白質(zhì)或其它化學(xué)分子一起培育以封閉樣品接受區(qū)。一旦本發(fā)明的癌蛋白與支持物結(jié)合，便可加入檢測化合物進行測定?；蛘呤购蜻x結(jié)合劑結(jié)合支持物然后加入本發(fā)明的癌蛋白。結(jié)合劑包括特異性抗體、通過篩選化學(xué)文庫鑒定的非天然結(jié)合劑、肽類似物等。特別感興趣的是鑒定對人類細胞具有低毒性的試劑。出于該目的可使用許多檢測方法，其中包括增殖分析、cAMP分析、標記的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合體外檢測、電泳遷移率變動分析、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測定、功能分析(磷酸化作用分析等)，等等?？捎迷S多方法來測定檢測化合物(配體、結(jié)合劑、調(diào)節(jié)劑等)與本發(fā)明的癌蛋白的結(jié)合。檢測化合物可被標記，并可直接確定結(jié)合作用，例如將全部或部分本發(fā)明的癌蛋白加到固體支持物、加入標記的候選化合物(例如熒光素標記)、洗去過量試劑并確定固體支持物上是否存在標記。需要的話可使用不同的封閉和洗滌步驟。在某些實施方案中，只有一種組分被標記，例如標記本發(fā)明的蛋白質(zhì)或配體?；蛘哂貌煌臉擞浳飿擞浂鄠€組分，例如用1125標記蛋白質(zhì)并用熒光團標記化合物。鄰近試劑71(proximityreagent)，例如淬滅劑或能量轉(zhuǎn)移劑，也是有用的。競爭件結(jié)合以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑在一個實施方案中，通過與“競爭物”的競爭性結(jié)合實驗確定“檢測化合物”的結(jié)合。競爭物是結(jié)合靶分子(例如本發(fā)明的癌蛋白)的結(jié)合部分。競爭物包括抗體、肽、結(jié)合伴侶、配體等之類的化合物。某些情況下，競爭物代替檢測化合物競爭性結(jié)合。在一個實施方案中，檢測化合物被標記?？稍诘鞍踪|(zhì)中加入檢測化合物或競爭物或這兩者，并放置足夠進行結(jié)合的時間。在使活性最強的溫度(通常在4-40°C之間)下進行培育。培育時間通常被最優(yōu)化，例如以有利于迅速高通量篩選；通常0-1小時就足夠了。過量的試劑通常被除去或洗去。然后加入第二組分，之后加入或不加入指示結(jié)合的標記的組分。在一個實施方案中，先加入競爭物，然后再加入檢測化合物。競爭物被置換說明檢測化合物結(jié)合癌蛋白，因此能夠結(jié)合并有可能調(diào)節(jié)癌蛋白的活性。該實施方案中，任一組分可被標記。因此，例如，如果競爭物被標記，檢測后化合物的洗滌液中存在標記說明競爭物被檢測化合物置換?；蛘?，如果檢測化合物被標記，則支持物上存在標記說明被置換。在另一個實施方案中，首先加入檢測化合物，培育并洗滌，然后加入競爭物。競爭物未結(jié)合說明該檢測化合物結(jié)合癌蛋白的親和力高于競爭物。因此，如果檢測化合物被標記，則支持物上存在標記競爭物未能結(jié)合說明檢測化合物能結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白從而可能調(diào)節(jié)癌蛋白。因此，競爭性結(jié)合法包括差異性篩選以鑒定能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明癌蛋白活性的試劑。在該實施方案中，所述方法包括使癌蛋白與第一樣品內(nèi)的競爭物結(jié)合。第二樣品含有檢測化合物、癌蛋白和競爭物。確定兩個樣品競爭物的結(jié)合，兩個樣品之間結(jié)合情況的改變或不同說明存在能夠結(jié)合癌蛋白并有可能調(diào)節(jié)其活性的試劑。這就是說，如果第二樣品內(nèi)競爭物的結(jié)合不同于第一樣品，則該試劑能夠結(jié)合癌蛋白。或者，用差異性篩選來鑒定結(jié)合天然癌蛋白但不能結(jié)合修飾的癌蛋白的藥物候選物。例如，確定癌蛋白的結(jié)構(gòu)并將其用于合理的藥物設(shè)計，從而合成與該位點相互作用的試劑以及通常不結(jié)合位點修飾的蛋白質(zhì)的試劑。此外，還通過篩選藥物增強或降低這種蛋白質(zhì)活性的能力而鑒定了影響天然癌蛋白活性的藥物候選物。分析中也可使用陽性對照和陰性對照。對照樣品和測試樣品宜進行至少三次以獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著的結(jié)果。將所有樣品培育足以使試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合的時間。培育之后洗滌樣品以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)并確定結(jié)合的且通常是標記的試劑的量。例如，當使用放射性標記時，樣品可在閃爍計數(shù)器內(nèi)計數(shù)以確定結(jié)合的化合物的量。篩選分析中也可使用其它試劑。這些試劑包括鹽、中性蛋白質(zhì)(例如白蛋白)、去污劑等，使用它們將有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)最佳結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用。也可使用能夠提高測定效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酶抑制劑、抗微生物劑等。以一定順序加入各組分的混合物以提供需要的結(jié)合。itm^m^m^nmmm^m^sajir如WO91/04753所述，通過形成與配體結(jié)合分子的綴合物可將癌癥的多核苷酸調(diào)節(jié)劑引入含有靶核苷酸序列的細胞。合適的配體結(jié)合分子包括但不限于細胞表面受體、生長因子、其它細胞因子或結(jié)合細胞表面受體的其它配體。優(yōu)選配體結(jié)合分子的結(jié)合基本上不會影響配體結(jié)合分子結(jié)合其相應(yīng)分子或受體、或者阻止正義或反義寡核苷酸或其結(jié)合形式進入細胞的能力?；蛘?，癌癥的多核苷酸調(diào)節(jié)劑可被引入含有靶核酸序列的細胞，例如通過形成多核苷酸-脂質(zhì)復(fù)合體，如WO90/10448所述。除治療方法外，在上述篩選方法中也可使用反義分子或敲除及敲入模型。抑制件和反義核苷酸在某些實施方案中，通過使用反義多核苷酸或抑制性核內(nèi)小RNA(snRNA)，即與mRNA編碼核酸序列(例如本發(fā)明的癌蛋白)、mRNA或其子序列互補并且可較佳地與它們特異性雜交的核酸，下調(diào)或完全抑制癌癥相關(guān)蛋白的活性。反義多核苷酸與mRNA結(jié)合降低了mRNA翻譯和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，反義多核苷酸可包括天然產(chǎn)生的核苷酸或由天然產(chǎn)生的亞單位或其密切同系物形成的合成種類。反義多核苷酸也可含有改變的糖部分或糖內(nèi)連接。其例子有硫代磷酸酯以及其它含有硫的種類，已知它們都可用于本領(lǐng)域。只要類似物可與本發(fā)明的核苷酸有效雜交即包含在本發(fā)明之內(nèi)。見例如IsisPharmaceuticals,Carlsbad,CA；Sequitor,Inc.,Natick,ΜΑ。這種反義多核苷酸可以用重組方法方便地合成，或者可以在體外合成。一些廠商出售這種合成設(shè)備，其中包括AppliedBiosystems0制備其它寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的方法也是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這里使用的反義分子包括包括反義或正義寡核苷酸。例如，可用正義寡核苷酸與反義鏈的結(jié)合而阻斷轉(zhuǎn)錄。反義和正義寡核苷酸包括能夠結(jié)合癌癥分子靶mRNA(正義)或DNA(反義)序列的單鏈核酸序列(RNA或DNA)。本發(fā)明所述的反義或正義寡核苷酸包括通常含有至少約12個核苷酸，優(yōu)選含有約12-30個核苷酸的片段。從編碼指定蛋白質(zhì)的cDNA序列產(chǎn)生反義或正義寡核苷酸的能力描述在，例如，Stein&Cohen(CancerRes.48:26591988)和vanderKrol等(BioTechniques6:958(1988))。除反義多核苷酸，可用核酶來尋靶和抑制癌癥相關(guān)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。核酶是能催化性切斷其它RNA分子的RNA分子。已經(jīng)描述過不同種類的核酶，其中包括I組核酶、錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、核糖核酸酶P和斧頭狀核酶(可參見例如Castanotto等，Adv.inPharmacology25:289-317(1994)以對不同核酶的特性有大致了解)。發(fā)夾核酶的一般特性描述在，例如，Hampel等，Nucl.AcidsRes.18299-304(1990)；歐洲專利發(fā)明者A·B·萊塔諾,A·雅各波維茨,H·邵,J·古達斯,K·J·M·莫里森,P·M·查利塔-埃德,R·K·莫里森,X·賈申請人:艾更斯司股份有限公司